Hey1基因参与调控BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化

目的:观察发状分裂相关增强子Hey1在骨形态发生蛋白9(BMP9)诱导的小鼠间充质干细胞(MSCs)C3H10T1/2成骨分化中的作用。方法:包装Hey1、BMP9以及GFP的过表达慢病毒,并分别作用于C3H10T1/2细胞,RT-PCR和Western blot检测Hey1、BMP9以及GFP的慢病毒是否包装成功,碱性磷酸酶(ALP)检测早期成骨指标ALP的变化,茜素红S染色检测晚期成骨指标钙盐沉积,MTT检测Hey1对BMP9调控的C3H10T1/2细胞增值的影响,流式细胞术检测Hey1对BMP9调控的C3H10T1/2细胞周期的影响。结果:Hey1、BMP9以及GFP的慢病毒包装成功;在成骨分化早期,过表达Hey1基因可促进BMP9调控的C3H10T1/2细胞的成骨分化与增殖;在成骨分化晚期,过表达Hey1基因可促进BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的成骨分化,并将BMP9调控的C3H10T1/2细胞周期阻滞在G1期。结论:Hey1基因可参与调控BMP9诱导的小鼠C3H10T1/2细胞的早晚期成骨分化,并对细胞的增殖与周期有一定的影响。     

过表达miR-155抑制BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化

目的:研究过表达miR-155对BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化的影响。方法:(1)用重组腺病毒Ad-BMP9(BMP9)诱导C3H10T1/2细胞成骨分化,定量PCR(qPCR)检测miR-155的表达,RT-PCR检测Runx2和ALP的表达。(2)miR-155和BMP9共同处理C3H10T1/2细胞,qPCR检测miR-155的表达,ALP活性和染色检测早期成骨能力。(3)miR-155和BMP9共同处理C3H10T1/2细胞,诱导分化14d茜素红S染色检测晚期成骨能力。(4)miR-155和BMP9共同处理C3H10T1/2细胞,qPCR检测成骨分化相关基因Runx2、OSX、COL1A1、ALP、OCN和OPN的表达。(5)miR-155和BMP9共同处理C3H10T1/2细胞,Western blot检测p-Smad1/5/8、OCN和OPN蛋白水平的表达。(6)qPCR和Western blot分别检测HIF1α和VEGF的mRNA表达水平和蛋白质表达水平。(7)应用荧光素酶报告基因对miR-155的靶基因进行筛选和验证。结果:在BMP9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化过程中,过表达miR-155降低ALP活性及染色;减少钙盐沉积;成骨分化相关基因Runx2、OSX、COL1A1、ALP、OCN和OPN表达降低;抑制p-Smad1/5/8、OCN和OPN蛋白水平的表达;HIF1α和VEGF的mRNA和蛋白表达水平减少。在对靶基因的检测中,过表达miR-155可以抑制HIF1α蛋白水平的表达,但对其mRNA水平无明显影响。结论:miR-155过表达减弱BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化,可能是通过抑制Smad/BMP信号通路发挥作用,也有可能是通过抑制靶基因HIF1α的表达来发挥作用。     

Hmox1促进BMP9诱导C3H10T1/2细胞向成骨分化

目的:研究血红素加氧酶1(hemeoxygenase 1,Hmox1)在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)诱导下间充质干细胞C3H10T1/2向成骨分化过程中发挥的作用。方法:用Ad-BMP9感染C3H10T1/2,分别用Q-PCR和Western blot检测Hmox1mRNA和蛋白水平的变化;Hmox1激动剂COPP处理BMP9诱导的C3H10T1/2细胞,碱性磷酸酶(ALP)染色和活性测定检测早期成骨指标ALP的变化;过表达Hmox1的重组腺病毒(Ad-Hmox1)处理BMP9诱导的C3H10T1/2细胞,ALP染色和活性测定早期成骨指标ALP,茜素红染色检测晚期成骨指标钙盐沉积,Western blot检测成骨相关基因COL1A1。结果:Ad-BMP9感染C3H10T1/2后,Hmox1的mRNA及蛋白水平均升高;BMP9与Hmox1激动剂COPP联用与BMP9组相比ALP的活性增强;Ad-Hmox1可以增强BMP9诱导下C3H10T1/2细胞的ALP活性和钙盐沉积,以及成骨相关基因COL1A1表达。结论:Hmox1可以促进BMP9诱导下C3H10T1/2细胞的成骨分化。     

DLX1对BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化的影响

目的:分析和确认转录因子DLX1在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导的间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化中的作用。方法:首先,BMP9腺病毒感染C3H10T1/2细胞,RT-PCR和Western blot检测DLX1表达变化;随后,利用重组腺病毒技术分别过表达DLX1和RNA干扰(RNA Intenference,RNAi)抑制DLX1的表达,并利用碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)染色、钙盐沉积实验(茜素红染色),免疫细胞化学检测骨钙素(osteocalcin,OCN)表达和裸鼠皮下异位成骨实验分析DLX1对于BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化的影响。荧光素酶报告基因实验和Western blot分析DLX1对于BMP9诱导的C3H10T1/2细胞Smad1/5/8信号途径的影响。结果:BMP9可以促进C3H10T1/2细胞中DLX1基因和蛋白表达水平;过表达DLX1在体外可进一步促进BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的ALP活性、钙盐沉积以及OCN的表达,过表达DLX1亦可促进BMP9诱导的裸鼠皮下异位成骨;反之,RNAi抑制DLX1表达后,由BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的ALP活性、钙盐沉积、OCN表达和裸鼠皮下异位成骨均相应受到抑制。过表达DLX1可进一步增强BMP9诱导的C3H10T1/2细胞中Smad/1/5/8的转录调控活性,RNAi降低DLX1表达则可抑制BMP9诱导Smad/1/5/8的转录调控活性。但是,无论过表达DLX1和RNAi降低DLX1表达均不会对BMP9诱导的Smad/1/5/8磷酸化造成影响。结论:DLX1可以调节BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2细胞成骨分化,其调节作用可能是通过影响Smad1/5/8信号的转录调控活性而实现的。     

Shh信号参与调控BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化

目的：观察sonic hedgehog（Shh）信号通路在骨形态发生蛋白9（BMP9）诱导的小鼠间充质干细胞（MSCs）C3H10T1/2和C2C12成骨分化中的作用,并初步探讨其作用机制。方法：Shh信号通路抑制剂Cyclopamine和激活剂Purmorphamine以及过表达Shh腺病毒分别作用于BMP9处理的C3H10T1/2和C2C12细胞,碱性磷酸酶（ALP）检测早期成骨指标ALP,茜素红S染色检测晚期成骨指标钙盐沉积,RT-PCR检测Shh信号相关基因以及成骨关键转录因子的表达,Western blot检测Shh的表达,荧光素酶报告基因检测Smad1/5/8的转录调控活性。结果：BMP9促进Shh信号相关基因的表达,激活Shh信号可增强BMP9诱导的C3H10T1/2和C2C12细胞早晚期成骨分化并促进了BMP9诱导的Smad荧光素酶活性,抑制Shh信号后作用相反。结论：激活Shh信号通路可促进BMP9诱导的小鼠MSCs成骨分化,抑制其活性后作用相反。     

RUNX2对BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化的影响

目的:研究和确认RUNX2在骨形态发生蛋白9(BMP9)诱导的间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化中的作用。方法:通过Western blot、RT-PCR、荧光素酶活性分析检测BMP9对RUNX2表达的影响;分别在过表达RUNX2和RNA干扰抑制RUNX2表达的情况下,利用碱性磷酸酶(ALP)活性测定和染色、钙盐沉积实验,免疫细胞化学和裸鼠皮下异位成骨实验分析RUNX2对于BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化的影响。结果:BMP9可以促进RUNX2的表达;RUNX2体外可促进BMP9诱导的C3H10T1/2的ALP活性和钙盐沉积,却抑制了OCN表达,RUNX2还可促进BMP9诱导的裸鼠皮下异位成骨;而在降低RUNX2表达后,BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的ALP活性、钙盐沉积、OCN表达和裸鼠皮下异位成骨均受到抑制。结论:RUNX2可以促进BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2细胞成骨分化。     

MiR-21协同BMP9促进间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化

目的:探讨miR-21与BMP9之间的关系,明确miR-21在BMP9诱导间充质干细胞成骨分化中的作用。方法:(1)Ad-BMP9感染C3H10T1/2细胞,Real-time-PCR检测miR-21表达。RT-PCR检测ALP的表达。(2)MiR-21转染C3H10T1/2细胞,Real-time-PCR检测miR-21和BMP9表达。(3)MiR-21和BMP9-CM处理C3H10 T1/2细胞,ALP活性和染色实验检测C3H10 T1/2细胞早期成骨能力。茜素红S染色实验检测钙盐沉积情况。(4)MiR-21和BMP9-CM处理C3H10 T1/2细胞,Real-time-PCR检测成骨分化相关因子ALP,OCN的表达。(5)MiR-21和BMP9-CM处理C3H10T1/2细胞,Western blot检测p-Smad1/5蛋白水平的表达。结果:(1)BMP9暂时降低miR-21的表达。MiR-21也可以暂时降低BMP9的表达。(2)MiR-21可以协同BMP9增强ALP和钙盐沉积。(3)MiR-21协同BMP9增加了p-Smad1/5蛋白水平的表达。结论:MiR-21与BMP9存在相互关系,两者可以互相调节表达。MiR-21可以协同BMP9促进间充质干细胞C3H10T1/2细胞成骨分化,这一过程与增强BMP9/Smad信号的激活程度有关。     

骨形态发生蛋白9通过p38激酶途径调控间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化

前期研究发现骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)具有较强的诱导间充质干细胞成骨分化的能力.为进一步揭示其诱导和调控间充质干细胞成骨分化的机理,利用BMP9重组腺病毒感染间充质干细胞C3H10T1/2,通过体外细胞实验和体内动物实验,初步分析BMP9是否可通过p38激酶途径调控间充质干细胞成骨分化.结果发现,BMP9可以通过促进p38激酶磷酸化而导致其活化,p38抑制剂SB203580可抑制由BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)活性、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)表达和钙盐沉积,而且利用抑制剂SB203580抑制p38激酶活性后,BMP9诱导的Smad经典途径的激活也相应受到抑制,RNA干扰导致p38基因沉默同样也可抑制BMP9诱导的ALP活性、OPN表达、钙盐沉积以及裸鼠皮下异位成骨.因此,BMP9可通过活化p38激酶途径调控间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化.     

研究报告：骨形态发生蛋白9通过p38激酶途径调控间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化

前期研究发现骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)具有较强的诱导间充质干细胞成骨分化的能力.为进一步揭示其诱导和调控间充质干细胞成骨分化的机理,利用BMP9重组腺病毒感染间充质干细胞C3H10T1/2,通过体外细胞实验和体内动物实验,初步分析BMP9是否可通过p38激酶途径调控间充质干细胞成骨分化.结果发现,BMP9可以通过促进p38激酶磷酸化而导致其活化,p38抑制剂SB203580可抑制由BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)活性、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)表达和钙盐沉积,而且利用抑制剂SB203580抑制p38激酶活性后,BMP9诱导的Smad经典途径的激活也相应受到抑制,RNA干扰导致p38基因沉默同样也可抑制BMP9诱导的ALP活性、OPN表达、钙盐沉积以及裸鼠皮下异位成骨.因此,BMP9可通过活化p38激酶途径调控间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化.     

BMP2具有诱导C3H10T1/2细胞成脂肪分化的能力

探讨骨形态发生蛋白2（BMP2）诱导鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2成脂肪分化能力,为临床脂肪代谢疾病的治疗提供理论基础．培养多潜能的间充质干细胞C3H10T1/2,用20 μg/ml BMP2对其诱导一定时间后,RT-PCR检测是否存在BMP信号通路中关键分子BMP受体BMPR I, BMPR Ⅱ及Smad 1/5/8的表达.Western印迹检测Smad 蛋白及MAPK 信号通路中p38磷酸化水平变化,QRT PCR检测成脂肪标志基因aP2以及成脂肪相关转录因子PPARγ,C/EBPα,C/EBPβ表达水平,同时用油红O染色,观测C3H10T1/2细胞成脂肪分化情况．经BMP2诱导后,C3H10T1/2细胞成脂肪分化标志(油红O染色)显著增加,Smad 蛋白及p38磷酸化水平有所上升,同时成脂肪标志基因aP2以及成脂肪相关转录因子PPARγ,C/EBPα,C/EBPβ表达水平各有一定程度提高．BMP2具有诱导C3H10T1/2细胞成脂肪分化能力,其成脂肪分化呈现对BMP2作用的时间依赖性．     

激活Shh信号通路促进BMP9诱导的小鼠成肌细胞C2C12向成骨分化

近年来骨组织工程技术迅猛发展,小鼠成肌细胞C2C12因其来源广泛等优点可望成为有效的种子细胞应用于组织工程. 然而,对于C2C12细胞的成骨分化机制仍需深入研究. 为了观察Sonic hedgehog（Shh）信号通路对骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic proteins 9,BMP9）诱导的C2C12细胞成骨分化的影响,构建过表达腺病毒Ad Shh,并作用于BMP9处理的C2C12细胞,检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase , ALP）的变化,茜素红S染色检测钙盐沉积,RT PCR检测Shh、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素（osteocalcin,OCN）、Runx2、Dlx5、Id1和Id2基因表达,Western印迹检测Shh、OPN、OCN、Runx2和Dlx5的蛋白质表达,Micro-CT和H&E染色检测裸鼠皮下异位成骨包块情况. 结果表明,活化Shh信号通路可促进BMP9诱导的C2C12细胞早晚期成骨分化,以及裸鼠皮下异位成骨.体内外实验证明,Shh信号通路能促进BMP9诱导小鼠成肌细胞C2C12向成骨分化.     

BMP9经JNK激酶途径调控间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化

为了证实JNK激酶在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9) 诱导间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化中的作用,利用重组腺病毒将BMP9导入间充质干细胞C3H10T1/2. 通过碱性磷酸酶(ALP)活性测定、钙盐沉积实验、荧光素酶报告基因检测、Western印迹和组织化学染色等方法,检测BMP9是否可经JNK激酶途径调控间充质干细胞C3H10T1/2向成骨分化.动物实验验证在RNA沉默JNK蛋白激酶后,对BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2向成骨分化的影响．结果发现,BMP9可以增强JNK 激酶的磷酸化;利用JNK抑制剂SP600125抑制JNK激酶活性后,BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2的早期成骨指标ALP活性和晚期指标钙盐沉积均受到抑制,而且经典SMAD信号的活化也相应受到抑制;RNA干扰沉默JNK基因表达后,同样也可抑制BMP9 诱导的C3H10T1/2细胞的ALP活性和裸鼠皮下异位成骨．因此表明,BMP9可活化JNK激酶途径从而诱导间充质干细胞C3H10T1/2向成骨分化．     

Smads, p38 and ERK1/2 are involved in BMP9-induced osteogenic differentiation of C3H10T1/2 mesenchymal stem cells

Although previous studies have demonstrated that BMP9 is highly capable of inducing osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells, the molecular mechanism involved remains to be fully elucidated. In this study, we showed that BMP9 simultaneously promotes the activation of Smad1/5/8, p38 and ERK1/2 in C3H10T1/2 cells. Knockdown of Smad4 with RNA interference reduced nuclear translocation of Smad1/5/8, and disrupted BMP9-induced osteogenic differentiation. BMP9-induced osteogenic differentiation was blocked by p38 inhibitor SB203580, whereas enhanced by ERK1/2 inhibitor PD98059. SB203580 decreased BMP9-activated Smads singling, and yet PD98059 stimulated Smads singling in C3H10T1/2 cells. The effects of inhibitor were reproduced with adenovirus expressing siRNA targeted p38 and ERK1/2, respectively. Taken together, our findings revealed that Smads, p38 and ERK1/2 are involved in BMP9-induced osteogenic differentiation. Also, it is noteworthy that p38 and ERK1/2 may play opposing regulatory roles in mediating BMP9-induced osteogenic differentiation of C3H10T1/2 cells.     

CREB/Wnt10b mediates the effect of COX-2 on promoting BMP9-induced osteogenic differentiation via reducing adipogenic differentiation in mesenchymal stem cells

Bone morphogenetic protein 9 (BMP9) is one of the most potent osteogenic factors, which may be a potential candidate for bone tissue engineering. However, the osteogenic capacity of BMP9 still need to be further enhanced. In this study, we determined the effect of Wnt10b on BMP9-induced osteogenic differentiation in mesenchymal stem cell (MSCs) and the possible mechanism underlying this process. We introduced the polymerase chain reaction (PCR), Western blot analysis, histochemical stain, ectopic bone formation, and microcomputed tomography analysis to evaluate the effect of Wnt10b on BMP9-induced osteogenic differentiation. Meanwhile, PCR, Western blot analysis, chromatin immunoprecipitation, and immunoprecipitation were used to analyze the possible relationship between BMP9 and Wnt10b. We found that BMP9 upregulates Wnt10b in C3H10T1/2 cells. Wnt10b increases the osteogenic markers and bone formation induced by BMP9 in C3H10T1/2 cells, and silencing Wnt10b decreases these effects of BMP9. Meanwhile, Wnt10b enhances the level of phosphorylated Smad1/5/8 (p-Smad1/5/8) induced by BMP9, which can be reduced by silencing Wnt10b. On the contrary, Wnt10b inhibits adipogenic markers induced by BMP9, which can be decreased by silencing Wnt10b. Further analysis indicated that BMP9 upregulates cyclooxygenase-2 (COX-2) and phosphorylation of cAMP-responsive element binding (p-CREB) simultaneously. COX-2 potentiates the effect of BMP9 on increasing p-CREB and Wnt10b, while silencing COX-2 decreases these effects. p-CREB interacts with p-Smad1/5/8 to bind the promoter of Wnt10b in C3H10T1/2 cells. Our findings suggested that Wnt10b can promote BMP9-induced osteogenic differentiation in MSCs, which may be mediated through enhancing BMP/Smad signal and reducing adipogenic differentiation; BMP9 may upregulate Wnt10b via the COX-2/p-CREB-dependent manner.     

BMP9经Smad信号通路调控iSCAP成骨/成牙本质分化

目的：研究BMP9是否能够激活 iSCAP细胞中的Smad信号通路,以及Smad信号通路在BMP9诱导iSCAP细胞成骨/成牙本质向分化过程中的作用。方法：首先,采用Western印迹实验检测Ad-BMP9转染iSCAP后Smad1/5/8蛋白的磷酸化水平。随后,利用dnALK1重组腺病毒和BMP9条件培养基作用于iSCAP,Western印迹实验检测Smad1/5/8蛋白磷酸化水平;采用碱性磷酸酶（ALP）活性检测和染色方法分析早期成骨/成牙本质指标变化,茜素红染色法检测钙盐沉积程度;RT-PCR成骨/成牙本质相关基因Runx2、OCN、OPN和DMP1表达的影响。结果：BMP9可上调iSCAP中Smad1/5/8的磷酸化水平;dnALK1抑制BMP9条件培养基作用后,可抑制Smad1/5/8的磷酸化,iSCAP细胞中早期成骨/成牙本质标志物ALP活性和晚期成骨/成牙本质标志钙盐结节减少,重要成骨转录因子Runx2基因表达减少,成骨/成牙本质相关基因OCN、OPN、DMP1的表达也受到了抑制。结论：Smad信号通路在BMP9诱导iSCAP成骨/成牙本质过程中存在并起着重要作用。