果胶酶B_1及浓缩液剂型纤维素酶EA_3867的制备和应用

为了配合植物细胞工程和基因工程的研究,几年来进行了纤维素酶和果胶酶的试制工作。用自制的EA_3-867纤维素酶和B_1果胶酶能从50余种植物材料中分离出大量完整而有活力的原生质体。以往我们制备EA_3-867纤维素酶过程中采用的冷冻真空干燥机,价格昂贵、货源紧张,给大批量生产造成一定困难。为此,我们试制了浓缩液剂型纤维素酶EA_3-867和果胶酶B_1。现将试验结果报告如下。     

EA_3—867纤维素酶的简易冷冻干燥法

近年来,为开展植物原生质体培养和细胞杂交研究,我们利用木霉EA_3—867菌株发酵,制备纤维素酶,并对该酶的性质进行了研究。酶制剂活力和质量不仅与菌株种类、发酵过程的条件等,而且与最后干燥方法有关。最     

烟草叶肉原生质体再生壁形成的培养条件的研究

用EA_3-867纤维素酶分离的烟草(Nicotiana tabacum)叶肉原生质体,在不同培养条件下进行液体浅层培养,用荧光增白剂VBL染色荧光法和低渗冲击法研究了再生壁形成的某些培养条件。结果表明,600～1000米烛光的弱光、10~5个原生质体/毫升的密度以及蔗糖或甘露醇作碳源,有利于壁的再生。     

木霉纤维素酶的诱导形成及其调节 Ⅳ.高产变异株纤维素酶合成调节的变化——酶活提高原因的初步分析

拟康氏木霉纤维素酶高产变异株EA_3-867和N_2-78在合成培养基琼脂平板和马铃薯葡萄糖琼脂平板上菌落明显缩小,生长变慢。但在蛋白胨酵母膏琼脂平板上,小菌落恢复成大菌落,生长速度同野生型菌株一致。EA_3-867和N_2-78在不同液体培养基中纤维素酶活力均显著高于野生型菌株1096和木_3。洗涤菌丝体的诱导测定也证明高产变异株的纤维素酶诱导活性有明显的提高。变异株和野生型菌株洗涤菌丝体诱导形成的纤维素酶组分,从聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱判断,未见明显差异,仅变异株中代表纤维素酶活性的蛋白带显著加深。高产变异株纤维素酶产量的增加是由于菌株对诱导剂敏感性的增加和对降解物阻遏敏感性的减弱。     

几种生长物质对烟草叶肉原生质体再生壁形成的影响

用EA_3-867纤维素酶分离的烟草(Nicotiana tabacum)叶肉原生质体,在附加不同生长物质的NT培养基中进行液体浅层培养。用荧光增白剂VBL染色荧光法研究了几种生长物质对再生壁形成的影响。结果表明,激动素为再生壁形成所必需,2,4-D对壁的再生无效,但缺少时会影响细胞的活力;香豆素和三碘苯甲酸分别在200 mg l~(-1)和20 mg l~(-1)以上的浓度下,抑制壁的再生;ABA不抑制壁的再生,但引起出芽;GA_3不影响壁的再生,但100 mg l~(-1)的浓度在一定程度上抑制壁的再生。     

木霉纤维素酶的诱导形成及其调节 Ⅲ、葡萄糖母液和槐豆荚提取液对纤维素酶诱导效应的分析

葡萄糖母液对拟康氏木霉1096,木_3,EA_3-867和N_2-78的洗涤菌丝体的纤维素酶形成,有强力的诱导效应。用活性炭层析分离和纸谱分离证实,葡萄糖母液对纤维素酶的诱导效应主要是由于其中含有的槐糖杂质的缘故。龙胆二糖是葡萄糖母液中另一含量较高的杂质,但它对纤维素酶的诱导能力较槐糖低得多。槐豆荚提取液同样具有诱导木霉纤维素酶形成的作用。本文讨论了如何利用木霉纤维素酶形成的调节控制原理来加速和增加纤维素酶的产量。     

植物细胞壁分解酶的制备与细胞生物学的鉴定

为了研究植物原生质体的分离、培养和融合,我们对分解植物细胞壁的纤维素酶的生产进行了研究,并对酶制剂进行了细胞生物学的鉴定。试验结果证明:用我们的方法和程序生产的酶制剂完全可以满足植物体细胞杂交研究之用。     

培养条件对木霉形成纤维素酶的影响和两种形成纤维素酶的促进剂的初步观察

用液体培养法研究了木霉EA_3-867菌株纤维素酶形成的条件。在所测试的各种粗纤维材料中,稻草粉和黄豆皮的混合物(比例是4:6)是菌株纤维素酶形成的最好基质。若同时加入一些糖类,能显著促进纤维素酶形成。其中半乳糖效果最好,能使酶形成数量提高一倍或更多,葡萄糖和果糖也有一定效果。培养液的初始pH 6～7最有利于纤维素酶形成。稻草中存在着两种天然的纤维素酶形成的促进剂。一种是水溶性的,能和半乳糖起协同作用,共同促进纤维素酶形成。另一种是酯溶性的,不需加入糖类能单独促进纤维素酶形成。     

木霉纤维素酶的诱导形成及其调节 Ⅱ.槐糖对木霉EA_3-867洗涤菌丝体纤维素酶形成的诱导作用及降介物阻遏现象

槐糖对拟康氏木酶(Trichoderma pseudokoningii Rifai)EA_3—867洗涤菌丝体的纤维素酶形成有强力的诱导作用,经过3小时左右的延迟期,24小时后,纤维素酶便达到高峰。各种木霉菌种和EA_3—867不同菌令的菌丝体都能被槐糖诱导形成纤维素酶,c_1、c_x酶主要分布在胞外,纤维二糖酶分布在胞内。菌丝体诱导形成纤维素酶需要诱导剂;无机盐(氮、磷、铁、锰盐);适宜的温度、pH和通气;以及菌丝体细胞活跃的代谢。槐糖的最适浓度是10~(-3)～10~(-5)M,诱导的最适温度为30℃,适宜的pH范围3～6,最适pH为5。O_2能刺激纤维素酶的形成,而呼吸抑制剂碘乙酸、氟化钠、丙二酸、迭氮化钠和3,5-二硝基苯酚能强烈抑制菌丝产酶。槐糖对菌丝体纤维素酶的诱导形成能不同程度地被核酸代谢抑制剂如放线菌酮、5-氟尿嘧啶、6-氮杂尿嘧啶和放线菌素D抑制。葡萄糖、甘油、各种糖类、糖磷酸酯、有机酸、辅酶NAD、NADP及ATP~(**)均能阻遏槐糖对菌丝体纤维素酶的诱导作用。葡萄糖对纤维素酶形成的阻遏作用不能被c—AMP介除。     

烟草叶肉原生质体再生壁形成中的呼吸途径研究

用EA_3~-867纤维素酶分离的烟草(Nicotiana tabacum)叶肉原生质体,在附加 EMP途径的抑制剂 NaF或 HMP途径的抑制剂 Na_3PO_4的NT培养基中进行液体浅层培养。用荧光增白剂 VBL染色荧光法和溶解氧电极极谱法分别研究EMP途径和 HMP途径对烟草叶肉原生质体壁的再生和氧的吸收的影响。结果表明,当EMP或HMP途径被抑制时,氧的吸收,壁的再生和细胞生长都受到抑制;当 EMP和 HMP途径同时被抑制时,上述过程的抑制更甚。初步认为,EMP途径和 HMP途径在壁的再生中同时存在,并且都起着重要作用。     

洋葱叶肉原生质体培养再生小植株

用纤维素酶(EA 3-867)和离析酶(Macerozyme R-10)酶解洋葱叶肉细胞,游离获得大量具有活力的原生质体。在MS培养基上(附加2,4-D 2,6-BA 0.5 mg/l,原生质体能再生细胞壁,生长,分裂,形成类似球形的愈伤组织;将它们分别移入分化培养基MS_1,MS_2,MS_3,得到再生的小植株。     

花烟草叶肉原生质体再生植株

用自制的纤维素酶(EA3-867)从花烟草(Nicotiana alata)叶肉细胞制备大量有活力的原生质体。在NT培养基(内含2,4-D2,KT0.25毫克/升)上观察到原生质体长大,分裂,形成愈伤组织。愈伤组织悬浮在含有2,4-D2mg/升的MS培养基上诱导出球形胚,移入MS(BA2,IAA 0.2 mg/l)培养基上出苗。小苗移植土壤中正常生长、开花、结实。     

从胡萝卜愈伤组织分离的原生质体获得再生植株

植物原生质体培养技术广泛地应用于体细胞杂交、遗传物质转移、核及细胞器的移植及其他的研究工作。目前几种植物的原生质体培养已经能够再生成完整植株。我们研究了用自己制备的纤维素酶分离固体培养的胡萝卜愈伤组织原生质体的条件和再生细胞分裂、植株分化的条件。     

二百种植物叶片细胞机械分离试验

自从 Chayen 用果胶酶分离植物细胞以来,接着 Cocking 使用纤维素酶从植物细胞分离原生质体的研究。植物细胞以及原生质体培养已经应用于细胞工程技术领域。但是在植物细胞培养和植物学教学工作中,通常需要从植物组织中分离出一定数量活的     

几种植物组织及其原生质体过氧化物酶同工酶的比较研究

对马尾松幼苗子叶和胚轴、甘蔗、小麦、烟草、黄花菜等幼叶及其原生质体的过氧化物酶同工酶(POI)分别作比较研究。观察到凡经纤维素酶处理的各植物组织POI酶带数均多于未经纤维素酶处理的组织的酶带数;除个别例外,后者一般又比无壁原生质体的酶带数多。此种差异随植株生长年龄而增大,表明植物组织内大部分POI主要存于质外体中。     

北美鹅掌楸原生质体的分离与培养

以鹅掌楸属植物北美鹅掌楸的悬浮细胞和组培苗叶片为材料,对北美鹅掌楸原生质体分离、纯化与培养条件进行研究.结果表明:叶片和悬浮细胞用含有0.1％2-吗啉乙磺酸(MES)和0.6 mol/L甘露醇的Cell ProtoplastWash(60M-CPW)溶液25℃预处理lh效果最好;悬浮细胞最佳酶解液为60M-CPW+ 1％纤维素酶+1％半纤维素酶+0.2％果胶酶Y-23+0.1％ MES,每克材料25℃酶解6h有效原生质体产量可以达到3×106个;叶片最佳酶解液为60M-CPW+2％纤维素酶+1％半纤维素酶+0.2％果胶酶Y-23+0.1％ MES,每克材料25℃酶解10 h有效原生质体产量可以达到11×106个;悬浮细胞原生质体易于培养,在KM8p+1.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA培养基中培养25 d可形成肉眼可见的愈伤组织.     

木霉纤维素酶的诱导形成及其调节I.槐糖对木霉EA3-867纤维素酶形成的诱导作用

在槐豆荚提取液中分离到白色针状的槐糖结晶,该糖对拟康氏木霉(Trichoderma pseudo-Koningii Rafai) EA3-867的纤维素酶(C1和Cx)有强力的诱导作用。在纤维素酶活力,尤其是产酶速度上明显超过纤维素的诱导作用。槐糖的诱导作用与添加槐糖的时间和菌种有关,并受甘油强烈阻遏。在以纤维二糖(0．5％)为碳源培养时,木霉EA3-867也能较迅速地形成纤维素酶,但在EA3-867的甘油培养物中加入纤维二糖(5×10-3M)并不能诱导Cx酶。槐糖和纤维素对纤维素酶的诱导作用,无论在诱导胞外和胞内纤维素酶的成分上或从凝肢电泳图上,都十分相似。作者认为木霉EA,一867的纤维素酶形成同时受诱导一阻遏机制调节,并对组成型和诱导型的纤维素酶的作用,以及固体纤维素对纤维素酶可能的诱导机制作了推测。     

青霉的纤维素酶抗降解物阻遏突变株的选育

从土样中筛出一株生长快,产纤维素酶较高的斜卧青霉(Penicillium decumbens114-2)。能在全纤维素(hlocellulose)双层平板上形成清晰的透明圈。摇瓶培养的滤纸酶活可达8.8mg 葡萄糖/ml.h。 114-2菌株(其纤维素酶合成可为葡萄糖所阻遏)经UV和NG诱变处理后,在含葡萄糖的全纤维素平板上筛选到多株仍能形成明显透明圈的突变株。其中JN15和JU1在含葡萄糖的全纤维素液体培养基中,在残余葡萄糖浓度为 1％左右时,滤纸酶活可分别达到7.3 和13.9mg葡萄糖ml·h。这是出发株114-2和纤维素酶高产菌株木霉EA_3-867和QM9414所不能的。在不加阻遏剂的对比试验中,两个突变株的纤维素酶产量都比较高。其中,JU1的滤纸、CMC和棉花酶活分别达到33mg葡萄糖/ml·h,234mg葡萄糖/ml·h和86mg葡萄糖/ml·24h。     

纤维素酶制剂活力的测定方法

由绿色木霉EA₃-867所制备的纤维素酶制 剂是一种复合酶,除了纤维素酶外,还有半纤维 素酶、果胶酶等。而纤维素酶本身又是一种多 组分酶,一般认为它包括有C₁酶、Cx酶和fl- 葡萄糖普酶^[1-3] C₁酶能使天然纤维素降解成 直链纤维素,而Cx酶能使直链纤维素分解成纤 维二糖等较小单位,纤维二糖等再经β-葡萄糖 普酶作用,生成最终产物葡萄糖。     

小叶旱烟(Nicotiana rustica)茎愈伤组织的原生质体再生成完整植株的研究

用纤维素酶成功地从小叶旱烟茎愈伤组织中分离出了大量具有活力的原生质体。在所确定的培养条件下,由原生质体培养出了愈伤组织,并发育成完整植株。同时,对IAA、α-NAA和激动素在原生质体再生成完整植株中的作用进行了研究。