适配子对人类免疫缺陷病毒的抑制作用

人类免疫缺陷病毒在机体细胞内不断复制并发生变异,以拮抗外界环境发生的变化。尽管高效抗逆转录病毒治疗方案(HAART)在治疗艾滋病方面取得了较大进展,但该疗法服用方法复杂、副作用较大及药物价格昂贵,因此仍需要开发新的方法来治疗HIV-1感染。最近备受关注的是适配子为基础的疗法。适配子具有特异性高、靶标单一和通用性等特点,可将其用于治疗多种疾病。在本文中,我们将介绍核酸适配子抗HIV-1作用的研究进展,并讨论抗HIV-1核酸适配子的应用前景及面临的挑战,为开发新的抗HIV-1药物提供理论支持。     

随机单链DNA文库SELEX筛选寡核苷酸适配子方法的建立

指数富集配基的系统进化(SELEX)技术是一种新的组合化学技术.体外构建了一个长度为81 nt、含有35个随机序列的单链DNA(ssDNA)文库,优化了ssDNA文库扩增为双链DNA (dsDNA)文库的PCR反应条件.通过对比不对称PCR和生物素-链亲和素磁珠分离方法制备ssDNA文库的效果,确定了以生物素-链亲和素磁珠分离方法制备ssDNA.由于脱氧核糖核酸的疏水性导致ssDNA文库与硝酸纤维素滤膜的结合背景过高,因此选择以微孔板为介质,分离与靶蛋白结合的适配子.经过9轮循环筛选,随机ssDNA文库与丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(C蛋白)的结合率从0.5%上升到32.5%.     

抑制RANKL诱导破骨细胞分化的DNA适配子的筛选

目的:筛选能高特异性、高亲和力结合RANKL蛋白并有效抑制RANKL对破骨细胞诱导分化作用的DNA适配子。方法:首先,采用原核系统表达并纯化RANKL蛋白,通过SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential)技术从人工合成的单链随机寡核苷酸文库中筛选能高特异性、高亲和力结合RANKL蛋白的DNA适配子。然后,用RNAfolding sever software分析适配子空间结构,以ELISA检测DNA适配子和RANKL亲和力大小并筛选出亲和力最高的一组DNA适配子用以验证DNA适配子对RANKL诱导破骨细胞分化的抑制作用。结果:(1)成功在原核系统表达并纯化RANKL蛋白;(2)筛选出能高特异性、高亲和力结合RANKL蛋白的12个DNA适配子。(3)与对照组相比,不同浓度DNA适配子能明显抑制TRAP阳性破骨细胞数量(P0.05),且浓度越高抑制效果越明显。结论:成功筛选出的DNA适配子能特异性结合RANKL蛋白并有效抑制RANKL对破骨细胞的诱导分化功能。     

指数富集配基的系统进化原理及应用进展

过去十几年,指数富集配基的系统进化（SELEX）技术得到了充分的发展,目前已经成为在数量众多的靶分子中,高亲和性和特异性地确定适配子的一种崭新的方法.SELEX的流程即是人工合成随机寡核苷酸序列、适配子筛选、扩增、再循环的过程.在这一过程中,适配子修饰基团文库的应用使得SELEX流程更加经济、快捷、高通量.回顾了SELEX的研究和应用,期待着这一方法能够在理论和实践上得到进一步的发展.     

细胞特异性核酸适配体筛选新策略的研究进展

核酸适配体(aptamer)是在体外采用指数富集的配基系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)从人工合成的随机寡核苷酸文库中筛选得到的一段寡核苷酸序列(RNA或DNA),能折叠成特定的三维空间结构同靶物质进行高特异性与高亲和性的结合。近年来,以全细胞为靶标筛选(cell-SELEX)获得的核酸适配体在疾病相关的领域有很大的应用潜力,尤其在细胞分子的识别、生物标志物的发现等方面,但cell-SELEX的过程复杂、难度大及获得的核酸适配体性能不佳等问题仍然制约着细胞特异性核酸适配体的进一步发展,如何高效地筛选获得核酸适配体是其应用的关键。本文总结了目前在cell-SELEX技术基础上发展起来的新方法、新策略及核酸适配体在肿瘤研究中的应用,望为相关科研人员的研究提供参考。     

基于适体技术的桔青毒素检测方法的建立

桔青毒素（citrinin,CTN）是以玉米、谷物、奶酪等为主要成分的食品和动物饲料中常见的、由桔青霉菌产生的酮类真菌毒素,可引起人和动物的慢性中毒或癌症,一直缺少灵敏的快速检测方法。本文通过指数富集适体系统进化技术（简称SELEX）对可能与CTN结合的特异性适体进行了筛选,经过15轮循环,得到17条适体。通过二级结构分析、亲和力检测发现适体13（Apt-13）对CTN有较好的亲和度,解离常数Kd为0.06μmol/L。进一步利用非荧光标记染料PicoGreen,利用其与双链DNA结合的原理,建立了桔青毒素非标记荧光检测方法,30min完成检测,最低检测限达到国家标准（50ppb）且与其他毒素无交叉反应。本研究建立的基于适体的桔青毒素检测技术成本低,可以替代传统的基于抗体的检测方法,为霉菌毒素的精准检测技术的开发提供了实验证据。     

核酸适配体在肿瘤免疫治疗中的应用

核酸适配体是指通过指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)技术得到的一种可以高特异性、高亲和性识别靶标物质的单链DNA或RNA,可以作为靶向性治疗的分子探针。指数富集的配体系统进化技术即SELEX技术是在体外合成一个随机序列的文库,通过4个步骤孵育、分离、回收、扩增即可获得相对应的核酸适配体。通过几十年的发展,如今SELEX技术已成为一种重要的研究手段。核酸适配体具有稳定性强、分子量小、易进行化学合成和修饰、能特异性结合包括从小分子到细胞等靶标,识别范围广等优点,被广泛应用在肿瘤领域。免疫治疗与传统的肿瘤治疗方式不同,它是增强机体自身免疫系统来达到清除体内肿瘤细胞的一种方式,已被临床证明是治疗多种癌症的有效方法,例如针对免疫检查点CTLA4和PD-L1/PD-1的抗体,临床试验取得了成功,这为肿瘤的治疗带来了新的思路方法。目前,相关的免疫治疗药物已经上市应用于临床治疗,但是通过免疫治疗获益的肿瘤患者相对较少且会产生严重的副作用。核酸适配体与免疫相结合,为肿瘤的治疗提供了...     

灭活铜绿假单胞菌适体的筛选

利用指数富集配基的系统进化(SELEX)技术,以灭活的铜绿假单胞菌为靶标,从体外合成的96 nt随机ssDNA文库中筛选与铜绿假单胞菌特异结合的适体.在第12轮和第14轮与其它假单胞菌属进行反筛策略,并进行了适体的结合亲和力的测定,再分别利用ClustalX、Mega2和Mfold sever软件分析适体的一级和二级结构.研究结果表明,经过15轮筛选,随机ssDNA文库与铜绿假单胞菌结合的A值从0.022上升到0.448.反筛与未反筛的结合A比值最高比为53倍.经过第15轮反筛后的24个阳性克隆子测序,根据软件分析,其可分成10个家族.每个家族都有其共同的保守序列（除第10个家族）,其中有2条序列几乎完全一致(F23和F47),同源性达到97%,A值分别高达1.598和1.508,Kd为14.55和77.46 nmol/L,间接说明适体与铜绿假单胞菌的结合力明显增高.     

RNA适体研究及其在医药上的应用

核酸适体（nucleic acid aptamer）是从人工合成的随机单链核酸库中筛选出的特异性与靶物质高度亲和的核酸分子,包括DNA适体和RNA适体. 体外获得核酸适体的方法称为指数富集配体系统进化技术,即SELEX（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）. 在SELEX技术获得的核酸适体中,RNA适体因其结构的多样性而具有靶分子广、亲和力高、特异性强等特点. 同时,相比传统抗体,RNA适体分子量小、易改造修饰、制备方便且无免疫原性. 因此,RNA适体在基础研究、临床诊断、药物研制等方面展现了广阔的应用前景. 本文综述了RNA适体的产生、特点、作用方式、优势与局限性,并详细介绍了其在医药研究领域的应用.     

金黄色葡萄球菌外毒素B特异性适体的筛选及其应用

目的:利用指数富集配基的系统进化(SELEX)技术,筛选能与金黄色葡萄球菌外毒素B(SEB)特异、高亲和力结合的单链DNA(ssDNA)适体,并将该适体应用于患者血清标本的检测。方法:从体外合成的96核苷酸随机ss-DNA文库中,以羧基磁珠作为筛选介质,经逐步PCR扩增、筛选,获得针对SEB的高亲和力、高特异性适体;利用荧光素标记适体测定筛选过程中各轮结合力;利用酶连接适体方法检测适体特异性和结合力。结果:经过13轮筛选,ssDNA文库与SEB的结合百分率从1.1%提高到39.8%,增加了36倍;获得的ssDNA适体(A11)针对SEB的特异性强,与金黄色葡萄球菌表面蛋白A(SPA)结合低,并能初步识别患者血清。结论:利用SELEX技术筛选获得了特异结合SEB的高亲和力的ssDNA适体,为金黄色葡萄球菌的临床诊断与治疗奠定了基础。     

Production of Guanosine by Psicofuranine and Decoyinine Resistant Mutants of Bacillus subtilis

Growth of Bacillus subtilis AG169 that produced large amounts of xanthosine and guanosine was inhibited by psicofuranine. When AG169 was mutated to resistance against psicofuranine, a mutant, GP–1, which yielded more guanosine was obtained. Psicofuranine did not inhibit growth of GP–1 any more. The guanosine 5′-monophosphate (GMP) synthetase activities were then assayed. In GP–1, the specific activity decreased about half, the complete loss of repression by GMP was found, and the inhibition by GMP was slightly loosed, when compared with those of AG169.

Furthermore, as growth of GP–1 was strongly inhibited by decoyinine, decoyinine resistant mutants were derived from GP–1. Of these mutants, two strains, MG–1 and MG–4, were resistant to decoyinine completely and showed the exclusive accumulation of guanosine in high yields, i.e. 16.0 and 15.5 g of guanosine per liter with weight yields of 20.0 and 19.4% of consumed sugar, respectively. GMP synthetase activity of MG–1 increased remarkably in comparison with that of GP–1 or AG169, and the inhibitions by GMP, psicofuranine and decoyinine were completely released in MG–1. Namely, the psicofuranine and decoyinine resistances seemed to cause mainly variations of GMP synthetase, and as results, the conversion of xanthosine 5′-monophosphate (XMP) to GMP proceeded more smoothly, and a larger amount of guanosine was accumulated.     

SELEX技术在病毒感染诊断和治疗中的应用

指数富集的配体系统进化（SELEX）技术是一种新的组合化学技术,它利用人工合成的随机寡核苷酸文库,通过体外多轮筛选与扩增,获得能与靶物质特异性结合的寡核苷酸适体。适体的靶分子广泛,包括病毒代谢相关产物,且与靶物质结合的亲和力高、特异性强,在体内代谢及稳定性等方面优于抗体。在细胞和动物模型中,适体显示出很多优于抗体的特性,而且已经有适体作为药物进入临床试验阶段。这种体外筛选技术是一种较成熟的技术,由此产生的适体具有较好的理化特征,可以抑制病毒复制感染的各个阶段,而且在病毒感染所引发的相关疾病诊断和治疗等方面具有较好的应用前景。     

Development of α4 integrin DNA aptamer as a potential therapeutic tool for multiple sclerosis

One of the most important molecules for multiple sclerosis pathogenesis is α4 integrin, which is responsible for autoreactive leukocytes migration into the brain. The monoclonal antibody, natalizumab, was introduced to market for blocking the extravasation of autoreactive leukocytes via inhibition of α4 integrin. However, the disadvantages of antibodies provided a suitable background for other agents to be replaced with antibodies. Considering the profound advantages of aptamers over antibodies, aptamer isolation against α4 integrin was intended in the current study. The α4 integrin-specific aptamers were selected using cell-systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) method with human embryonic kidney (HEK)-293T overexpressing α4 integrin and HEK-293T as target and control cells, respectively. Evaluation of selected aptamer was performed through flow cytometric analysis. The selected clones were then sequenced and analyzed for any possible secondary structure and affinity. The results of this study led to isolation of 13 different single-stranded DNA clones in 11 rounds of selection which were categorized to three clusters based on common structural motifs and the equilibrium dissociation constant (K _d) of the most stable structure was calculated. The evaluation of SELEX progress showed growth in aptamer affinity with increasing of the number of cycles. Taken together, the findings of this study demonstrated the isolation of α4-specific single-stranded DNA aptamers with suitable affinity for ligand, which can further be replaced with natalizumab.     

应用双向热循环消减SELEX技术筛选胃癌血清核酸适配体

胃癌是发病率及死亡率均较高的消化道恶性肿瘤之一,严重威胁人类的生命健康。血清肿瘤标志物的检测对提高早期胃癌的检出率,改善胃癌的治疗有重要的意义。核酸适配体以其灵敏度高、靶向性强等优势显示出了较强的临床适用性。本研究以双向热循环消减指数富集式配基系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术为支持,纳米（琼脂）磁珠材料为载体,胃癌血清及正常人血清为筛选靶标,结合高通量测序技术建立了快速高效的核酸适配体筛选方法。经过19轮双向筛选,获得高重复率的胃癌血清特异性核酸适配体序列10条及正常人血清特异性核酸适配体序列8条。将这些序列分别混合并制成检测试剂A、B,结合实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qPCR）技术,对100份临床血清样本进行特异性验证。通过比较分析,建立了快速高效的胃癌血清检测技术。结果显示,核酸适配体G AP1与N AP1的二级结构类似于抗体的“Y”型,且呈茎环状。检测试剂A、B对胃癌及正常人血清的检出率分别为92%和88%。表明本技术可以较准确地筛选得到高特异性和强亲和力的核酸适配体,体现了核酸适配体作为新型肿瘤标志物在临床检测及治疗的应用潜力。