体外细胞去核过程的扫描电镜观察

使用5—10微克/毫升浓度的CB处理生长在特制的玻片上的HeLa、IB-RS-2、BHK-21细胞,然后离心去核。去核过程的不同阶段中的细胞经临界点干燥,用SEM观察。用CB处理后,细胞表面出现大量泡状物,偶尔也发生自发排核。离心时,包着细胞核的胞质突起物从细胞表面升起,逐渐拉长至念珠状,最后断裂。同时也可看到核从胞质突起中剥出。所获得胞质体形状随离心力与细胞生长面的角度不同而异。含有CB和秋水仙素的营养液处理细胞冲刷去核的过程,也使用SEM进行了观察,突出的核可被冲掉,留下胞质体。这种情况下泡状物失去很多,因而可能失去较多的膜物质和核糖体。     

去核过程中CHO细胞波形纤维的分布

本文用豚鼠抗小牛晶状体波形纤维蛋白的血清抗体,对经细胞松驰素B(CB)和秋水仙素等药物处理后再离心去核的CHO细胞及其核体、胞质体进行了间接免疫荧光染色,并对核体做了电镜观察。CB处理后离心的细胞的免疫荧光染色显示,去核过程中核的后方始终伴有强烈的荧光,核体上也有强荧光斑。在核体的电镜材料中同样观察到了中等纤维。经CB和秋水仙素合并处理后离心的细胞,去核效果比仅用CB处理有明显的增强,免疫荧光染色表明,核后的荧光并不因秋水仙素处理而消失。实验结果表明:1.微丝对维持细胞表面的完整性有重要作用,CB能破坏微丝故有利于离心去核。2.中等纤维与核之间存在密切联系,这种联系在核膜的某些区域比较集中、牢固,不易为离心力所破坏。3.微管对核固着作用有重要意义,细胞核可能通过中等纤维与微管相连而抛锚在胞质中,故秋水仙素可增强去核作用。微管对维持细胞表面强度可能也有一定作用。     

细胞松弛素B对日本沼虾四倍体的适宜诱导条件的研究

本文研究了用细胞松弛素B(Cytochalasin B,CB)诱导日本沼虾(Macrobrachium nipponense)多倍体的处理条件和方法。试验水温分别为18—19℃、22—23℃,CB浓度为1.0—2.0mg/L,处理的起始时间在受精后5—9h,处理的持续时间为10—20min。结果表明,在水温为18—19℃时,四倍体卵子的最适诱导条件为:受精后7—8h,CB溶液的浓度1.5mg/L,处理20min,四倍体诱导率最高可达56.1%;在水温为22—23℃时,最适诱导条件为:在受精后6 h左右,CB溶液浓度为1.5mg/L,处理15—20min,四倍体诱导率最高可达54.3%。处理的起始时间和CB溶液的浓度对胚胎的四倍体率有显著影响(P<0.05);胚胎的成活率随CB浓度的提高与处理的持续时间的延长而下降。考虑到胚胎成活率因素,建议选择CB浓度为1.5mg/L,处理持续时间15—20min。     

化学辅助去核法对绵羊卵母细胞去核率和重构胚发育率的影响

为提高绵羊体细胞核移植的效率,本研究采用一种新的去核方法—化学辅助去核法,对绵羊体外成熟的卵母细胞进行去核,研究了化学诱导剂秋水仙素的处理浓度、作用时间、卵母细胞的成熟时间对去核效果及重构胚发育的影响。结果表明:1)卵母细胞在0.4μg/mL的秋水仙素溶液中分别孵育0.5h和1h,胞质突起率和去核率没有显著的差异,突起率可高达85.4%,去核率达到100%;2)0.2μg/mL或0.4μg/mL秋水仙素溶液将卵母细胞处理0.5h,对去核效果没有显著影响;3)对于体外成熟18～23h的卵母细胞,随着成熟时间的延长,盲吸法的去核率降低,但没有影响秋水仙素诱导胞质突起的比率和去核率;4)两种去核方法对重构胚的发育没有产生显著影响,但成熟21～23h卵母细胞重构胚囊胚的发育率显著高于成熟18～20h卵母细胞重构胚囊胚的发育率。综上所述,本试验优化了绵羊卵母细胞化学辅助的去核程序,利用化学辅助去核法对高卵龄的绵羊卵母细胞进行去核,提高了去核率和重构胚的体外发育率。     

用改进的细胞核移植方法构建重构胚

为了能够找出一种既容易操作,又不需要特殊设备的核移植方法,对以前的操作进行了改进。首先以预先吸有细胞核或细胞的注射针在固定于持卵针上的卵母细胞透明带上穿刺两个孔,然后一边缓慢地将注射针回拔至卵周隙中,一边逐渐增加持卵针中的负压,直至极体与目标核质被完整吸入持卵针中而完成去核,最后在不拔出注射针的情况下直接注射细胞核或完整细胞进而完成重构胚的构建。用此方法对200个卵母细胞进行注核和注细胞操作,平均完成一个重构胚的构建各自耗时约40s和30s,成功率分别为62.6%和86.0%。用核染料Hoechst 33342 对卵母细胞的去核效率进行验证,去核成功率达到73.3%。实验证明,用此方法可以在只有倒置显微镜和显微操作仪的条件下一次性快速完成去核和注核,大大提高了细胞核移植的效率和重构胚成活率;更重要的是该方法操作简单,新手可以很快掌握该技术,易于在实际工作中推广应用。     

家兔胚胎细胞核移植的研究

本研究以兔为实验材料,对细胞核过程中显微操作、电融合、电活化以及移核胚的培养等基本问题进行了研究。对兔进行PMSG－hCG超数排卵,收集成熟母细胞和16－细胞胚;后者经胰蛋白酶消化,去除胶膜和透明带,在不含Ca62 、Mg^2 的分离中分成单个卵裂球;然后,分别对两者做CB预处理;首次尝试采用WQilladsen法,去除卵母细胞核、并将单个卵裂球注入透明带,同时、与McGrath-Solter法进行比较;通过电融合使供体核进入去核的卵母细胞内;将所得移核胚在体外或在中间内体内培养并观察。结果表明：一、Willadsen法与McGrath-Solter法比较,核移植操作的成功率及以后的电融合率均无明显差异（Tab.1)。相对于后者,Willadsen法更简便、易于掌握并提高去核率。二、hCG超排注射后13－15h,观察卵母细胞发现：其中,67．8％保留有第一极体。此时的卵子若去除1／3胞质量,去核率可以达到58．3％。若推迟去核时间,第一极体退化,失去去核标志。三、比较不同电脉冲条件,发现强度为0．63kv/cm,持续160μs的一次电脉冲可获较高移核胚的融合率（70．8％）（Tab.2）;并可使61．1％的成熟卵母细胞活化。四、比较移核胚在体外和在中间有体内两种培养条件,前者只有34．6％能发育到6－8细胞期,而后者有23．0％能发育到桑椹胚或囊胚（Tab.3)。说明：需进一步优化家兔胚体外培养条件。     

用改进的细胞核移植方法构建重构胚

为了能够找出一种既容易操作,又不需要特殊设备的核移植方法,对以前的操作进行了改进。首先以预先吸有细胞核或细胞的注射针在固定于持卵针上的卵母细胞透明带上穿刺两个孔,然后一边缓慢地将注射针回拔至卵周隙中,一边逐渐增加持卵针中的负压,直至极体与目标核质被完整吸入持卵针中而完成去核,最后在不拔出注射针的情况下直接注射细胞核或完整细胞进而完成重构胚的构建。用此方法对200个卵母细胞进行注核和注细胞操作,平均完成一个重构胚的构建各自耗时约40s和30s,成功率分别为62·6%和86·0%。用核染料Hoechst33342对卵母细胞的去核效率进行验证,去核成功率达到73·3%。实验证明,用此方法可以在只有倒置显微镜和显微操作仪的条件下一次性快速完成去核和注核,大大提高了细胞核移植的效率和重构胚成活率;更重要的是该方法操作简单,新手可以很快掌握该技术,易于在实际工作中推广应用。     

猪传染性水泡病病毒在去核细胞内的复制

本实验利用CB去核技术制备了IBRS-2细胞的胞质体,研究了SVDV在胞质体内的复制与发生。运用显微自显影,单个去核细胞定位包埋及其电镜自显影以及液体闪烁计数技术等综合方法,证实SVDV可在去核的细胞内复制病毒的RNA,而且可致细胞病变,并用细胞显微操作技术直接证实胞质体内可以产生有感染性的子代病毒,从而说明SVDV可利用胞质体作为活试管进行复制,无需细胞核直接参加调控。     

奶牛体细胞核移植胚胎产业化生产条件优化北大核心CSCD

通过优化高产奶牛体细胞克隆胚胎体外生产技术条件,制备高质量的奶牛克隆胚胎,旨在提高奶牛体细胞核移植产业化应用效率。就受体卵母细胞去核方法、不同年龄供体牛细胞来源、血清饥饿与否以及不同气相组成培养等条件对奶牛体细胞克隆胚胎生产效率的影响进行了研究和探讨。结果表明,虽然荧光染色辅助去核和盲吸法的去核率、囊胚发育率分别为100%、24.83%和92.44%、28.26%,两者之间无显著差异(P>0.05),但盲吸法操作简单、效率高;不同年龄来源供体牛的细胞系构建的克隆胚胎的囊胚发育率分别为31.43%、25.68%,两者之间没有显著差异(P>0.05);经血清饥饿和未饥饿供体细胞重构的克隆胚胎囊胚发育率分别为24%、29.9%,两者之间没有显著差(P>0.05);富氧和低氧气相培养的克隆胚胎的囊胚发育率分别为28.26%、31.55%,两者之间差异不显著(P>0.05),低氧气相组成更有利于囊胚的发育。根据上述结果,奶牛体细胞核移植胚胎(克隆胚胎)的产业化生产条件为:供体细胞无需进行同期饥饿处理,直接注入到盲吸去核后的受体卵子透明带下构建克隆胚胎,融合后的克隆胚胎在密封的混合三气(5%CO2-5%O2-90%N2)的气相组成下进行体外培养,能保持稳定的囊胚发育率。     

一种改进的牛体细胞核移植去核方法

为了提高传统的盲吸法牛体细胞核移植去核效率,将0.5mL离心管底部截掉,在截口处蒙上一层400目的细胞筛网,再与1 mL的离心管套在一起。实验1,将成熟的卵母细胞置于改造过的离心管内膜上,分别以1,000r/min、2,000r/min及3,000r/min离心10min,Hoechst 33342染色后,在荧光显微镜下计算第一极体与染色体的位置关系及去核效率;实验2,将卵母细胞以2,000r/min离心后去核做受体,颗粒细胞做供体进行核移植,检查重构胚胎的早期发育情况。结果表明:以2,000 r/min将卵母细胞离心10min后,有86.6%卵母细胞的极体与染色体之间夹角在20°以内,此时去核效率最高(87.4%);将卵母细胞离心后,对随后的重构胚发育无影响。因此,采用离心辅助去核的方法可以显著提高牛卵母细胞的去核效率。     

核体(Karyoplast,细胞去核产物)合成RNA的能力

近十年来由于细胞松弛素B(Cyto-chalasin B,以下简称CB)引起细胞群体去核的方法的建立和不断完善,为细胞核与质的相互作用关系研究提供了一个新的实验手段。为详尽地了解CB处理细胞所获的核体和胞质体的特性,以便利用其进行核质关系方面的研究,我们利用显微与电镜放射自显影技术对CB处理所获各类核体作了RNA代谢的研究。核体(Karyoplast)是外面包被着细胞质膜并带有不同量胞质的细胞核,核体本身就是研究细胞核与质相互关系的好材料。通过对核体的研究,可从中探讨大分     

绵羊体细胞核移植去核前程序的优化

目前绵羊体细胞克隆效率仍然很低,本研究拟对去核前的操作环节进行优化。主要为卵巢保存时间(3 h和3–5 h)、卵母细胞体外成熟时间(18 h和24 h)、供核细胞贴壁率(10%和30%)和盲吸法去核时间(16 hpm和18 hpm)等4个方面优化。以成熟率、融合率和重构胚胎发育能力作为评价参数。结果表明:在卵巢保存方面,卵巢保存3 h组卵母细胞成熟率显著高于3–5 h组卵母细胞成熟率(60.18%vs 52.50%)(P0.05),重构胚胎发育力差异不显著(P0.05);在体外成熟时间方面,体外成熟18 h组和24 h组卵母细胞成熟率差异极显著(53.81%vs 89.06%)(P0.01),胚胎发育力差异不显著(P0.05);在融合率方面,贴壁率30%组极显著高于贴壁率10%组(80.85%vs 57.69%)(P0.01),在克隆胚胎发育率方面没有显著差异(P0.05),具有贴比率差异性的细胞在细胞生长平台期表现出差异性;在去核时间方面,16 hpm组和18 hpm组胚胎卵裂率差异显著,囊胚发育力差异不显著(P0.05),16 hpm组获得一只克隆羊,重复16 hpm获得4只妊娠克隆羊。组织微卫星序列经SDS-PAGE分析,DNA指纹与供体细胞相同。结论:去核前程序的优化保证了材料的质量,为提高克隆胚胎数量和质量奠定基础,可以获得体细胞克隆羊。     

哺乳动物细胞去核产物(胞质体及核体)的结构与功能研究

1967年Carter发现细胞松弛素可以诱发组织培养细胞的自发排核之后,Prescott(1972)借助细胞松弛素存在下的离心处理,使这一排核现象普遍化,从而确立了体外细胞去核的标准方法。经过不断改进(croce et al., 1974;Veomett et al., 1976;Lucas etal., 1976;Wigler et al., 1975),现在,这一技术已广泛应用于细胞学研究的各个重要领域(Mc Burney et al., 1979;Goldman et al., 1974;du Bols et al., 1980)。细胞去核技术及其应用的研究在我国已有初步开展(陈瑞铭等,1979;沈鼎武等,1980)。本实验对二种上皮型传代细胞系进行了去核手术,用扫描电镜和透射电镜对所获得的胞质体     

JMP定制实验设计优化胃癌患者PBMC分离方案

为探索胃癌患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)分离的优化条件,本研究用JMP10.0软件定制设计方法,研究离心时间、离心速度对PBMC离心厚度的影响,建立模型、刻画最优参数,验证并用台盼蓝染色观察优化条件下离心的PBMC细胞存活率。结果表明,离心时间、离心速度与PBMC厚度存在曲线关系,离心时间与离心速度的交互作用无统计学意义。预测模型的决定系数R2=0.88,预测值与实际值的一致性较好。刻画最优离心时间=10 min,离心速度=2 307 r/min,PBMC厚度预测值=2.596 923 mm,95%CI(2.342 13,2.851 71),验证离心的PBMC厚度=2.7 mm,细胞存活率=95%。本研究采用JMP定制设计方法优化PBMC离心条件,可为标准操作程序的建立提供基础。     

影响猪体细胞核移植重构胚体外发育的若干因素

以卵丘细胞为核供体细胞组成重构胚,卵裂率达到56.7%,发育至桑椹胚达11.7%、孵化囊胚率为6.7%,显著高于成纤维细胞组成的重构胚(p<0.05)。我们研究了卵母细胞的采集方法,激活方法和卵龄对卵丘细胞核移植重构胚体外发育的影响。以血清饥饿法将卵丘细胞诱导至GO或G1期,抽吸法/解剖法采集卵母细胞,体外培养33或44 h,将卵丘细胞置于去核卵母细胞的卵周隙中,重构胚以钙离子载体A23817或电脉冲结合6-DMAP激活处理,体外培养6天,结果表明,卵母细胞采集方法、激活液中细胞松弛素(CB)并不影响重构胚的发育(以卵龄44h的卵母细胞为受体);而以电脉冲结合6-DMAP激活处理能提高重构胚发育能力(以卵龄33 h的卵母细胞为受体)(p<0.05)。本研究显示,以电脉冲结合6-DMAP激活卵丘细胞重构胚,能在体外发育至囊胚     

核体合成自身DNA与病毒DNA的能力

近年来,用松胞素B(简称CB)诱导细胞去核的技术已被许多学者应用于细胞内大分子代谢及其调控过程的核质关系研究中(Colonne et al.,1980;Premveer et al.,1980;White et al., 1982)。我们在对CB诱导的去核产物的研究基础上(何大澄等1982),对核体内RNA的合成进行了研究,表明核体合成RNA的能力与核体贴壁和所带质膜的完整性以及胞质量多少有关(戎宪辉等1984)。此外,我们还研究了两种小RNA病毒和痘病毒的核酸在胞质体内的复制,证明它们的复制可以不依赖细胞核     

长牡蛎“海大2号”四倍体的人工诱导

为筛选适宜的四倍体诱导条件,研究了细胞松弛素B(CB)浓度(0.3、0.5、0.7和0.9 mg/L)、起始诱导时间(5、10和15min)、诱导持续时间(10、15、20和25min)及三者的交互作用对长牡蛎“海大2号”四倍体诱导率(四倍体率)和D形幼虫率的影响,并对诱导处理组获得的幼贝倍性进行检测分析,进一步验证了...     

家兔供体细胞的发育周期与重构胚发育的关系

采用血清饥饿法处理体外培养的兔子胎儿成纤维细胞,并将其作为供体细胞移入去核卵母细胞内构建重构胚胎。检查供体细胞的细胞周期对重构胚的融合率、分裂率和着床率的影响。实验结果表明：培养基中血清含量在0．5％的情况下,G0／G1期的细胞比例由正常培养条件下(培乔液中含有10％FCS)的73．2％明显地增加到86％以上。饥饿1～3天的细胞作为供体细胞构建重构胚时,可明显提高重构胚的融合率,但是不同的饥饿时间其融合率并无显著的差异。饥饿处理可明显增加重构胚的分裂率,以饥饿处理3天为最佳。     

重组CHO-C_(28)细胞染色体鉴定方法的研究

分别采用五种不同条件鉴定重组CHO-C28细胞染色体。对其影响因素如用秋水仙素处理时间的长短、固定液的使用方法等进行了试验,选择出了细胞分散好、染色体形态正常、边缘清晰、便于鉴定的两种最佳条件。此方法操作简单、成功率高,适于CHO-C28细胞染色体鉴定。     

猪克隆胚胎激活方法优化与转人溶菌酶基因克隆猪的生产

为了提高转基因克隆效率和获得转人溶菌酶基因克隆猪,研究了不同电激活参数和化学辅助激活方法对猪克隆胚胎和孤雌胚胎体外发育的影响.结果发现:电场强度会显著影响克隆胚胎的融合率和体外发育能力(P<0.05),电脉冲次数对克隆胚胎体外发育促进作用不显著(P>0.05),而相同电激活条件下克隆胚胎和孤雌胚胎的体外发育能力变化趋势不同;电激活后再利用放线菌酮+细胞松弛素B(CHX+CB)处理4 h能显著提高克隆胚胎的囊胚率(P<0.05),而用二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)处理没有提高克隆胚胎囊胚率(P>0.05),但6-DMAP或CHX+CB处理均可显著提高孤雌胚胎的囊胚率(P<0.05).上述结果表明,最佳的孤雌激活条件并不一定是克隆胚胎的最佳激活条件.本研究中猪克隆胚胎的最佳激活方法为1.6 kV/cm、100μs、2次直流电脉冲间隔100μs,再辅以CHX+CB处理4 h.利用优化的激活条件成功获得了乳腺特异表达人溶菌酶的转基因猪,为猪转基因育种奠定了基础.