产乙醇酸氧化酶的重组毕赤酵母的构建及催化合成乙醛酸的研究

乙醇酸氧化酶（Go）是植物光呼吸途径中的一种关键酶,可以催化乙醇酸生产乙醛酸。从新鲜菠菜叶中提取总RNA,利用RT-PCR技术获得编码GO基因的cDNA片断。通过基因重组将GO基因克隆到载体pA0815中,构建了胞内表达载体pA0815／GO,重组质粒经电转整合至甲醇营养酵母GS115染色体。在混合碳源为10g/L山梨醇和0．5g/L甲醇的培养条件下,细胞的GO酶活达到474IU／g（DCW）。利用该重组毕赤酵母作为催化剂生产乙醛酸,结果表明：在乙醇酸浓度为0．25mol／L,重组酵母湿菌体为10dL,黄素单核苷酸（FMN）浓度为0．01mmol／L,pH8．0,20℃,反应18h后乙醛酸的产率达到51．8％。     

利用木糖和葡萄糖合成乙醇的新型重组大肠杆菌的研究

利用PCR方法从运动发酵单孢菌染色体DNA扩增出乙醇合成途径的关键酶基因pdc、adhB,分别用tac启动子控制表达,构建了可以在Escherichia coli JM109中表达的重组质粒pKK-PA、pEtac-PA.初步的乙醇发酵结果表明,在E.coli中只引入adhB基因不能拓宽其中的产乙醇途径,引入pdc基因可以与宿主自身的ADH酶协同作用,使碳流有效导向产乙醇方向.同时引入pdc、adhB基因可以在宿主E.coli中成功建立产乙醇途径.     

木糖发酵重组菌研究进展

木糖发酵是植物纤维原料生物转化制取乙醇商业化生产的基础和关键 ,但自然界存在的微生物菌株不能满足商业化生产的需要。利用基因工程技术对细菌和酵母进行改造 ,以提高它们在厌氧条件下的木糖发酵能力成为目前研究和开发的重点。通过转基因和基因删除技术 ,主要对Escherichiacoli、Zymomonasmobilis、Pichiastipitis和Saccharomycescerevisiae等典型的乙醇发酵菌株实施基因改造 ,构建出一系列不同类型的木糖发酵重组菌株。与野生型菌株相比 ,重组菌株在厌氧条件下的木糖发酵能力得到了不同程度的改善 ,但是它们仍然未能投入于商业化生产。微生物的木糖代谢工程和木糖发酵重组菌株的构建有待于进一步的深入研究 。     

重组肠道细菌作为产乙醇生物催化剂的研究进展

以木质纤维素水解液发酵生产的燃料酒精作为一种清洁的可再生能源引起人们极大的关注。本文介绍了燃料酒精工业发展的最新动态,并对多种产乙醇重组肠道细菌的研究进展作了综述。     

基于基因组DNA诱变的遗传重组改造乙醇工业酵母的耐热性及发酵性能

酵母菌是乙醇发酵工业中非常重要的微生物细胞工厂,发酵过程中温度变化胁迫一直是影响生产效率的重要瓶颈之一,选育具有广泛温度适应性的酵母菌株对提高发酵性能和降低生产成本具有重要意义。通过化学诱变和基于基因组DNA诱变的遗传重组技术对乙醇工业酵母菌的温度适应性进行改造,获得耐热性能和发酵性能得到提高的重组酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae T44-2。重组菌株T44-2的最高生长温度比原始菌株CE6提高了3 ℃,48 ℃和52 ℃热激处理1 h,重组菌株的细胞存活率分别是原始菌株的1.84     

重组酵母菌乙醇脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的:克隆产麻黄碱重组酵母菌乙醇脱氢酶基因片段,并对其进行序列分析,为研究该基因在重组酵母中与麻黄碱生物合成途径的关系提供参考.方法:根据一段利用抑制差减杂交技术获得的来源于重组酵母乙醇脱氢酶基因片段,采用RACE的方法扩增Adh基因,使用分子生物学软件对该基因进行生物信息学分析.结果:获得一段大小为1 245 bp的基因片段,编码375个氨基酸,含有两个催化域和两个锌结合域,与来源于Gandida boidinii ADH3基因的同源性为85％.结论:克隆的基因为乙醇脱氢酶基因,并在GenBank注册,登录号为JF293468.     

日本育成葡糖淀粉酶重组酵母菌

1986年在大阪召开的大阪发酵工程学年会上,三得利啤酒公司应用微生物研究所和酒类研究所发表了一项研究成果。用DNA组入染色体的方法选育成功稳定的基因重组酵母菌。将根霉的葡糖淀粉酶基因组入乙醇发酵能力接近于生产菌的酵母菌中,使其分泌产生葡糖淀粉酶,而无需加热处理(无蒸煮)就能由淀粉产生13％以上的乙醇。特别在用木薯淀粉为原料时分解率很高。转化为乙醇的产率与现行工业生产法相同。为使染色体中重组性能稳定,从小瓶到大容器重组体经数十代仍可稳定产生葡糖淀粉酶。 此重组体有可能在良好的通用发酵罐中实现工业化。该公司已实现用根霉的葡糖淀粉酶进行淀粉的无蒸煮乙醇生产,这种方法由淀粉产乙醇的能耗量约减少了三成。     

代谢工程与全基因组重组构建酿酒酵母抗逆高产乙醇菌株

将酿酒酵母海藻糖代谢工程与全基因组重组技术相结合,改良工业酿酒酵母菌株的抗逆性和乙醇发酵性能。对来源于二倍体出发菌株Zd4的两株优良单倍体Z1和Z2菌株进行杂交获得基因组重组菌株Z12,并对Z1和Z2先进行(1)过表达海藻糖-6-磷酸合成酶基因 (TPS1) ,(2)敲除海藻糖水解酶基因 (ATH1), (3)同时过表达 TPS1和敲除ATH1, 经此三种基因工程操作后再进行杂交获得代谢工程菌株的全基因组重组菌株Z12ptps1、Z12 Δath1和Z12pTΔA。与亲株Zd4相比,Z12及结合代谢工程获得的菌株在高糖、高乙醇浓度与高温条件下生长与乙醇发酵性能都有不同程度的改进。对比研究结果表明:在高糖发酵条件下,同时过表达 TPS1和敲除ATH1 的双基因操作工程菌株胞内海藻糖积累、乙醇主发酵速率和乙醇产量相对于亲株的提高幅度要大于只过表达 TPS1,或敲除ATH1 的工程菌。结合了全基因组重组后获得的二倍体工程菌株Z12pTΔA,与原始出发菌株Zd4及重组子Z12相比,主发酵速率分别提高11.4%和6.3%,乙醇产量提高7.0%和4.1%,与其胞内海藻糖含量高于其它菌株、在胁迫条件下具有更强耐逆境能力相一致。结果证明,海藻糖代谢工程与杂交介导的全基因组重组相结合,是提高酿酒酵母抗逆生长与乙醇发酵性能的有效策略与技术途径。     

发酵五碳糖和六碳糖产乙醇的细菌研究进展*

农作物废弃物中含有大量木质纤维素,经预处理或水解后能得到各种糖类的混合物,这些糖包括五碳糖和六碳糖(混合糖)。中报道了国内外近20年来在利用细菌发酵混合糖产乙醇方面的研究进展。重点介绍了几种重组大肠杆菌Escherichia coli和运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis利用混合糖产乙醇的特性。     

细菌重组系统及其应用研究进展

利用重组酶和辅助蛋白共同作用于DNA片段上,使不同基因重新组合以完成基因重组的现象在细菌中广泛存在,基因重组对于细菌的遗传多样性、进化等具有重要意义。目前,细菌基因重组主要分为同源重组、位点特异性重组和转座重组3种类型。本文主要对细菌重组系统重组酶的种类、作用机制及其在细菌遗传操作中的应用策略进行阐述。     

异源位点特异性重组系统在植物中的研究

现在对位点特异性重组系统佃ie－sPec们crecombinationsystem）研究的很多,它们都源于低等生物,由于都有独特的位点重组特异性,所以吸引了大批研究人员在真核生物中进行了广泛的研究。本文主要综述了在高等物中研究的位点特异性重组系统的来源、重组机理、重组方式、重组中存在的问题及位点特异性重组系统研究应用前景和意义等。回位点特异性重组系统位点特异性重组是指在重组酶介导下,在特异的重组位点间发生重组,导致重组位点间交互交换的一种精确。组形式。位点特异性重组始于对人噬菌体溶源化过程的研究。又噬菌体通过自身位点att…     

重组酶法定量分析吡咯喹啉醌

用ＤＥＡＥ－ｓｅｐｈａｃｅｌ和ＣＭ－ｃｅｌｕｌｏｓｅ柱层析的方法从Ｃｏｍａｍｏｎａｓｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ菌体中纯化得到一定纯度的脱辅基的乙醇脱氢酶。在含３ｍＭＣａＣｌ２的Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ缓冲液（２０ｍＭ,ｐＨ７．０）中,该酶能与ＰＱＱ重组成有活性的全酶,测出的全酶活性大小与外加ＰＱＱ的量成正比,从而定量分析ＰＱＱ。该法专一、灵敏、可靠。     

利用不同启动子控制木糖代谢关键酶基因构建可共代谢葡萄糖木糖重组酿酒酵母

利用不同强度的启动子调控木糖代谢关键酶活性,构建稳定代谢葡萄糖和木糖产乙醇的重组酿酒酵母。以本实验室专利菌株Saccharomyces cerevisiae Y5为宿主菌,将树干毕赤酵母Pichia stipitis CBS6054的木糖还原酶基因XYL1和木糖醇脱氢酶基因XYL2置于磷酸甘油酸激酶基因启动子(PGKp)控制下,酿酒酵母Y5内源的木酮糖激酶基因XKS1分别由己糖激酶基因启动子(HXK2p)及其内源启动子(XKS1p)控制。这3个基因连同各自表达元件导入宿主细胞中,打通其木糖上游代谢途径。酶活测定结果显示,HXK2p对木酮糖激酶表现出更强的启动效率。重组菌Y5-X3-1中木糖还原酶/木糖醇脱氢酶/木酮糖激酶(XR/XDH/XK)的酶活比值为1∶5∶4,其木糖消耗量是宿主菌的5倍,最高乙醇产量为24.35 g/L,达到理论值的73%。结果表明,通过调节XYL1、XYL2及XKS1启动子的强度,调控其表达水平,进而改变3种酶的活性水平,对于提高重组酿酒酵母利用木糖发酵产乙醇有明显效果。     

嗜热厌氧乙醇杆菌α-葡萄糖苷酶基因的表达及酶学性质的研究

用PCR方法从嗜热厌氧乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)JW200中扩增出编码a-葡萄糖苷酶的基因,将其克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pTrc99A上并获得表达a-葡萄糖苷酶的大肠杆菌重组菌。重组菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测出蛋白相对分子量约89kDa,经阴离子交换层析和凝胶层析纯化后的a-葡萄糖苷酶最适反应温度为70℃,最适反应pH为5～5.5,且在pH 5.5～6.5之间有较高的稳定性。重组a-葡萄糖苷酶在70℃下105 min后酶活仍达到80%。     

重组胶原蛋白的产业发展历程和生物医学应用前景展望北大核心CSCD

重组胶原蛋白作为天然动物组织胶原的替代物具有广泛应用于生物材料、生物医学等领域的潜力。种类繁多的重组胶原蛋白类型及其衍生体在多种表达系统中可实现一定规模的产业化生产,为探索和拓展重组胶原蛋白的临床应用奠定了基础。文中简述了重组胶原蛋白的不同表达体系,如大肠杆菌、酵母、植物、昆虫、哺乳动物和人类细胞表达体系,重组胶原蛋白的优势及潜在的应用和局限。着重介绍了目前重组胶原蛋白生产,包括不同表达体系的构建策略和重组胶原蛋白羟基化修饰等方面的研究进展,总结了重组胶原蛋白在生物医药领域的应用及应用基础研究和应用前景展望。     

植物基因同源重组研究现状

同源重组是普遍存在的生物学现象,从噬菌体、细菌到真核生物均有存在。它对生物的遗传与变异具有重大影响,一直是生物学家研究的热点。本文从染色体外同源重组、染色体内同源重组以及基因打靶三个方面综述了同源重组在植物方面的研究现状。从分子水平上较详尽的介绍了同源重组发生的机制以及同源重组在生物领域的应用、前景展望及其存在的局限性。     

关于遗传学中有丝分裂重组的理解

有丝分裂重组是遗传学的重要内容,但当前遗传学教学中对有丝分裂重组部分的课堂教学较少。从有丝分裂重组的发现、真菌系统中的有丝分裂重组、有丝分裂重组作图等几个方面较为详细的介绍了有丝分裂重组现象,希望为教师课堂教学提供参考,并有助于学生对基因重组内容的全面认识。     

Red体内同源重组介导的egfp、kan基因融合和重组质粒构建

重组工程是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,可应用于靶DNA序列的敲入、敲除和基因克隆等。在应用重组工程技术进行基因亚克隆时发现,体外重叠PCR法难以获得高质量的目的DNA打靶片段,严重影响重组效率。为了解决上述问题,根据Red重组酶介导的体内同源重组工作原理进行了技术改进。先用PCR方法合成egfp和kan两条末端互补的线性DNA片段,然后将其电击共转化进入携带Red重组酶和pcDNA3．1载体DNA的大肠杆菌DY331菌株内,经体内同源重组直接产生的pcDNA3.1—egfp-kan环状重组质粒DNA分子可通过抗生素标记筛选获得,阳性率可达到45％。瞬时转染pcDNA3．1-egfp-kan可获得绿色荧光蛋白在293细胞中的表达。