KPNB1和Ran蛋白共同介导新城疫病毒基质蛋白的入核转运

【目的】鉴定与新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基质蛋白(matrix protein,M)入核相关的细胞蛋白,以阐明NDV M蛋白细胞核定位的分子机制。【方法】从鸡胚成纤维细胞中分别克隆核转运受体蛋白KPNA1–KPNA6和KPNB1基因,将其构建到真核表达载体,并与表达NDV M蛋白的重组真核表达载体分别共转染HEK-293T细胞,通过免疫共沉淀方法鉴定与NDV M蛋白相互作用的核转运受体蛋白。另外,将M蛋白与Ran蛋白突变体或与M蛋白互作的核转运受体蛋白缺失体分别共表达,通过荧光共定位确定M蛋白入核转运相关的细胞蛋白。【结果】构建的重组真核表达载体在HEK-293T细胞中能够正确表达;通过间接免疫荧光观察发现,重组蛋白中除Myc-KPNA2蛋白定位在细胞质外,其它核转运受体蛋白均与M蛋白表现出相同的细胞核定位。免疫共沉淀试验结果表明,M蛋白与KPNA1蛋白和KPNB1蛋白均存在相互作用。进一步通过荧光共定位观察发现,M蛋白与KPNA1蛋白缺失体(DN-KPNA1)共表达不改变M蛋白的细胞核定位,而与KPNB1蛋白缺失体(DN-KPNB1)共表达后导致M蛋白变为细胞质定位,说明M蛋白入核转运需要KPNB1蛋白的参与。另外,将M蛋白与Ran蛋白突变体Ran-Q69L共表达,荧光观察发现M蛋白同样由细胞核定位变为细胞质定位,说明M蛋白入核转运还需要Ran蛋白的辅助。【结论】KPNB1和Ran蛋白共同介导NDV M蛋白的入核转运,其过程是KPNB1蛋白首先和M蛋白发生相互作用并形成复合物,然后通过Ran蛋白的辅助作用完成入核转运。     

SARS冠状病毒Mc区原核表达及包涵体复性的研究

构建SARS冠状病毒M蛋白膜内区(Mc蛋白)基因(Mc区)融合表达载体,表达并复性该蛋白。克隆Mc区,构建融合表达载体pET-32a(+)/Mc,融合表达Mc蛋白。纯化表达蛋白,采用逐步透析、降低蛋白浓度、加入氧化还原剂复性融合蛋白。用复性蛋白免疫兔产生抗血清,复性蛋白与SARS患者血清和健康人血清反应鉴定复性结果。结果显示,复性蛋白免疫家兔后产生抗血清,该复性蛋白与SARS患者血清特异结合,表明已成功复性该表达蛋白。为SARS疫苗和诊断试剂的研制奠定基础。     

分枝杆菌特征性蛋白的筛选

目的研究分枝杆菌蛋白表达,筛选分枝杆菌特征性蛋白,为分枝杆菌的快速鉴定奠定基础。方法选取分枝杆菌标准菌株,提取细菌蛋白,干化学法测蛋白浓度,应用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术（SELDI-TOF-Ms）检测分枝杆菌蛋白表达,和非分枝杆菌蛋白指纹图谱比较,筛选分枝杆菌特征性蛋白。重复测定20次分枝杆菌蛋白标本,评价SELDI检测分枝杆菌蛋白分子量的重复性。结果耻垢分枝杆菌ATCC 14468有约20个蛋白峰,结核分枝杆菌ATCC 25177、土地分枝杆菌ATCC 15755、胞内分枝杆菌ATCC 13950、耻垢分枝杆菌ATCC 607有近40个蛋白峰。与非分枝杆菌蛋白指纹图谱相比,4个蛋白峰为分枝杆菌所特有。SELDI重复检测20次分枝杆菌蛋白标本显示同一蛋白峰的分子量变异系数≤0．05％。结论分枝杆菌有其特征性蛋白峰,可能有助于分枝杆菌的快速鉴定。     

SARS病毒S和N蛋白抗原表位的基因合成、融合表达及纯化鉴定

通过计算机分析SARS病毒N蛋白和S蛋白的氨基酸序列 ,初步确定含强抗原表位的N蛋白片段和S蛋白片段 ,共 5 6 0个氨基酸。选择真核和原核生物均偏爱的密码子 ,化学合成全新的SARS病毒N蛋白片段和S蛋白片段的基因序列 ,利用基因工程技术将两个基因片段串联 ,克隆至质粒Pet2 8a(+)内的NcoⅠ/EcoRⅠ位点 ,表达S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3) ,筛选获得了高效表达SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段融合蛋白的工程菌 ,表达的SARS病毒的融合蛋白约占菌体蛋白总量的 30 %左右 ,部分以可溶性形式存在。经离子交换柱和反相高压液相纯化获得了表达的融合蛋白 ,经初步鉴定 ,显示该融合蛋白有较好的抗原性和特异性.     

水分胁迫对小麦叶绿体色素蛋白复合体的影响

水分胁迫可抑制激发能向ＰＳⅡ传递,降低ＰＳⅡ捕光色素蛋白复合体、ＰＳⅡ内周天线色素蛋白复合体以及ＰＳⅠ捕光色素蛋白复合体和ＰＳⅠ反应中心叶绿素ａ 蛋白复合体的含量,其中以ＰＳⅡ色素蛋白复合体含量下降幅度较大。类囊体膜多肽分析表明,水分胁迫使属于ＰＳⅡ捕光色素蛋白复合体的２５ ｋＤ蛋白、ＰＳⅡ内周天线色素蛋白复合体的４３ ｋＤ 和４７ ｋＤ蛋白以及ＰＳⅠ捕光色素蛋白复合体的２１ ｋＤ蛋白含量降低,尤以２５ ｋＤ蛋白含量降幅最大。     

IMPACT-TWIN蛋白纯化系统的机制及其应用

IMPACT-TWIN系统是一种新型的蛋白融合表达及纯化系统,已被应用到蛋白质工程的众多领域。此系统中目的蛋白与蛋白自剪接元件intein及几丁质结合蛋白域CBD构成融合蛋白,利用几丁质亲和层析柱,通过诱导内含肽的肽键裂解活性,使目的蛋白释放出来,而内含肽与几丁质结合蛋白仍结合在几丁质介质上,实现了单柱分离纯化蛋白。本文主要阐述了IMPACT-TWIN蛋白表达纯化系统的机制、特点,以及其在蛋白表达纯化方面应用的最新进展。     

全基因组预测目标基因的新方法及其应用

运用隐马尔可夫模型, 利用Perl编程, 以几种模式生物的蛋白质数据库为基础, 构建了目标基因的全基因组预测的新方法。该方法具有高通量, 准确度高且操作简易等优点, 特别在多结构域蛋白家族预测上更显优势。应用该方法对几种模式生物的全基因组PPR和TPR蛋白家族进行了预测, 其中粳稻日本晴中含有536个PPR蛋白、199个TPR蛋白; 籼稻9311中含有519个PPR蛋白、177个TPR蛋白; 拟南芥中含有735个PPR蛋白、292个TPR蛋白; 红藻中6个PPR蛋白、32个TPR蛋白; 蓝细菌以及古细菌中没有PPR蛋白, 但蓝细菌含有10个TPR蛋白, 古细菌有4个TPR蛋白, 并对所得结果进行了进一步生物信息学分析。     

羊布鲁氏菌的分泌蛋白质组分析

分泌蛋白是指那些分泌到细胞外的蛋白质。布鲁氏菌的分泌蛋白可能介导了病原与宿主之间的相互作用, 在布鲁氏菌的毒力方面发挥一定的作用, 但是研究方法的局限性限制了分泌蛋白的研究。本文报道了利用蛋白质组的方法来寻找羊布鲁氏菌的分泌蛋白。首先用TCA-丙酮法提取布鲁氏菌培养上清中的分泌蛋白, 双向电泳进行分离, 然后用质谱来鉴定这些蛋白, 最终鉴定到40种蛋白。通过生物信息学分析, 发现这些蛋白主要是ABC转运系统的底物结合蛋白、外膜蛋白和热休克蛋白。这些蛋白的识别不仅有助于对布鲁氏菌致病机制的理解, 而且也可为     

谷物醇溶蛋白研究进展

目前研究较多的谷物醇溶蛋白有玉米醇溶蛋白、小麦醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白及大米醇溶蛋白等,本文综述了近年来对谷物醇溶蛋白的研究进展,包括谷物醇溶蛋白的提取方法、理化性质及应用领域等。     

人巨细胞病毒即刻早期蛋白1对白血病蛋白致癌基因结构域的作用研究进展

白血病蛋白致癌基因结构域是间期细胞核内的亚核结构域,是DNA病毒入侵、转录及复制的关键部位,其完整性对病毒感染至关重要。早幼粒细胞性白血病蛋白是白血病蛋白致癌基因结构域的主要蛋白,负责维持其他白血病蛋白致癌基因结构域蛋白的正确定位。为DNA肿瘤病毒的人巨细胞病毒即刻早期蛋白可靶向定位白血病蛋白致癌基因结构域,并使早幼粒细胞性白血病蛋白从白血病蛋白致癌基因结构域移出,从而破坏其完整性。研究病毒对白血病蛋白致癌基因结枸域的作用有助干阐明该娄病毒与细胞转化和肿瘤发生的联系。