小麦TaHDA19基因的克隆及胁迫表达分析

利用基因克隆技术从小麦（Triticum aestivum L.）品种‘科农199’中扩增得到一个RPD3/HDA1型组蛋白去乙酰化酶基因TaHDA19,采用生物信息学方法对该基因序列的结构特征进行分析,并对植株不同组织及不同胁迫条件下该基因的表达量进行检测。结果显示：TaHDA19的开放阅读框长1560 bp,共编码519个氨基酸;该基因的氨基酸序列存在组蛋白去乙酰化酶（HDAC）家族典型的结构域Hist-deacety1。该基因上游启动子区含有多种响应元件,如：光响应元件I-box和G-box,脱落酸响应元件ABRE和低温响应元件LTR等。‘科农199’TaHDA19基因的表达结果表明：该基因在根、茎、叶片和幼穗中均有表达,其中在叶片中表达量最高;采用脱落酸、氯化钠和PEG分别处理植株0、1、3、6、12、24 h后,基因的表达水平出现差异;在对植株的12个生育时期进行35℃和42℃热胁迫处理1 h后,该基因表达量均出现上调。研究结果表明TaHDA19可能在小麦响应非生物胁迫过程中发挥重要作用。     

小麦几丁质酶基因Wch2的克隆与表达分析

利用小麦几丁质酶基因PCR特异片段为探针,分离克隆了一个小麦Chidl几丁质酶基因Wch2。该基因编码311个氨基酸,不含内含子,具有一个信号肽、一个富含半胱氨酸的几丁质结合区域、两个变异区、两个酶活性区域。Southern分析表明,在小麦基因组中Wch2有多个拷贝。秆锈菌接种诱导Wch2在一对小麦近等基因系中差异表达;在抗病系中国春Srll中,接种3d后Wch2开始表达,6d后表达量更高;而在感病等基因系中国春srll中,在所有取样分析的时间内均未检测到Wch2表达。将Wch2克隆到细菌表达载体pET22b,在细菌中表达的重组Wch2具有几丁质酶活性。这些结果说明,分离的Wch2基因在小麦秆锈菌诱导的抗性反应中具有重要作用。     

小麦F-box基因TaFBL14的克隆及表达分析

该研究利用同源克隆策略,获得了1条小麦F-box/LRR重复蛋白14基因(TaFBL14)。TaFBL14基因编码486个氨基酸,预测分子量为53.48kD,等电点为5.93,序列N端包含一个F-box结构域,C段包含7个LRR结构域。TaFBL14基因编码蛋白不具有信号肽及核定位信号序列,主要定位在细胞质中,二级结构以α-螺旋为主,呈球状。进化树分析表明,TaFBL14与粗山羊草和乌拉尔托小麦的FBL14蛋白亲缘关系较近。qRT-PCR分析结果显示,TaFBL14基因主要在小麦叶组织中表达,且受非亲和叶锈菌侵染后呈现上调表达趋势,说明该基因可能参与小麦抵御叶锈菌的侵染过程。     

小麦TaLhca基因的克隆及表达分析

为了从分子水分研究小麦的光合作用,该研究采用RT-PCR方法,从小麦品种‘百农207’的叶中克隆到1个捕光叶绿素a/b结合蛋白基因,命名为TaLhca。序列分析结果表明,TaLhca的编码区序列(coding DNA sequence,CDS)长810 bp,编码269个氨基酸,推测分子量为29.31 kD,等电点为8.69。TaLhca被定位于叶绿体,无信号肽,存在3个明显的跨膜区域,预测其蛋白结构含有典型的捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域(chlorophyll a/b binding domain),为亲水性非分泌蛋白。蛋白序列比对和进化树分析表明,小麦与二穗短柄草(Brachypodium distachyon)和水稻(Oryza sativa)中的Lhca序列相似性最高,亲缘关系最近。启动子顺式作用元件预测表明,启动子区域包含多个光响应元件及逆境响应元件。实时荧光定量PCR分析表明,TaLhca基因在小麦根、茎、叶中均有表达。其中在叶中表达量最高,在根中表达量最低,且受NaCl、干旱、ABA、H2O2和低温胁迫表达增强,受黑暗胁迫表达降低。该研究结果为进一步解析小麦光合作用机理及其相关基因的诱导表达特性提供了依据。     

小麦EDR1基因的克隆、鉴定和表达

为了研究普通小麦(Triticum aestivum L.)中是否有EDR1途径存在,根据拟南芥EDR1基因及其同源物设计了一对兼并性引物,用来分离小麦的EDR1同源物.以用小麦叶片RNA合成的cDNA为模板进行RT-PCR扩增,获得了代表小麦EDR1基因(命名为TaEDR1)的627 bp长的cDNA片段(GenBank登录号:AY743662).此后,通过RACE技术成功地获得了编码959个氨基酸的全长TaEDR1基因的cDNA序列.TaEDR1的氨基酸序列与大麦EDR1(标记为HvEDR1)有92%的相同.在TaEDR1的羧基末端有一个高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶催化功能域.因为存在一个推测的核定位基序,这个蛋白可能在细胞核中起作用.首次提供了证明普通小麦中存在EDR1同源物的分子生物学证据.用半定量RT-PCR方法研究了接种小麦白粉病菌[Blumeria graminis(DC.)E.O.Speer f.sp.tritici Em.Marchal,Bgt]后叶片中TaEDR1基因的转录谱.结果表明,在接种白粉病菌后TaEDR1基因在叶片中的转录水平提高.组织特异性表达谱分析证明,小麦TaEDR1基因在叶片、茎、穗、根中均有表达.研究提示TaEDR1可能在小麦防卫应答反应中起作用.     

小麦TaMAPK2基因的克隆及表达分析

该研究从小麦中克隆了1个MAPK基因TaMAPK2。序列分析表明,TaMAPK2基因的ORF为1 110bp,编码369个氨基酸。序列比对分析表明,该基因所编码的蛋白与粗山羊草、水稻、谷子等MAPK蛋白具有较高的一致性,分别为99%、94%、94%。进化树分析表明,TaMAPK2与水稻OsMAPK2的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,该基因的表达显著受渗透胁迫、低温胁迫、高盐胁迫、乙烯和双氧水诱导,受ABA抑制。研究表明,TaMAPK2可能参与非生物逆境胁迫及相关信号分子应答。     

小麦BBC1基因cDNA的克隆与分析

从小麦(Triticum aestivum L．)中克隆了一个BBC1基因的cDNA。分析结果表明,该基因编码一亲水多肽,富含丙氨酸、赖氨酸、精氮酸和谷氦酸。该基因的转录受低温调控。在小麦基因组中,BBC1基因以一个小家族的形式存在。     

小麦TaWRKY47基因的克隆与表达分析

为了探究小麦WRKY基因的功能,该研究采用RT PCR方法,在小麦叶片组织中克隆WRKY基因,并对其进行生物信息学和不同逆境胁迫下的表达分析。结果表明：(1)成功克隆得到1个小麦WRKY基因,命名为TaWRKY47。(2)TaWRKY47基因开放阅读框长度为900 bp,编码299个氨基酸,含有一个WRKY保守结构域和一个C₂HC锌指结构域,属于WRKY基因家族的第Ⅲ类成员。(3)亚细胞定位分析结果显示,TaWRKY47蛋白定位于细胞核。(4)荧光定量PCR结果表明,TaWRKY47基因在小麦根、茎、叶、雄蕊和雌蕊中均有表达,其中在雌蕊中表达量最高,且受低温、干旱、盐、ABA和H₂O₂等胁迫表达增强,推测TaWRKY47基因参与了小麦的逆境胁迫过程。该研究结果为进一步研究TaWRKY47基因功能与抗逆机制奠定了理论基础。     

小麦抗白粉病相关基因GST克隆与表达

以从小麦抗白粉病相关基因差异表达分析中获得的EST-3 (Genbank序列号EX567360)为标签,采用电子克隆的方法对其进行延伸,并对电子克隆结果进行半定量RT-PCR验证,最后对白粉菌不同侵染时间进行了表达分析.经RT-PCR扩增,EST-3表达的带型变化趋势与其在抑制性消减杂交SSH-cDNA的差异显示情况一致,且RT-PCR获得的序列与电子克隆的序列一致性达98％.生物信息学分析表明,该序列是由875 bp核苷酸组成的,具有完整的开放阅读框架,编码蛋白为229个氨基酸,GenBank序列号JK841279,含有一个N端和C端谷胱甘肽硫转移酶结构域,该序列与小麦谷胱甘肽硫转移酶基因(GST)一致性较高,达97％.表达分析结果显示,白粉菌侵染24 h表达受到抑制,48 h开始表达,侵染72 h表达最强,96 h又开始下降,表明GST基因属于白粉菌诱导型相关基因,参与小麦对白粉病的应答反应.     

小麦Na^＋／H^＋反转运蛋白基因的克隆和特性

以水稻 (OryzasativaL .)Na /H 反转运蛋白cDNA片段为探针 ,从小麦盐胁迫cDNA文库中筛选和克隆了 2个小麦Na /H 反转运蛋白基因 ,分别命名为TaNHX1和TaNHX2。序列分析表明TaNHX1为 2 0 2 9bp ,包含一个完整的 16 38bp的ORF ,编码 5 4 6个氨基酸 ,其中含有DIFFIYLLPPI跨膜区。TaNHX2为 16 93bp ,包含部分ORF及 80 8bp的 3′_UTR。这 2个基因与已知的水稻、拟南芥 (Arabidopsisthialiana)和滨藜 (Atriplexgmelini)中的同类基因NHX的相似性约为 70 %。RT_PCR分析表明小麦苗经 4 0 0mmol/LNaCl处理 1h后 ,TaNHX1的转录水平有所提高。     

小麦Na+/H+反转运蛋白基因的克隆和特性

以水稻(Oryza sativa L.) Na+/H+反转运蛋白cDNA片段为探针,从小麦盐胁迫cDNA文库中筛选和克隆了2个小麦Na+/H+反转运蛋白基因,分别命名为TaNHX1 和 TaNHX2.序列分析表明TaNHX1为2 029 bp,包含一个完整的1 638 bp的ORF,编码546个氨基酸,其中含有DIFFIYLLPPI跨膜区.TaNHX2为1 693 bp,包含部分ORF及808 bp的3′-UTR.这2个基因与已知的水稻、拟南芥(Arabidopsis thialiana)和滨藜(Atriplex gmelini)中的同类基因NHX的相似性约为70%.RT-PCR分析表明小麦苗经400 mmol/L NaCl处理1 h后,TaNHX1的转录水平有所提高.     

小麦种子基因的表达序列标签分析(英文)

以授粉后12d的小麦(TriticumaestivumL.)种子为材料,构建起cDNA文库。从中随机挑选10000个克隆,利用Biomek2000核酸工作站制成高密度cDNA阵列。然后分别以未受精子房、胚和胚乳中提取的RNA为模板,反转录合成探针与膜杂交,进行差示筛选。根据筛选结果,选取800个在胚、胚乳或胚和胚乳中表达的克隆进行表达序列标签(EST)分析,鉴定出216个不同的基因序列。其中24个ESTs属于已知的小麦基因;122个ESTs为推测的小麦新基因,它们编码的产物与种子贮藏蛋白或与生化代谢、发育等其他的生物学过程有关;70个ESTs的序列特征尚未确定。本研究为研究种子发育和小麦品质改良等提供了基础资料。     

小麦种子基因的表达序列标签分析

以授粉后12 d的小麦(Triticum aestivum L.)种子为材料,构建起cDNA文库.从中随机挑选10 000个克隆,利用Biomek 2000核酸工作站制成高密度cDNA阵列.然后分别以未受精子房、胚和胚乳中提取的RNA为模板,反转录合成探针与膜杂交,进行差示筛选.根据筛选结果,选取800个在胚、胚乳或胚和胚乳中表达的克隆进行表达序列标签(EST)分析,鉴定出216个不同的基因序列.其中24个ESTs属于已知的小麦基因;122个ESTs为推测的小麦新基因,它们编码的产物与种子贮藏蛋白或与生化代谢、发育等其他的生物学过程有关;70个ESTs的序列特征尚未确定.本研究为研究种子发育和小麦品质改良等提供了基础资料.     

Sequence and tissue-specific expression of a putative peroxidase gene from wheat (Triticum aestivum L.)

We have used a cDNA clone encoding a pathogen-induced putative wheat peroxidase to screen a genomic libary of wheat (Triticum aestivum L. cv. Cheyenne) and isolated one positive clone, lambda POX1. Sequence analysis revealed that this clone contains a gene encoding a putative peroxidase with a calculated pI of 8.1 which exhibits 58% and 83% sequence identity to the amino acid sequence of the turnip (Brassica rapa) peroxidase and a pathogen-induced putative wheat peroxidase, respectively. The two introns in the wheat gene are at the same positions as introns in the peroxidase genes of tomato and horseradish. Results of S1-mapping experiments suggest that this gene is neither pathogen-nor wound-induced in leaves but is constitutively expressed in roots.     

中华大蟾蜍Mest基因的cDNA克隆和表达分析

Mest基因是一种印记基因,在人、小鼠以及其他的哺乳动物和有花植物中都有研究报道。为了更好地研究该基因的功能和进化特点,利用RACE法获得了中华大蟾蜍Mest基因(BgMest)的cDNA全长序列(1 325 bp),它包含一个完整的ORF,可编码326个氨基酸的多肽(GenBank登陆号:ABQ10905)。多肽链中包含一个典型的α/β水解酶折叠结构域,其在氨基酸水平上与热带爪蟾和一些哺乳动物分别存在86%和70%～80%的相似性。进化树分析显示Mest基因为单系起源。RT-PCR显示,BgMest基因在精巢、卵巢、肝、肾、脑、胃和肺中都有表达,并且该基因在序列、表达模式以及蛋白产物的高级结构的高度保守性都说明它在两栖类生物中是保守的。但是在对哺乳动物以及一些脊椎动物的印记基因进行进化分析时,发现它们具有不同的起源。     

一个小麦丝氨酸—苏氨酸蛋白激酶基因的克隆和分析

用mRNA差异显示技术在含有抗白粉病基因Pm2 1的小麦 (TriticumaestivumL .)_簇毛麦 (Haynaldiavillosa)6VS/ 6AL易位系 92R137中分离与抗白粉病相关的基因 ,获得一个命名为TaPK1的全长cDNA克隆。序列分析表明 ,它与大豆 (Glycinemax (L .)Merr.)蛋白激酶基因GmPK6高度同源。经推测 ,TaPK1编码 416个氨基酸的多肽 ,属丝氨酸_苏氨酸蛋白激酶家族 ,并具酪氨酸激酶特性。TaPK1是从小麦中分离的新基因。     

一个小麦丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶基因的克隆和分析

用mRNA差异显示技术在含有抗白粉病基因Pm21的小麦(Tri ticum aestivum L.) -簇毛麦(Haynaldia villosa) 6VS /6AL易位系92R137中分离与抗白粉病相关的基因,获得一个命名为TaPK1的全长cDNA克隆.序列分析表明,它与大豆(Glycine max (L.) Merr.)蛋白激酶基因GmPK6高度同源.经推测,TaPK1 编码416个氨基酸的多肽,属丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶家族,并具酪氨酸激酶特性.TaPK1是从小麦中分离的新基因.     

抗除草剂草甘膦EPSPs基因在小麦中的转化

通过基因枪法,用抗除草剂草甘膦的ＥＰＳＰｓ基因转化小麦京花１号的幼穗约１０００个,及幼胚约８００个,经草甘膦选择后分别获得３８株和４株再生植株。这些再生植株经ＰＣＲ和（或）Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明,其中有部分再生植株的基因组中稳定整合了外源ＥＰＳＰｓ基因,并且转化体中部分是可育的。首次用实验证明,抗除草剂草甘膦的ＥＰＳＰｓ基因作为单子叶禾谷类作物小麦基因转化的选择标记是行之有效的。     

小麦幼苗期水分胁迫所诱导基因表达谱的初步分析

利用抑制差减杂交(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)和高密度点阵膜技术研究小麦2叶幼苗期水分胁迫诱导表达基因。通过筛选具有1530个克隆的SSH文库,获得181个阳性克隆。序列同源性比较和功能查询结果发现,83．2％的水分胁迫诱导表达基因分别与不同逆境胁迫条件下表达的基因具有较高的同源性,这些基因在生物体内的功能都是直接或间接对细胞遭受逆境胁迫起保护作用。其中17个EST未找到同源性较高的匹配序列,已经在GenBank注册。用反向Northern、RT-PCR和Northern进一步检验所获得的功能已知EST,初步建立了小麦幼苗期水分胁迫诱导的基因表达谱。