大麦条纹花叶病毒新疆株(BSMV-XJ)RNA2 3′端结构分析

本文利用双脱氧序列分析法对我国大麦条纹花叶病毒新疆株(BSMV-XJ)RNA2 cDNA的3′端进行序列分析,证明XJ株RNA2 3′端239个核苷酸与国外典型株3′端相应部位有高度的序列同源性。通过序列分析及使用寡核苷酸定位裂解法和分子杂交确定,在紧邻239个核苷酸的上游有一个Poly(A)结构,3′终端为一个类tRNA结构,亦与国外典型株相同。经分析认为BSMV-XJ3个基因组RNA具有相同的3′端结构。     

登革热病毒基因组末端cDNA的克隆及序列分析

采用磁性分离技术从登革热病毒(D2-04株)感染的C6/36细胞中分离了D2-04病毒RNA.以该RNA为模板进行RT-PCR,分别扩增了D2-04 RNA 5′和3′端cDNA片段,该cDNA片段分别克隆到pGEM-3Z质粒多聚接头的HincⅡ位点得到含有5′端284 bp及3′端525 bp cDNA的重组质粒.通过荧光标记引物及双脱氧核苷酸PCR方法测定了上述cDNA插入片段的序列.同源性比较结果证明D2-04株与其他不同株间的同源性较高,可达93%～98%;不同型间的同源性较差, 仅80%左右; 属间的同源性更低.     

猪水泡病病毒HK′1／70株基因组全长cDNA的构建及其序列测定

从实验感染猪水泡病病毒(SVDV)的乳鼠组织中提取RNA,利用长距离的RACE技术,扩增出覆盖SVDVHK′1/70株全基因组的2个忠实性的cDNA重叠片段(3′PCR片段和5′PCR片段),分别克隆进pGEM-T Easy载体。利用AatⅡ和BssHⅡ酶切含5′PCR片段的重组质粒,回收目的片段,定向克隆于含3′PCR片段的重组质粒,构建出了SVDV HK′1/70株全长cDNA重组质粒,然后进行序列测定。结果表明,HK′1/70株基因组全基因组序列长7 401 nt(poly A除外),其中5′NCR长743 nt,该毒株蛋白编码区的核苷酸序列为6 558 nt,编码一个长2 185个氨基酸的聚合蛋白,3′NCR长102 nt,其后是至少含有74个A碱基的poly A尾。在HK′1/70株全长cDNA序列的5′端引入了T7启动子序列,在poly A3′端引入了Psp1406Ⅰ识别序列。通过序列同源性和进化树分析,结果表明,HK′1/70属于第Ⅱ抗原遗传群,SVDV与CB5的遗传关系最近,且位于CB5遗传进化树的分支上。HK′1/70株全长cDNA的序列测定及构建,为拯救SVDV和在分子水平进一步深入研究SVDV打下坚实的基础。     

黑木耳核糖体失活蛋白cDNA 3′-端的克隆与分析

为了克隆黑木耳核糖体失活蛋白cDNA 3′-端,根据随机测得的中间一段蛋白质序列设计简并引物,应用RT-PCR和3′-RACE反应方法,将得到的基因片段与质粒连接,并转化至大肠杆菌中,进行蓝白筛选,再通过琼脂糖凝胶电泳法和PCR法验证白斑,从而得到阳性重组质粒,最后克隆出该目的蛋白基因片段。结果表明,克隆出的cDNA 3′-端为330bp的开放阅读框(ORF),编码107个氨基酸和2个终止密码子。经试验证明和文献检索,克隆得到的cDNA 3′-端为一种新基因。     

脊髓灰质炎病毒中Ⅰ9株基因组克隆及其部分结构分析

以脊髓灰质炎病毒RNA为模板,反转录合成了长链ds-cDNA。将合成的脊灰病毒中I9株ds—cDNA片段重组到质粒pAT153上,获得了约占脊灰病毒中I9基因组95％以上的cDNA克隆。对克隆的中I9cDNA部分片段作了限制性内切酶图谱分析和部分核酸的序列分析,发现脊灰病毒中I9部分核酸顺序有所改变。     

大麦条纹花叶病毒新疆株3''''端基因组的克隆及分析

我们应用多次加尾的方法,对大麦条纹花叶病毒新疆株的RNAs基因组进行克隆。在所述条件下可以合成2000～3000核苷酸长度的cDNA。通过原位杂交、转印杂交(Northern blot)证明所得克隆属于RNA_1和RNA_3组分,并包含有3′端基因组结构。对部分克隆进行了酶谱分析。     

柯萨奇病毒B组3型基因组剪切片段的序列分析

柯萨奇病毒B组(Coxsackievirus B,CVB)感染细胞时其基因组RNA存在不稳定现象,但产生机制尚不清楚。本研究将柯萨奇病毒B组3型(CVB3)感染细胞后,利用5′ cDNA末端快速扩增技术(5′ rapid amplification of cDNA ends,5′ RACE)扩增并克隆细胞内CVB3基因组片段,并对每条序列及其5′端的二级结构进行分析。结果获得的20条CVB3基因组片段,长度为 2 067～5 547 bp,片段断端主要分布于2Apro和2C编码区。RNAfold分析显示,这些片段多数在5′断点端形成二级茎-环结构。本研究显示,CVB在宿主细胞感染时可形成大量不完整基因组RNA片段,这些片段可在5′断点端形成局部双链结构,提示片段不是随机产生,可能是RNA酶剪切产物。此发现有助于理解CVB基因组不稳定的机制。     

4株SARS冠状病毒基因组5’端序列的分析与比较

利用5′RACE试剂盒对从中国不同地区、不同SARS患者体中分离的SARS-CoV基因组5′端序列进行RT-PCR扩增,并将扩增产物克隆至T easy vector。扩增片段的序列测定结果表明:所分离的4株SARS-CoV基因组5′端非编码区的核苷酸序列和其他国家和地区报道的序列基本一致,而且所形成二级结构也完全相同,但与已知普通冠状病毒的差别较大。同时发现在依赖于RNA的RNA聚合酶起始密码子上游-197 nt处有冠状病毒典型的转录调控核心保守序列5′-CUAAAC-3′。     

4株SARS冠状病毒基因组5′端序列的分析与比较

利用5′RACE试剂盒对从中国不同地区、不同SARS患者体中分离的SARS—CoV基因组5′端序列进行RT-PCR扩增,并将扩增产物克隆至Teasy vector。扩增片段的序列测定结果表明：所分离的4株SARS—CoV基因组5′端非编码区的核苷酸序列和其他国家和地区报道的序列基本一致,而且所形成二级结构也完全相同,但与已知普通冠状病毒的差别较大。同时发现在依赖于RNA的RNA聚合酶起始密码子上游—197nt处有冠状病毒典型的转录调控核心保守序列5′-CUAAAC-3′。