核酸及蛋白质合成、提取、纯化

930378质粒DNA的■促纯化[英]/Isfort,R.J./BioTechniques.一1992,12(6).一798---804[译自DBA,1992,11(15),92-08366] 本操作只需2小时,不用昂贵设备,花钱少。如此提纯的质粒DNA可用于限制性酶切,.克隆、亚克隆、定序、缺口平移分析和末端标记。用此法纯化的质粒为MSVcL,它含有野生型p53肿瘤抑制子基因。培养携该质粒的大肠杆菌,细胞用碱裂解处理后离心,再用酚·氯纺(1 t 1)和异丙醇处理细胞团。离心后将细胞困重悬于50raM Tris—HC。l’(pH8,含30mM MgCII、O.5raM ATP和10m。|yI磕基乙醇,总体积1 m1)。加20/,I酶液(含100U R…     

核酸及蛋白质合成、提取、纯化

920805通过酚抽提法从服硫氛酸中纯化质粒〔英〕/Fishe-r,J .A.…了Anal.Bioehem一1991,194(2)一309~315【译自DBA,1991,10(15),91-08441〕 该方法利用自动核营酸提取设备。基本操作是于pH4.5时用酚从IM的脏氰酸中进行抽提,这样能从水相中有效地去除染色体DNA,而超螺旋的质粒DNA仍留在水相中。51核酸酶消化表明,去除的染色体DNA已经变性,因而可溶于有机相。整套方法包括:用溶菌酶、RNA酶A和蛋白酶K连续预处理细菌细胞;消化后的溶液用酚/氯仿十水混合物抽提二次,再用氯仿抽提一次。通过异丙醇沉淀收集纯化的质粒。这样提纯的质粒中…     

核多角体病毒感染昆虫细胞的DNA拓扑异构酶性质的研究

核多角体病毒(Nuclear polyhedrosis virus)的核酸是双股环状DNA,在病毒颗粒中呈超螺旋状态。超螺旋DNA复制时,一般皆有超螺旋解旋过程。为了解这一机制,本文报道了从NPV感染的家蚕中肠组织中分离细胞核,经过羟基磷灰石、磷酸纤维素柱层析,ssDNA-纤维素亲和层析,纯化了DNA拓扑异构酶I,SDS-PAGE测定分子量为47kd,最适Mg~(++)浓度约为5mM。AcNPV感染的TN368细胞DNA拓扑异构酶I总活力较正常细胞酶活力高1～3倍,且活力的提高与病毒增殖平行。讨论了昆虫细胞DNA拓扑异构酶I的性质及其与NPV复制的关系。     

ATP依赖的人Lon蛋白酶的表达、纯化及其活性鉴定

ATP依赖的人Lon蛋白酶是一种同质寡聚、环状的蛋白酶,主要位于细胞线粒体基质中。许多研究表明,Lon蛋白酶对于维护细胞的内环境稳定起着重要作用,并参与线粒体蛋白质量控制和代谢调控。将pPROEX1 His6-Lon重组质粒在Escherichia coli Rosetta 2菌株中诱导表达用Ni2＋柱亲和层析法纯化,获得纯度较高的目的蛋白。经纯化后,Lon蛋白酶的比酶活达到0.17 U/mg。通过多肽底物Rhodamine 110、bis-（CBZ-L-alanyl-L-alanine amide）[（Z-AA）2 Rh110]的降解检测显示,Lon蛋白酶具有肽酶活性,并被ATP所刺激。Casein和线粒体转录因子A降解实验表明,纯化的Lon蛋白酶具有蛋白水解活性,而且蛋白水解活性依赖于ATP。     

动物遗传工程

950321毫■中K-酪蛋白遗传变异的测定[专,俄]/last.Gen.Genet.,Res.Inst.Physi01.Bio—chem.Nutr.Farm—Animals/SU 1659—488:31.03.89一SU一672018(30.06.91)31.03.89 aS 672018.92—112277/14(3页)[译自DBA·1992。11(13),92‘075333一 方法是·由血细胞分离染色俸DNA(O.5～1.0Pg),对目的DNA”段进行PCR。膳因片段禽HindliT和Taq I多形性限制位点。PCR中使用DNA~I物SGE23TATCATTTA TGGCCA TTGGACCA和SGO 24TTGAGATTCCTCTGTAGTTT GTTC。用HindⅢ和Taq I酶消化扩增的DNA产物,用PAGE鉴别消化产物…     

核酸及蛋白质合成、提取、纯化

924277染色体组ONA的微里提取:筛选大纽样品的方法〔英〕/Ramirez一50115,R.…了Anal.Bioe-五em一1992,201(2)一331一335[译自DBA,1992,11(12),92一06617〕 在制备的全过程中使用的是一种有96个穴的组织培养盘。用多管移液器便于同时分析多份样品。96种样品(即单个细胞培养物集落悬浮液)被培养在由明胶覆盖的96穴培养盘中,用磷酸盐缓冲液洗两次。用iomM Tris(pH7.5)、iomM EDTA、iomM NaCI、0.5%Saroosyl和img/。l的蛋白酶K在60℃处理过夜,使细胞裂解。将上清液倒出,用70%乙醇将盘洗三次,然后凤千。纯DNA可直接用限制酶消化、上…     

一种高效可直接用于PCR分析的土壤总微生物DNA抽提方法

以CTAB-溶菌酶-蛋白酶K-冻融裂解法直接抽提土壤总微生物的基因组DNA,利用G8000沉淀和纯化DNA.结果表明,该方法是一种简便、有效可直接应用于PCR分析的土壤总微生物基因组DNA的抽提方法.采用含聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的缓冲液预洗,添加CaCl₂和BSA,可以去除腐殖酸;用PEG8000沉淀DNA,可以提高DNA质量;采用冻融法破碎细胞,CTAB、溶菌酶和蛋白质酶K共同作用以裂解细胞,可以保证获得大片段的DNA,提高DNA产率.用该方法抽提的七子花林下土壤总微生物DNA产率为9.22 μg·g^-1,A260/A280为1.65,可适用于 PCR扩增及扩增rDNA限制酶切分析(ARDRA)技术,适宜的模板DNA浓度为0.67 ng·μl^-1.快速、有效、可直接用于PCR分析的土壤总微生物DNA提取方法的建立,为大规模的土壤微生物分子生态学研究提供了可能.     

环状RNA调控TBK1表达影响肿瘤发生发展

TANK结合酶1(TANK-bindingkinase 1,TBK1)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,在机体先天免疫调节、细胞选择性自噬、细胞凋亡、细胞再生中发挥重要作用,与肿瘤的发生密切相关.环状RNA(circle RNA,circRNA)是新型的闭合环状非编码RNA,其生物功能及与肿瘤的联系受到国内外学者广泛关注.近年...     

喜树碱对人类巨细胞病毒诱发染色体畸变的频率的调节效应

本文评价了所选用的DNA修复抑制剂对人类巨细胞病毒(HCMV)诱发外周血淋巴细胞(PBLs)染色体畸变频率的影响。以拓扑酶Ⅰ的一种抑制剂——喜树碱(0.05—0.3μg/m1)处理HCMV感染的人类PBLs30小时,结果导致HCMV诱发的染色体损伤频率显著的协同性增加(P<0.O1)。另一方面以ADP核糖聚合酶的一种抑制剂——3—氨基苯酰胺(3—AB)(3—30μg/ml),或者拓扑酶Ⅱ的一种抑制剂——新霉素(3—30μg/ml)处理HCMV感染的PBLs30时小,染色体损伤频率未见明显增加。在喜树碱处理的HCMV感染细胞中,染色单体型断裂包括染色体交换是染色体畸变的主要类型,这提示HCMV感染与单链NDA断裂有关,这些发现还提示,HCMV感染不会造成通过3-AB或新霉素敏感途径修复的直接DNA损伤。     

哺乳类(兔)红细胞分化因子的纯化及特性分析

本文报道从哺乳动物(兔)红细胞分离、提纯红细胞分化因子(ErythroidDifferentiation Factor,简称EDF及对其性质的分析。按Bishop方法给新西兰兔注射盐酸苯肼(2.5％)0.3mL/kg体重/日连续6days致贫血,收集血液用生理盐水洗去白细胞后,得到的网织红细胞用冻融法使细胞裂解,用乙醇、氯仿选择性变性除去血红蛋白,凝胶过滤,连续经DEAE-纤维素及CM-纤维素柱层析,取得较原裂解液纯化了31 000倍的活性物质EDF,产率为9.1％,分子量15kD,在SDS-PAGE电泳图中为单一蛋白带。EDF对热相对稳定,100℃处理10min仍保持一定活性,对蛋白酶敏咸而对DNA酶I及RNA酶不敏感。EDF对体外培养细胞的生长抑制作用已在体外实验体系得到验证。     

一种简易的抽提共价闭合环状DNA的方法

纯净的、具有生物学活性的共价闭合环状DNA是DNA体外重组技术的一个重要基础。 本文报道的是我们实验室经常使用的抽提质粒pBR 322 DNA的方法。在Zasloff等酸酚法的基础上省略了蛋白酶K和RNA酶,代之     

三甲基月桂基硫酸钠（TLS）在蓝细菌核酸提取中的作用

本文首次把三甲基月桂基硫酸钠(TLS)应用于蓝细菌(蓝藻)总核酸的提取。在用溶菌酶破坏满江红鱼腥藻的细胞壁后,再用TLS分别取代常用法中的各种试剂,即:Triton X-100 Sarkosyl,蛋白酶K,总核酸产率分别是常用法的98.9％,47.3％,103.8％。用TLS取代蛋白酶K处理不同生长期的满江红鱼腥藻,总核酸产率随生长期延长而降低。TLS取代蛋白酶K提取的DNA和常用法提取的DNA,都能被限制性内切酶EcoR I水解。用光学显微镜观察到,满江红鱼腥藻经TLS处理后,丝状体断裂,细胞破裂成碎片。在扫描电子显徽镜下,未经TLS处理的细胞表面光滑平整,而经TLS处理的细胞表面有鳞片状突起、皱褶、凹陷,甚至穿孔。     

应用微环DNA技术体外诱导和制备重组的乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)是病毒慢性感染的分子基础。本课题组前期研究通过Cre/loxP介导的位点特异性DNA重组策略,在细胞核内由前体质粒诱导重组cccDNA(rcccDNA^loxP)产生,首次建立了HBV cccDNA的体外培养细胞和小鼠实验模型。本研究基于大肠埃希菌ZYCY10P3S2T PhiC31重组酶诱导表达系统,建立了一种体外诱导HBV rcccDNA(rcccDNA^attR)微环产生和纯化的策略。纯化的rcccDNA^attR微环具有超螺旋结构,细胞培养实验证实其能支持功能性的HBV复制和抗原表达。与普通的线性HBV复制子编码质粒相比,rcccDNA^attR尾静脉高压注射小鼠模型能诱导显著延长的病毒抗原血症。因此,本研究在原核表达系统和实验小鼠水平提供了一种更为简化的HBV cccDNA实验模型系统,并再次显示rcccDNA具有显著的稳定性,能作为一种基本策略在小鼠模型中诱导病毒持续感染。     

极端嗜热古菌——芝田硫化叶菌DNA结合蛋白Ssh12对DNA超螺旋的影响

通过SPSepharose,DNA纤维素和磷酸纤维素等柱层析 ,从极端嗜热古菌———芝田硫化叶菌 (Sulfolobusshibatae)中纯化得到分子量为 11.5ku的DNA结合蛋白Ssh12 .Ssh12约占细胞总蛋白的 4% .该蛋白既能与负超螺旋DNA也能与松弛DNA结合 .利用含单切刻环状DNA进行的切刻闭合分析表明 ,Ssh12在与DNA结合时能够固定负超螺旋 .这种能力在室温 ( 2 2℃ )下很弱 ,而在 3 7℃以上则大大增强 .Ssh12的细胞内含量和固定负超螺旋的能力提示 ,该蛋白对于芝田硫化叶菌染色体DNA的组织以及热稳定性起着重要作用 .     

基因分子扩增的操作方法(续二)

<正> D.扩增用 DNA的分离和提取 绝大部分DNA的纯化提取,可用去污剂使细菌溶解,用石炭酸和/或旦白水解酶处理除去旦白,用核糖核酸酶除去RNA以及乙醇沉淀等操作进行。许多来源的SDS去污剂含有能破坏DNA生物学活性的物质。 Matheson、 Coleman 和 Bell的 SDS质量合乎要求。能破坏DNA或带有颜色的SDS在使用前应通过炭柱或用乙醇再沉淀。用Marmur 法在有机溶媒中振摇,能引起DNA的极大破坏,应防止。 提取细胞质中细胞器的DNA,应从提纯过的细胞器中分离以防染色体DNA的污染。超螺旋DNA如细胞器中存在的或许多病毒的中间复制体,可用染料浮力密度离心法提取。和提取全部DNA或细胞器DNA不同,从混合DNA中分离特异基因则较为困难。 1.藉物理学上的差异从混合DNA中分离特异基因 有些基因的硷基组成与混合DNA存在     

草鱼和鲤鱼线粒体 DNA 的分离纯化及其 COI 基因的分子克隆

本文报道配合使用差速离心和DNaseI核酸酶处理等步骤,从草鱼和鲤鱼新鲜肝组织分离线粒体DNA(mtDNA)的实验方法。这种方法经济简便,纯化的mtDNA产率多,纯度高,经限制性内切酶消化后进行琼脂糖凝胶电泳分离,可以得到清晰的DNA片段谱带,并可直接用于构建酶切图谱和线粒体基因的分子克隆。用这样的mtDNA,我们已克隆了草鱼和鲤鱼的细胞色素氧化酶亚基I基因(COI基因)。     

人类线粒体tRNA生物合成与线粒体疾病

线粒体是普遍存在于真核细胞中的一类细胞器.每个线粒体含有多个拷贝的闭合环状双链DNA. 人类线粒体DNA (mitochondrial DNA, mtDNA)共编码22种线粒体tRNA(mitochondrial tRNA,mt tRNA), 2种rRNA 及13种多肽.mt tRNA独特的结构特点决定了它们与具有典型三叶草结构的细胞质 tRNA不同.编码mt tRNA的基因突变频率较高,这可能是引起线粒体功能障碍的主要原因之一. 同时 ,这与很多病理现象相关.目前发现,大量与mt tRNA生物代谢和功能相关的核因子包括加工内切酶、 tRNA修饰酶和氨酰-tRNA合成酶.这些核因子的异常导致了疾病相关的tRNA致病突变.由此可见mt tRNA功能对于线粒体活性的重要性.     

超氧化物歧化酶切割超螺旋DNA的活性

在体外系统中,发现超氧化物歧化酶(SOD)具有切割超螺旋DNA的活性. 猪血和牛血Cu/Zn-SOD以及烟草Mn-SOD都能将超螺旋DNA转变为非超螺旋结构的缺刻环状DNA,进一步产生线状DNA. 它们只作用于超螺旋DNA而不作用于线状DNA. 这个事实排除了SOD样品中污染核酸酶的可能性. 用H₂O₂、胍基抑制或蛋白酶降解的实验结果表明,这两种酶的活性中心处于酶蛋白的不同部位.     

一种琼脂糖凝胶电泳分离质粒DNA的方法

分子无性繁殖已成为扩增特定 DNA 片段的广为使用的技术,而细菌质粒是很多无性繁殖工作中所选用的载体。近年来分离载体的方法,大多是根据载体 DNA 的共价闭合环状(CCC—DNA)性质及其对变性的抗性.在氯化铯—溴化乙锭梯度中,CCC—DNA 密度大,比线状 DNA 沉降快,所以用密度梯度超离心方法可获得高纯度的 CCC—DNA。但超离心方法在时间上、材料上都不够经济,在     

半胱氨酸蛋白酶IdeS的原核表达、纯化及活性鉴定

酿脓链球菌来源的免疫球蛋白G降解酶 (immunoglubulin G-degrading enzyme of Streptococcus pyogenes, IdeS) 是一种典型的半胱氨酸水解酶,可以在抗体铰链区的特定位点进行酶切,使IgG水解为完整的 F(ab)₂片段和Fc片段,由于其独特的酶活特异性和高活性,IdeS可以作为工具酶应用于IgG的亚单位制备、结构分析及表征分析.利用双标签 (GST-tag及His₆-tag) 表达系统在E.coli中高效表达了可溶性重组蛋白酶GST-IdeS-His₆,并在IdeS的氨基端与GST之间加上肠激酶酶切位点,以利于标签的去除.再利用亲和层析的纯化方法对目的蛋白进行纯化.使用SDS-PAGE、HPLC-SEC、LC-MS对纯化后的IdeS进行分析和鉴定.结果表明:本系统所表达的蛋白酶IdeS得率高,每1L菌液纯化可获得约25mg纯度为90%以上的蛋白酶IdeS,将此蛋白酶与抗体IgG以1:100 (m/m) 比例混合,于37℃反应30min,即可酶切完全.能够满足蛋白质结构分析中对蛋白酶的高质量要求,并且适用于抗体类药物的表征分析.同时,蛋白酶IdeS也可以应用于生物仿制药、生物改良药和新一代抗体以及Fc-融合蛋白的研究.