幽门螺杆菌重组vacA-ctxB蛋白的基因克隆与表达

目的构建幽门螺杆菌(H.pylori)vacA毒性片段与霍乱毒素B亚单位(ctxB)基因的原核表达载体,并诱导表达VCTB重组蛋白,为制备防治H.pylori感染的口服疫苗奠定基础。方法以H.pylori基因组DNA为模板,PCR扩增vacA毒性片段基因,克隆至质粒pQE30中,获得重组质粒pQE30-vacA。再以pET32(a) -ctxB质粒为模板PCR扩增ctxB目的基因并插入pQE30-vacA中,构建含双基因的表达质粒pQE-vctB。克隆至大肠埃希菌Top10,并在DH5α中诱导表达。SDS-PAGE分析表达结果,Ni-NTA柱纯化后Western blot鉴定其抗原性,免疫家兔后ELISA法检测血清中VacA和CtxB抗体鉴定其免疫原性。结果vacA的DNA片段为723 bp左右。ctxB基因的DNA片段为372 bp左右,与预计长度相符合。测序结果vctB融合基因由1092 bp组成,编码364个氨基酸残基的多肽,与基因文库相符。表达蛋白VCTB经SDS-PAGE分析,相对分子量为40 000,与预期的一致;表达量约占菌体总蛋白的20%,提纯后SDS-PAGE分析可见单一条带,纯度可达92%以上。Western blot鉴定能与抗VacA人血清发生特异性反应,ELISA测定能与抗ctxB兔血清发生特异性反应。结论含vctA和ctxB融合基因的表达载体构建成功,并在大肠埃希菌DH5α中表达了重组蛋白质VCTB,表达蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,可用于制备口服疫苗。     

幽门螺杆菌HspA融合蛋白口服疫苗的构建

构建表达幽门螺杆菌的保护性抗原分热休克蛋白A亚单位(HspA）和霍乱毒素B亚单位（CtxB）的重组融合蛋白的生物工程菌株,以此制备幽门螺杆菌的口服疫苗。用PCR方法扩增hspA和ctxB两个目的的基因片段,将它们分别克隆至pSK（＋）质粒上,然后插入含T7启动子ET－22b（＋）的表达载体中,构建嗓基因的表达质量pET－hct,转化E.coliBL21(DE3）,经IPTG诱导表达融合蛋白HCT。经测序,hspA-ctxB(hct)融合基因片段由726bp组成,可以编码242个氨基酸残基的多肽。经SDS－PAGE和免疫印迹分析检测发现,融合基因表达的蛋白质相对分子质量约为30kD。融合蛋白经镍离子柱纯化、复性后,和HspA共同标记同位素^125I,然后给小鼠灌胃,结果观察到HCT组小鼠血清中的^125I的放射量要明显高于HspA组（P＜0．001）,且吸收峰值时间明显提前。融合蛋白中的CtxB可明显促进小鼠对HspA的吸收,HCT融合蛋白可以作为预防和治疗幽门螺杆菌感染的侯选口服疫苗。     

抗重组VacA IgY体内抗幽门螺杆菌感染的实验研究

目的在构建H.pylori的基因工程菌pQE30-v-DH5a的基础上,诱导表达VacA重组蛋白,以此为抗原,制备抗VacA的蛋黄抗体（VacA IgY）。通过小鼠口服试验,证实VacA IgY治疗H.pylori感染的作用,为进一步制备抗H．pylori感染的IgY制剂提供实验依据。方法用重组H.pylori VacA蛋白免疫母鸡,水稀释结合氯仿有机沉淀法提取IgY,ELISA法测定其针对VacA的效价。建立H.pylori感染的Balb／c小鼠动物模型,治疗组在小鼠灌喂菌液后灌喂不同剂量的VacA IgY。以H.pylori培养和病理切片观察胃黏膜H.pylori定植和炎症反应程度。结果制备了高效价的IgY（1：12800）。动物实验阳性对照组H.pylori的总感染率为70．4％,12周后的感染率为88．9％。治疗组的感染率与同期阳性对照组相似,胃黏膜的炎症反应程度比阳性对照组弱,随IgY剂量的增加,炎症减弱明显,IgY剂量为4mg／ml时,能达到较理想的治疗效果。结论成功制备了高效价的特异性VacA IgV,小鼠体内实验证实了口服VacA IgY具有治疗H.pylori感染的作用,可用于制备口服制剂。     

幽门螺杆菌的研究现状

幽门螺杆菌是定植于胃粘膜表面与胃粘膜层之间的微需氧菌,大量研究表明它是胃炎,消化性溃疡的主要致病因素,并且与胃癌的发生有关,本文从微生物学特点,致病机制,实验室诊断,治疗和预防等方面对幽门螺杆菌的研究现状进行综述。     

幽门螺杆菌毒素及相关疾病的研究进展

幽门螺杆菌是引起胃炎,消化性溃疡等多种胃肠疾病的重要病原体。目前认为该菌的主要致病因子是细胞空泡毒素和细胞毒相关蛋白。本文综述这两种毒素的基因特征,基因分型方法,致病机制和临床相关疾病的国内外最新研究成果。     

幽门螺杆菌空泡毒素及编码基因的研究

幽门螺杆菌是胃部疾病的主要病原菌。近几年,它已成为研究热点之一,发展很快。本文就幽门螺杆菌空泡毒素及其编码基因的结构特性与胃部疾病的关系作了较为全面的介绍。     

幽门螺杆菌HP0762蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体制备

目的:表达和纯化幽门螺杆菌HP0762蛋白,并制备该蛋白的多克隆抗体。方法:从幽门螺杆菌SS1中经PCR扩增得到了hp0762基因,将其克隆至含有6×His编码序列的原核表达载体pET-28a(+)中,再将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行蛋白表达;用HiTrap Chelating HP亲和柱纯化重组蛋白,Western印迹进一步鉴定;以纯化后的蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔,制备该蛋白的多克隆抗体;用ELISA和Western印迹检测抗血清。结果:目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性表达,纯化后纯度可达90%以上;制备了针对HP0762重组蛋白的抗血清,抗体ELISA效价为1:256000,Western印迹分析表明该抗体能特异性识别内源性HP0762。结论:完成了HP0762蛋白的原核高效表达与纯化,并制备了其高效价的多克隆抗体,为进一步对其进行疫苗研制与基因功能研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌疫苗研究进展

幽门螺杆菌由于在人群中具有较高的感染率及被WHO确认为Ⅰ类致癌因子而受到重视,近年来对它的疫苗研究进展迅速,本文对幽门螺杆菌的全菌体疫苗,亚单位疫苗,重组减毒疫苗,微球疫苗及临床实验的情况进行了综述。     

幽门螺杆菌空泡毒素表达系统的构建及其鉴定

采用常规酚 氯仿法提取幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)临床菌株Y0 6株基因组DNA ,用PCR扩增空泡毒素 (vacA)基因 ,T A克隆后测序 ,亚克隆构建表达载体 ,采用Ni NTA亲和层析法提纯表达产物 ,SDS PAGE和Westernblot分别检测表达产物的分子量和免疫性。所构建的表达系统能表达vacA ,其产物可与相应抗体结合。重组vacA能有效地诱导家兔产生抗体 ,该抗体也能与重组vacA发生结合反应。     

幽门螺杆菌VacA真核表达载体的构建及其诱导细胞空泡化和凋亡

目的：研究幽门螺杆菌空泡毒素作为单一毒力决定簇对真核细胞的作用。方法：用PCR扩增VacA基因片段,克隆入真核表达载体pEGFP—N1,构建重组质粒pEGFP—VacA,转染HeLa细胞,通过相差显微镜和电子显微镜观察细胞形态与结构的变化。结果：重组质粒转染HeLa细胞24h,10％一20％细胞的胞质内出现明显空泡,其中少数细胞发生凋亡改变。结论：成功构建了用于真核表达的重组VacA质粒,转染真核细胞后,观察VacA作用导致的细胞形态结构的变化,为研究VacA作为单一毒力决定簇对真核细胞的作用奠定了基础。     

艰难梭菌毒素A原核表达及重组蛋白纯化

目的构建艰难梭菌(Clostridium difficile,C.difficile)毒素A羧基末端原核表达载体,优化诱导表达条件及纯化重组蛋白。方法利用聚合酶链式反应扩增C.difficile毒素A羧基末端基因序列,并将此序列转入pET-28b载体,构建pET-28b-tcdA重组表达载体,并将表达载体转化到BL21(DE3)感受态大肠埃希菌细胞中,分别在不同条件下进行诱导表达,获得最佳诱导表达条件后进行大量表达,最后用Ni柱对重组蛋白进行亲和纯化,得到纯化后的重组蛋白。结果成功构建了pET-28b-tcdA重组表达载体,其重组蛋白表达最佳诱导条件:菌液吸光度值取0.6、温度取25℃、IPTG终浓度取1.0mmol/L、诱导时间取10h。蛋白纯化咪唑磷酸盐洗脱液最佳浓度取200mmol/L。结论成功构建pET-28b-tcdA重组表达载体,在大肠埃希菌BL21(DE3)中可以有效表达,并获得高浓度重组蛋白,为进一步制备TcdA适配子奠定了一定实验室基础。     

融合蛋白TAT-RIG-I-GFP的原核表达及其跨膜递送

本研究旨在探讨融合蛋白TAT-RIG-I-GFP原核表达载体的构建并验证TAT在跨膜递送中的作用。首先设计了4对特异性引物,克隆了绿头鸭AnasplatyrhynchosRIG-I基因,构建了pET-TAT-RIG-I-GFP和pET-RIG-I-GFP原核表达载体;转化至感受态DE3细胞,经IPTG诱导表达,利用His60镍亲和层析柱纯化,进行SDS-PAGE;然后,将纯化后的上述两种表达蛋白分别孵育DF-1细胞;最后利用荧光显微镜观察是否在DF-1细胞产生相应的荧光。结果证实,携带有TAT的pET-TAT-RIG-I-GFP融合蛋白在DF-1细胞中显示出明显的绿色荧光;而不具有TAT的pET-RIG-I-GFP蛋白却不能显示绿色荧光。这表明携带TAT的融合蛋白已成功进入DF-1细胞,并在跨膜递送过程中发挥了关键作用。上述为进一步研制家禽的抗病毒药物奠定了基础。     

Identification of protein expression signatures associated with Helicobacter pylori infection and gastric adenocarcinoma using recombinant antibody microarrays

Antibody microarray based technology is a powerful emerging tool in proteomics, target discovery, and differential analysis. Here, we report the first study where recombinant antibody fragments have been used to construct large scale antibody microarrays, composed of 127 different antibodies against mostly immunoregulatory antigens. The arrays were based on single framework recombinant antibody fragments (SinFabs) designed for high on-chip stability and functionality and were used for the analysis of malignant and normal stomach tissue samples from Helicobacter pylori-positive and -negative patients. Our results demonstrate that distinct tumor- as well as infection-associated protein expression signatures could be identified from these complex tissue proteomes, as well as biomarkers such as IL-9, IL-11, and MCP-4, previously not found in these diseases. In a longer perspective, this study may improve the understanding of H. pylori-induced stomach cancer and lead to development of improved diagnostics.     

GST-His-Heparinase I双标签融合蛋白的原核表达与纯化

以pETl5b-Hep I为模板,通过PCR技术扩增出上游合有6×His标签的HepI基因序列,克隆至表达载体pGEX-4T-1。测序鉴定后,将重组表达质粒pGEX．His．HepI转入E．coliBL21（DE3）感受态细菌,经IPTG诱导表达。表达产物可溶部分用GSTrapFF和HisTrapHP柱两步亲和纯化,所得产物经SDS—PAGE检测,在66kDa和43kDa处显示特异条带,分别与GST．His．HepI和His-HepI融合蛋白预期分子量相符;最终His—HepI融合蛋白的比酶活为86．45IU／mg,纯度高达99％,与仅一步亲和纯化得到的GST．His—Hep I融合蛋白相比,进一步提高了纯化后重组肝素酶的纯度。本研究为制备高纯度的HepI提供了一种方法,对制备高安全性的LMWH和解析HepI晶体结构具有重要意义。     

高效表达幽门螺杆菌UreB重组蛋白工程菌的构建

克隆表达幽门螺杆菌(Hp)的尿素酶B亚单位(UreB)重组蛋白,可为Hp疫苗开发和快速诊断试剂盒的研究奠定基础。用PCR方法由幽门螺杆菌染色体DNA扩增UreB基因片段,将其融合插入原核表达载体pQE30中,并在M15大肠杆菌表达。经酶切、测序分析,包括部分融合载体基因在内的重组UreB基因片段由1773bp组成。为编码591个氨基酸残基的多肽。SDS-PAGE分析显示重组表达的目的蛋白相对分子量约为66kD,表达量点菌体总蛋白的23．5％,并经免疫印迹分析证实被幽门螺杆菌感染的阳性血清可与纯化UreB重组蛋白发生特异性的结合反应。UreB重组蛋白具有良好的抗原性,将有可能成为一种有效蛋白质疫苗以及快速诊断试剂盒用于Hp感染的防治和检测。     

Prokaryotic expression and action mechanism of antimicrobial LsGRP1C recombinant protein containing a fusion partner of small ubiquitin-like modifier

Applied Microbiology and Biotechnology - Antimicrobial peptides (AMPs) are peptides exhibiting broad-spectrum antimicrobial activities and considered as potential therapeutic agents. LsGRP1C, a...     

新型促细胞粘附重组人源性胶原的原核表达及功能性研究

选择一段与COL1A1基因相应序列同源、适合于在大肠杆菌E.coli中表达、含有编码促细胞粘附位点GER三肽密码子的基因序列。利用RT-PCR技术自人组织扩增该序列,构建pET28a(+)-COL重组表达质粒并转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。IPTG诱导表达获得重组人源性胶原RHDC, 表达量达到菌体总蛋白的40%左右。SDS-PAGE和Western Blot结果推测该胶原具有三螺旋结构。细胞粘附试验证明RHDC具有促细胞粘附能力,具有应用在生物材料领域的潜力。     

In vivo expression of the 25-kDa laminin-binding protein of Helicobacter pylori

The gastroduodenal pathogen Helicobacter pylori has been shown to inhibit the interaction between the extracellular matrix protein laminin and its receptor on gastric epithelial cells, potentially contributing to a loss of mucosal integrity. As a 25-kDa outer membrane protein of H. pylori in association with the bacterial lipopolysaccharides (LPS) mediates attachment to laminin, the aim of this study was to determine whether the 25-kDa protein is produced by H. pylori in infected hosts. We examined the immune response to the 25-kDa laminin binding protein in 12 paediatric patients; samples from a H. pylori-negative healthy adult were used as controls. In immunoblotting, antibodies to a 25-kDa protein were found in the serum and saliva of H. pylori-positive individuals only, and using the positive sera and saliva, laminin binding to the 25-kDa protein was inhibited. Thus, the 25-kDa laminin-binding protein is produced by H. pylori in infected hosts.     

Correction to: Prokaryotic expression and action mechanism of antimicrobial LsGRP1C recombinant protein containing a fusion partner of small ubiquitin-like modifier

Applied Microbiology and Biotechnology - The published online version contains editing mistake in Table 2. See below for the corrected Table.