人红细胞生成素（EPO）工程细胞建立及特性分析

构建了ＥＰＯ真核表达质粒,成功地实现了其在ＣＨＯ－ｄｈｆｒ＾－细胞中的表达,所得到的ＥＰＯ工程的细胞株的形态与ＣＨＯ－ｄｈｆｒ＾－细胞相似,细胞株小瓶静止培养时最高表达水平为２－３μｇ／１０＾６ｃｅｌｌｓ／２４铺达稳定,连续传代三个月和反复冻存复苏三次,细胞表达水平无明显下降。经过对细胞的一系列特性分析表明,该细胞株无支原体、真菌及细菌污染、无致瘤性,形态正常,染色体畸变率与出发株相当。     

人红细胞生成素工程细胞株的特性鉴定

目的：为了对人红细胞生成素工程细胞株(F10—6)进行特性鉴定。方法：将人红细胞生成素基因构建的重组表达质粒pCDB与标志质粒pSV—dhfr共转染CHO-dhfr^-细胞中,经氨甲喋呤加压筛选和亚克隆挑选,获得高效稳定表达EPO的工程细胞株并对其进行鉴定。结果：实验结果表明,工程细胞株无细菌、支原体、真菌和病毒污染;并无致瘤性;染色体数目不变;连续传代50次和三次冻存复苏后,细胞表达稳定。结论：该工程细胞株可用于工业化生产。     

野生型组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)工程细胞株生物学特性分析

野生型t-PA工程细胞4B3形态与亲代细胞CHO-dhfr-相似呈多角形,类似上皮细胞。在MTX加压达5×10~(-7)mol/L时,少数细胞略变瘦长,但仍显多角形,形态正常。细胞无血清培养上清经FAPA检测,亚克隆株表达水平为10~6细胞4000～5000IU/24h。细胞经体外传代3个月及冻存3个月后复苏,部分亚克隆株表达水平下降,多数仍为10~6细胞4000IU/24h,表明4B3细胞株稳定性好。裸鼠试验表明,该工程株活细胞、细胞DNA、纯化的4B3rt-PA均无致瘤性病毒,支原体检查为阴性。遗传特性分析表明,该工程细胞与其亲代细胞CHO-dhfr-细胞染色体数均为20条,均有不同程度不同类型的畸变。该工程细胞的畸变率为16％。CHO-dhfr-细胞畸变率为6％。属正常范围。结果表明4B3细胞株为高效表达的性能优良的工程细胞株。     

促红细胞生成素(EPO)

一、产品概述 促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)主要是在肾脏中产生的一种造血激素,是具有166个氨基酸残基,分子量为35000的糖蛋白。 EPO对原红细胞集落生成细胞CFU-E或其早幼阶段的BFU-E起作用,具有促进向红细胞前体细胞--网状红细胞,原红细胞的分化,并生成红细胞的作用。     

组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体工程细胞株生物学特性分析

t-PA突变体工程细胞株FSGGI48形态与其亲代细胞CHO-dhfr相似呈多角形,类似上皮细胞。在MTX加压至5×10~(-6)mol/L时,少数细胞形态略变瘦长,但仍呈多角形,因此该工程细胞株形态正常。抗体中和抑制试验及纤维蛋白板80℃加热试验显示,FSGGI48细胞表达产物与st-PA的活性均能被抗t-PA抗体所抑制,而胰酶的活性则不被抑制,且二者在80℃加热的纤维蛋白板上均不产生溶解圈,胰酶则产生溶解圈,由此可知,该细胞株表达产物为特异的rt-PA产品。细胞无血清培养上清经FA-PA检测,亚克隆株表达水平为4000IU/10~6细胞/24h。分别测定冻存3个月后复苏和体外传代3个月以上细胞的表达水平,结果显示部分亚克隆细胞株表达水平下降,多数仍为3000-4000IU/10~6细胞/24h,说明细胞株稳定性好。裸鼠试验表明,该工程株活细胞、细胞DNA、纯化的细胞表达产物均无致瘤性。支原体检查结果为阴性。染色体分析显示,FSGGI48细胞与其亲代细胞(CHO-dhfr细胞)染色体数目相同均为20条,但均有不同程度不同类型的畸变。CHO-dhfr细胞畸变率为6%。该工程细胞的畸变率为15%-18%,在允许范围内。结果证明,t-PA突变体细胞株FSGGI48为性能优良的工程细胞株。     

人红细胞生成素受体胞外区克隆及序列测定

人红细胞生成素受体 (h EPOR)是人红细胞生成素的作用配体 ,其胞外区是 h EPO的作用域 ,它的克隆、表达对两种分子的相互作用机制以及 EPO类似物 (新型造血药物 )的筛选都有十分重要的意义。以人胎肝为材料 ,通过对其总 RNA的提取 ,利用 RT- PCR方法扩增 h EPOR的胞外区基因和跨膜区基因及推导相应的氨基酸残基排列 ,结果与国外文献报道相比较从而检验其正确性。     

11G工程细胞株人尿激酶原(pro-UK)基因拷贝数的测定

采用Southernblot和狭缝（Slotblot）杂交的方法,对高效表达人尿激酶原（pro-UK）的工程细胞──11G原代细胞及传134代后细胞含有的pro-UK基因拷贝数进行了测定。结果显示,11G工程细胞株内所含的pro-UK的拷贝数为100—200拷贝／细胞,传134代后其拷贝数基本不变,说明11G细胞株是稳定高表达pro-UK的工程细胞,符合WHO规定的关于重组DNA转化细胞用于生产的要求。     

用基因重组法生产红细胞生成素(EPO)

日本雪印乳业公司与京都大学农学部协作研究,发明了用基因重组技术生产EPO的有效方法。EPO是一种糖蛋白质增血激素,作为未来的增血剂而引人注目。     

组织型纤溶酶原激活剂（t—PA）突变体工程细胞株生物学特性分析

The morphology of t-PA mutant engineered cell line FSGGI48 is similar to that of CHO-dhfr- cell in polygon. When aminopterin (MTX) concentration is 5 x 10(-6) mol/L, a part of cells become slim, but they are still in polygon. Therefore, the morphology of FSGGI48 cell line is normal. The expression level is 4000 IU/10(6) cells/24 h in serum-free medium. The cell line is bequeathed for three months in vitro and revived after freezing three months, the greater part of cells are stable. The expression level is 3000-4000 IU/10(6) cells/24 h. The assay of tumorigenesis shows that the cells, cellular DNA and purified products don't form tumors in nude mice. The cell line hasn't been contaminated by mycoplasma. The results of chromosomal analysis show that the chromosomal number of CHO-dhfr- cell is 20 and the abnormal rate is 6%. FSGGI48 cell line is same as CHO-dhfr- cell in chromosomal number and the abnormal rate is 15%-18%, it is normal in scope. Therefore, the engineered cell line FSGGI48 is excellent.     

工程细胞单克隆筛选及单克隆源性验证

工程细胞的单克隆源性是保证产品质量的重要因素之一,因此得到了越来越多的重视。当前,药物审评机构要求报批单位采用合适的实验手段证明所使用细胞的单克隆源性。综述通过介绍生产用工程细胞株单克隆的挑选过程及诸如有限稀释法、ClonePix、流式细胞术等常用方法,讨论如何确保工程细胞的单克隆源性,以及在生物药品生产过程中保证工程细胞单克隆源性的意义。     

永生化后细胞的生物学特性

近年来,永生化细胞技术快速发展,对细胞生物学特性的研究及其临床应用具有深远的意义。目前通过导入永生化基因SV40抗原和hTERT基因成为细胞永生化的常用方法,但存在安全性隐患。利用可逆性永生化技术,使细胞在获得永生化能力的同时去除永生化基因,使细胞恢复到原始状态。文章综述了永生化后细胞生物学特性的变化,并讨论了临床应用可能面临的问题。     

组织型纤溶酶原激活剂工程细胞系遗传特性及成瘤性分析

构建了突变体t-PA,使其在CHO-dhfr细胞中表达。获得t-PA工程细胞系。对该细胞系进行了遗传特性分析,在培养基中加入秋水仙素,通过低张、固定处理并将细胞滴片、染色,进行染色体分析,结果表明,该工程细胞系染色体条数为20条,畸变类型有异着丝粒、四倍体、裂隙、断片、微小体,畸变率为15％,属于正常范围。同时进行成瘤性检测,选用4周龄裸鼠作为试验鼠,以人宫颈癌细胞(Hela细胞)为阳性对照,CHO-dhfr细胞为阴性对照,试验表明,t-PA工程细胞及表达产物对裸鼠均无成瘤性。     

Effect of Glutamate Analogues on Brain Tumor Cell Lines

Glutamate analogues have been used in many different experimental approaches in neurobiology. A small number of these analogues have been classified as gliotoxic. We have examined the effect of seven glutamate analogues (five gliotoxic and two neurotoxic) on the growth and viability of four human glioma cell lines, one human medulloblastoma cell line, and one human sarcoma cell line. Aminoadipic acid and homocysteic acid predominantly affected the growth of two glioma cell lines in the presence of 4 mM glutamine. Phosphonobutyric acid predominantly affected the other two glioma cell lines and the medulloblastoma cell line in the presence of 4 mM glutamine. In medium containing no glutamine, all three analogues had marked effects on all the cell lines except the sarcoma cell line. These effects were dose dependent. We postulate that these results can in part be explained on the basis of metabolic compartmentalization.     

马头山羊成纤维细胞系的建立与生物学特性分析

采用组织块贴壁培养法对马头山羊耳缘组织进行培养, 成功构建了马头山羊耳缘组织成纤维细胞系, 并对其形态学、生长动力学、细胞活力测定、中期染色体、微生物污染等特性进行了研究。结果表明: 培养细胞形态为典型的成纤维细胞, 细胞群体倍增时间(PDT)约为36 h。细胞冻存复苏后的活率为96.7%, 传代后生长状况与冻存前一致。细胞中期染色体二倍体(2n=60)占主体约为96%。微生物检测细菌、真菌、病毒支原体检测结果为阴性。细胞系各项指标均达到美国典型培养中心(ATCC)标准。此细胞库的建立在细胞水平上对马头山羊的遗传资源进行了保存, 也为今后的生物学研究以及体细胞克隆保种等研究提供了理想的实验材料。     

黄病毒检测工程细胞系的构建及功能鉴定

目的:构建黄病毒检测工程细胞系并对其功能进行鉴定。方法:以含有登革4型病毒814669株全长感染性克隆的质粒P4质粒为基础,缺失pr M-E基因1 945bp,构建含有红色荧光蛋白m Cherry报告基因的登革病毒复制子载体P4-△pr ME-m Cherry。以P4-△pr ME-m Cherry为基础,通过融合PCR方法,以真核表达载体p CDNA3.1+为骨架,构建用于黄病毒检测细胞筛选的缺陷型真核表达质粒p CDNA3.1-P4-m Cherry。脂质体转染法将质粒p CDNA3.1-P4-m Cherry转染BHK-21细胞,G418进行筛选,获得的阳性细胞克隆经96孔板系列稀释筛选、纯化克隆细胞BHKFlavivirus。结果:BHK-Flavivirus细胞感染登革病毒60h后,能够在荧光显微镜下检测到红色荧光蛋白m Cherry的表达,说明BHK-Flavivirus能够用于外源黄病毒的检测。BHK-Flavivirus细胞分别感染黄病毒属的乙脑病毒(P3)、4型登革病毒(P4),可以检测到红色荧光;而辛德毕斯病毒(XJ-160)、和基孔肯雅病毒(SD08Pan)、盖塔病毒(HB0234)等正链RNA病毒感染后则不出现红色荧光。结论:以上结果表明BHK-Alphavirus细胞可用于未知蚊媒黄病毒检测,该方法通过报告基因表达与否,能够高效、特异的甄别主要蚊媒甲病毒和黄病毒,同时该方法有利于稀缺病毒的分离、保存,操作方法简单、直观,有望应用于临床检测及病毒性生物战剂的早期甄别。     

花椰菜自交系主要形态性状的主成分分析和聚类分析

通过对54个花椰菜自交系材料进行主成分分析和聚类分析研究,以期为花椰菜育种中亲本选配提供帮助。结果表明:在主成分分析中,选取方差累积贡献率为70.024%的前6个主成分来评价花椰菜自交系资源;现球期、采收期、叶长、叶宽、株高、花球纵径、花球横径、球重、球形、球紧实度、叶色、蜡粉、内叶数、始花期和株幅是花椰菜亲本选择的主要形态指标。进一步通过系统聚类,将54个花椰菜自交系分为3类:第Ⅰ类表现为早熟、株幅小、叶片狭窄、蜡粉较少、球重和紧实度中等;第Ⅱ类表现为中熟、株幅中等、叶片灰绿、蜡粉较厚和花球半圆紧实且重;第Ⅲ类表现为晚熟、株幅大、株形高、叶片宽阔、蜡粉中等和花球扁圆。3个类群自交系性状之间的差异较为明显,有利于杂交育种亲本材料的选择。     

Tools for Targeted Genome Engineering of Established Drosophila Cell Lines

We describe an adaptation of φC31 integrase–mediated targeted cassette exchange for use in Drosophila cell lines. Single copies of an attP-bounded docking platform carrying a GFP-expression marker, with or without insulator elements flanking the attP sites, were inserted by P-element transformation into the Kc167 and Sg4 cell lines; each of the resulting docking-site lines carries a single mapped copy of one of the docking platforms. Vectors for targeted substitution contain a cloning cassette flanked by attB sites. Targeted substitution occurs by integrase-mediated substitution between the attP sites (integrated) and the attB sites (vector). We describe procedures for isolating cells carrying the substitutions and for eliminating the products of secondary off-target events. We demonstrate the technology by integrating a cassette containing a Cu²⁺-inducible mCherry marker, and we report the expression properties of those lines. When compared with clonal lines made by traditional transformation methods, which lead to the illegitimate insertion of tandem arrays, targeted insertion lines give more uniform expression, lower basal expression, and higher induction ratios. Targeted substitution, though intricate, affords results that should greatly improve comparative expression assays—a major emphasis of cell-based studies.     

Beagle犬血清与胎牛血清生化特性及其对体外培养的人肺癌细胞生长的影响

目的比较Beagle犬血清与胎牛血清生化特性,探讨它们对体外培养的人肺癌细胞生长的影响。方法收集、制备Beagle犬血清与胎牛血清,采用全自动血液生化分析仪测定23项血清生化指标,比较分析两组血清生化特征差异。取对数期人肺癌细胞QG-56,分别培养于含10%FBS或Beagle-S的RPMI-1640合成培养基中,于第0、24、48、72、96、120和144 h各取出一块培养板进行检测,观察不同血清对细胞生长MTT曲线、细胞形态学的影响。结果FBS中CK、CK-MB、LDH、HBDH、GGT水平明显高于Beagle-S（P〈0.05）;CHE水平却明显低于Beagle-S,两者之间比较,均具有显著统计学意义。血清中的BUN、CRE、GLU、TP、ALB、ALT、ALP、TBIL、DBIL、TG、K^＋、Na^＋、Cl^-、Ca^2＋、Pi^3-水平在Beagle犬与胎牛间无显著性差异。MTT曲线和细胞形态学观察,两组于干预后24、48、72、96、120、144 h对QG-56细胞株生长的影响无显著性差异（P〈0.05）。结论Beagle犬的血清生化特性及其对体外肺癌细胞生长的影响与胎牛相似,可作为血清药理研究的优选动物之一。