微囊化重组CHO细胞制备和培养条件的优化

微囊化重组基因细胞移植治疗肿瘤是一种新兴的肿瘤基因治疗方法,然而由于目前微囊化细胞规模化制备和培养技术还不成熟,阻碍了其在临床治疗中的推广与应用。以重组CHO细胞为模型,考察了不同的微囊制备和培养条件对微囊化细胞生长和内皮抑素表达的影响。实验表明,种子细胞所处的生长阶段和细胞接种密度对微囊化细胞生长和内皮抑素表达的影响较大,对数生长期的细胞进行包囊并且细胞接种密度为1×106~2×106cells/mL微囊时微囊内细胞生长良好、内皮抑素表达量高。微囊制备时间对细胞活性和内皮抑素表达也有较大的影响,制备时间延长对细胞的损伤增大,因此制备时间应控制在5h以内。生物微胶囊在制备过程中会造成细胞损伤,而体外培养是恢复细胞活性的良好方法,在培养过程中微囊接种量为5%时对细胞生长和内皮抑素表达有利。     

基于海藻酸钠羟基改性的MPEG原位共价修饰微胶囊及抗蛋白性能

目的:通过对海藻酸钠链段羟基位点改性制备甲氧基聚乙二醇(MPEG)原位共价修饰的海藻酸钠/壳聚糖(AC)微胶囊,在保证MPEG修饰微胶囊机械强度不受影响的基础上,有效提高表面MPEG修饰密度,实现兼具良好机械稳定性及抗蛋白性能的微胶囊制备方法。方法:利用溴化氰对海藻酸钠羟基进行活化并将末端氨基的点击化学linker(BAT)接枝在主链上进而制备MPEG原位共价修饰微囊A_(B(OH))CP_N,用球磨法表征微囊机械强度,用Ig G和Fgn为模型考察微囊表面抗蛋白吸附性能,以L929细胞在其二维模拟平板膜上的黏附情况作为衡量指标,考察MPEG修饰微胶囊表面细胞粘附情况,并最终通过体内移植考察MPEG修饰微囊的生物相容性。结果:基于海藻酸钠羟基位点的MPEG原位共价修饰微胶囊能够实现与常规条件制备的微胶囊接近的机械强度;同时与对照组相比Ig G吸附量降低87.4%,Fgn吸附量降低75.5%,实现了良好的抗蛋白吸附性能;二维模拟平板膜表面L929细胞粘附情况显著改善,细胞粘附数与对照组相比降低了76.9%;体内移植结果证明MPEG修饰微囊细胞粘附极少,微囊与纤维层分离明显。结论:基于海藻酸钠羟基位点的MPEG原位修饰能够实现兼具良好机械稳定性及抗蛋白吸附性能的微胶囊。     

《生物膜》第三十四章微胶囊膜的生物学功能研究

微胶囊是利用天然或合成的高分子材料对固体、液体或气体进行包封的、粒径5～1000μm的中空微囊．制备微胶囊的过程称为微囊化．微囊化技术的主要特点是改变活性物质的理化性质(相态,溶解度等);保护物质免受环境条件的影响;屏蔽味道、颜色和气味;降低物质毒性;控制释放活性物质等等．     

表达内皮抑素的rCHO细胞的微囊化培养

微囊化重组基因细胞移植治疗肿瘤是一种新兴的肿瘤基因治疗方法,如果将此技术应用到临床研究,就需要制备大量的细胞活性良好、重组蛋白表达量高的生物微胶囊。种子细胞是生物微胶囊治疗作用的执行者, 是构建微囊微反应器的基本元素。如何获得大量高活性的种子细胞已经成为规模化制备生物微胶囊所面临的最关键的限制因素。本实验考察了搅拌式生物反应器内扩增的重组CHO细胞进行包囊及微囊化细胞在生物反应器内规模化培养的可行性。实验结果显示:重组CHO细胞在生物反应器内可以快速生长,并且对数期细胞包囊,微囊化细胞活性良好。制备的微囊化细胞可以在生物反应器内培养,与培养板培养比较细胞生长较快、内皮抑素表达量较高。应用生物反应器培养技术能够在体外快速、大量扩增重组CHO细胞,满足微囊化细胞制备对种子细胞量与质的要求,微囊化细胞可以在生物反应器内培养。     

体外培养和冷冻保存对微囊化细胞生长和内皮抑素表达的影响

微囊化基因工程细胞移植治疗肿瘤是一种新兴的肿瘤治疗方法,如果将此技术应用到临床研究,就需要制备大量的细胞活性良好、重组蛋白表达量高的生物微胶囊。体外培养和冷冻保存是生物微胶囊制备过程中两个重要的环节,因此需要考察体外培养和冷冻保存对微囊化重组基因细胞生长和蛋白表达的影响。以重组CHO细胞为模型,考察了体外培养时间和冷冻保存对微囊化细胞在动物体内生长和内皮抑素表达的影响及体外培养时间对微囊化细胞冷冻保存的影响。结果表明:体外培养时间对微囊化细胞在动物体内生长、内皮抑素表达和微囊稳定性具有较大的影响,体外不培养和培养4d的微囊化细胞在小鼠腹腔内生长良好、内皮抑素表达量高,并且微囊稳定性好,而体外培养8d的微囊化细胞在移植后的第26天破裂。体外培养时间对微囊化细胞冷冻保存也具有较大的影响,体外培养4d和8d的微囊化细胞在液氮中冷冻保存40d,复苏后细胞生长良好、内皮抑素表达量高,而冻存前未经过体外培养的微囊化细胞,复苏后细胞几乎全部死亡。综上所述,生物微胶囊在体外比较适宜的培养时间为4d。并且冷冻保存对微囊化细胞在动物体内生长、内皮抑素表达和微囊稳定性没有显著的影响。     

克雷伯氏杆菌的固定化及其在微胶囊中生长状况的研究

采用注滴法制备载克雷伯氏杆菌的海藻酸盐微胶囊,对微胶囊制备条件进行优化,并考察了各种因素对克雷伯氏杆菌微囊化的影响。实验结果表明：控制海藻酸钠溶液的质量分数为2%、氯化钙溶液的质量分数为4.5%、凝胶反应4 h以及菌体与海藻酸钠溶液体积比为1：30,所制备的微胶囊及微囊内菌体的生长效果最好。还初步探讨了壳聚糖对海藻酸盐微胶囊的影响,发现微胶囊表面复合一层壳聚糖半透膜,可以提高微胶囊的强度,但弹性有所降低。另外进行了微胶囊中克雷伯氏菌代谢途径的探索。     

微囊化杂交瘤细胞培养的基础应用研究

本文探讨了海藻酸钠的结构组分对微囊强度的重要作用。提出了微囊化批量生产中估算活细胞的方法以及影响满囊比的主要因素等a制备微囊的成功率达到95％以上,满载率可达95％。微囊化杂交瘤细胞在静态培养6—10天后,细胞浓度为8．8×10⁶～2．1×10⁷ceIl／ml微囊。单抗浓度为379μg／m1微囊。微囊化产物经SDS电泳呈现一条或两条蛋白带,表明单抗纯度较高。     

微囊化不可繁殖型尿酸氧化酶工程菌的制备

目的：制备微囊化不可繁殖型尿酸氧化酶工程菌,以期研制一种降低血尿酸的口服药物,用于治疗高尿酸血症及痛风。方法：用甲醛灭活尿酸氧化酶工程菌,使其不可繁殖并保持酶活性;以壳聚糖和海藻酸钠为囊材,采用气流喷雾法制备微囊;用试剂盒体外评价微囊降解尿酸的效果。结果：经甲醛灭活后,工程菌繁殖活性丧失,其降解尿酸的能力降低85%;制备的微囊粒径呈正态分布于20～220μm,包封率达到99%以上;体外试验表明其具有降尿酸活性。结论：获得了具有降解尿酸活性的微囊化不可繁殖型工程菌。     

微囊化干细胞及其应用研究进展

干细胞极强的自我更新能力和多向分化潜能使其可以成为绝佳的种子细胞来源,用于各种疑难疾病的治疗。微胶囊不仅可以为细胞提供三维生长微环境,而且具有良好的免疫隔离性能和生物相容性。微囊化干细胞技术为干细胞大规模、高活性体外培养及长期保存提供了新的技术支持,为细胞移植疗法开辟了新途径。以下首先简述了微囊化技术的发展情况,然后介绍了目前用于微囊化干细胞的材料、制备方法及其免疫隔离作用,重点阐述了近年来微囊化各种不同类型干细胞的研究和应用进展。最后,提出目前微胶囊化干细胞的问题所在并对此技术进行展望。     

微囊化胰岛B细胞系体外生长和分泌功能的研究

目的：研究海藻酸钠－多聚赖氨酸－海澡酸钠（APA）微囊化胰岛B细胞系BTC6－F7的生长和分泌规律,探索其作为生物人工胰岛的可能性。方法：以微囊静电液滴发生器制作APA微囊化BTC6－F7细胞,体外培养并定期测定微囊化细胞的生长和胰岛素分泌。结果：在实验观察的90d内,BTC6－F7细胞可在微囊内以细胞团的形式生长、存活。囊内细胞总数随培养时间的延长而增加,但细胞活率呈下降趋势,胰岛素分泌与囊内活细胞数的变化规律一致,最初呈上升趋势,然后较长时间维持在相对恒定的水平。结论：本研究所制备的APA微囊化胰岛B细胞可在较长时间内保持生长、存活和分泌功能,为进一步发展生物型人工胰岛奠定了基础,并可用于糖尿病的发病机理和治疗研究。