编码山羊补体C3d与口蹄疫病毒VP1融合蛋白重组质粒的构建及表达

旨在构建含分子佐剂山羊补体C3d基因的O型口蹄疫病毒VP1基因真核表达质粒。克隆山羊C3d基因, 通过linker(G4S)2将3拷贝C3d基因串联; 克隆羊源O型口蹄疫病毒VP1基因, 通过linker(G4S)2与3拷贝C3d基因相连, 构建重组质粒pUC19-VP1-C3d3。将VP1-C3d3融合基因亚克隆入含有分泌表达信号肽tPA序列的pcDNA3.1(+)CMV启动子下游, 构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-tPA-VP1-C3d3。在脂质体介导下, 将pcDNA3.1-tPA -VP1-C3d3转染HeLa细胞。间接免疫荧光分析表明, VP1- C3d3在HeLa细胞中获得了瞬时表达, Western blot分析证实转染的阳性细胞能分泌预期大小(133 kD)的融合蛋白。重组质粒pcDNA3.1-tPA-VP1-C3d3为研制以羊补体C3d为分子佐剂的口蹄疫新型疫苗奠定了基础。     

以CpG为佐剂的犬细小病毒基因疫苗的初步研究

目的研制犬细小病毒(CPV)基因疫苗。方法以CPV VP2基因为基因免疫的目的基因,以pcDNA3和pcDNAK质粒为基因免疫的载体,以非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)为核心的免疫刺激序列为免疫佐剂,构建重组质粒并免疫BALB/c小鼠和毕格犬。结果经pcDNA3-VP2C1(含1个拷贝CpG基序)基因免疫的BALB/c小鼠能产生抗CPV血凝抑制抗体;对于经CPV灭活苗初次免疫的毕格犬,用pcDNAK-VP2C2(含2个拷贝CpG基序)质粒免疫产生的再次免疫应答优于pcDNA3-VP2C1。结论VP2基因、pcDNAK和犬源CpG可用于CPV基因疫苗的进一步研究。     

MMP-7基因真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达与鉴定

目的：构建MMP-7基因真核重组质粒,检测并鉴定MMP-7在人宫颈癌HeLa细胞中的表达。方法：提取宫颈癌组织总RNA,通过基因克隆构建MMP-7基因真核表达重组质粒pcDNA3.1（＋）/MMP-7,酶切、PCR及基因测序鉴定,用阳离子脂质体介导采用基因转染技术转染人宫颈癌Hela细胞,RT-PCR检测外源基因的表达、间接免疫荧光法检测对表达产物进行鉴定。结果：成功构建了重组表达质粒pcDNA3.1（＋）/MMP-7并转染了人宫颈癌Hela细胞,通过RT-PCR可以检测到MMP-7 mRNA在Hela细胞中的表达,经间接免疫荧光反应可检测到明显的阳性反应,而转染空载体组表达阴性。结论：构建的重组质粒pcDNA3.1（＋）/MMP-7能在Hela细胞中表达,为该蛋白在人子宫癌后续的功能研究奠定了基础。     

口蹄疫病毒多基因重组质粒在BHK-21细胞中的表达

利用定点突变的原理,获得包含有口蹄疫病毒P1,2A,3C及部分2B编码区的目的基因片段,KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后,定向克隆于真核表达质粒载体pcDNA3.1（+）,经筛选、鉴定及DNA序列分析后,将重组质粒pcDNA3.1/P12X3C转染BHK-21细胞,通过双抗体夹心ELISA方法和间接免疫荧光标记方法,检测细胞中表达的口蹄疫病毒抗原。结果表明,口蹄疫病毒基因片段正确克隆到真核表达质粒载体上,重组质粒pcDNA3.1/P12X3C可在BHK-21细胞中表达FMDV目的蛋白。     

小鼠Uncv基因克隆及真核表达

目的 克隆小鼠的Uncv基因并在真核细胞表达.方法 采用RT-PCR方法扩增小鼠皮肤组织中Uncv基因编码区,以真核表达质粒pcDNA 3.1-Flag为载体,构建Uncv真核表达质粒,将重组载体转染Hela细胞并用Western blot法检测基因表达.结果 构建Uncv基因真核表达载体pcDNA 3.1-Flag/Unev,重组质粒在Hela细胞中有效表达约95×103的融合蛋白.结论 成功构建真核表达载体pcDNA 3.1-Flag/Uncv,并且在真核细胞中有效表达,为研究Uncv基因生物学功能奠定基础.     

PA28γ及其胞浆定位突变体的构建及在肝癌细胞HepG2中的表达

目的：野生型PA28γ和核定位序列突变的PA28γ真核表达质粒并检测其在人肝癌细胞株HepG2中的表达,为进一步研究PA28γ的功能提供实验基础。方法：采用RT-PCR法从293T细胞中克隆得到PA28γ cDNA开放阅读框全长序列,并将该片段亚克隆到pMD-18T载体中,在该载体中利用定点突变获得核定位序列缺失的克隆。分别将野生型（WT）和突变型（MT）PA28γ克隆克隆到真核表达载体pDsRed1-C3中,脂质体法转染293T细胞确定两种克隆的细胞定位。再将野生型和突变型PA28γ分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)Flag中,构建好的真核表达质粒采用脂质体法转染人肝癌细胞株HepG2,经G418筛选、Western Blot鉴定后,获得分别高表达野生型PA28γWT和PA28γMT的HepG2细胞系。结果：双酶切及DNA测序结果表明,成功克隆和构建了含PA28γWT和PA28γMT的pDsRed1-C3和pcDNA3.1(-)Flag重组质粒;荧光显微镜观察证实在293T细胞中pDsRed1-C3/PA28γWT定位在胞核中而pDsRed1-C3/PA28γMT定位在胞浆中;Western Blot检测HepG2/ pcDNA3.1(-)Flag/PA28γWT和HepG2/ pcDNA3.1(-)Flag/PA28γMT,证实所筛选的HepG2细胞高表达相应目标蛋白。结论：成功构建了高表达野生型PA28γ和胞浆定位PA28γ的HepG2细胞系,为进一步研究人类PA28γ基因的功能奠定了基础。     

grp78真核表达载体构建及其稳定转染HeLa细胞系建立

目的构建人grp78基因真核表达载体,并建立稳定高表达grp78的人宫颈癌HeLa细胞系。方法用RT—PCR方法从人宫颈癌HeLa细胞中扩增grp78基因编码区,将PCR产物克隆到pcDNA3．1（＋）真核表达载体,构建重组质粒pcDNA3．1（＋）／grp78并测序鉴定。用构建成功的pcDNA3．1（＋）／grp78真核表达载体转染入人宫颈癌HeLa细胞,经G418筛选获得grp78稳定高表达的HeLa细胞系,并用RT—PCR及Western印迹方法鉴定。结果成功构建pcDNA3．1（＋）／grp78真核表达载体,筛选获得稳定高表达人grp78的HeLa细胞系。结论grp78真核表达载体的成功构建和稳定高表达grpTS的HeLa细胞系的建立为进一步研究grp78的功能奠定了基础。     

塞内卡病毒A结构蛋白VP2诱导PK-15细胞自噬的研究

本研究在塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)诱导自噬的基础上,着重探究VP2蛋白在细胞自噬过程中的作用。构建VP2基因真核表达载体pcDNA3.1-VP2,将其转染至PK-15细胞,通过检测自噬蛋白和相关基因的表达情况,明确VP2蛋白对细胞自噬的影响。结果显示,本研究成功构建了pcDNA3.1-VP2真核表达载体,且SVA VP2基因在PK-15细胞中正常表达;与对照组相比,VP2蛋白显著上调LC3蛋白的表达水平（P<0.01）;同时,自噬基因LC3、Beclin-1和ATG5转录水平均显著提高（P<0.01）。综上所述,本研究证实SVA VP2蛋白可诱导PK-15细胞自噬,且VP2蛋白与自噬蛋白和基因表达水平呈正相关,为进一步研究病毒感染与致病机制打下基础。     

柯萨奇B3病毒结构和非结构蛋白基因重组质粒的构建及其在体外真核细胞中的表达

制备CVB3结构蛋白和非结构蛋白重组质粒DNA疫苗时 ,采用RT PCR从CVB3感染的HeLa细胞中扩增VP1、VP2、2A和 3D基因 ,重组入真核表达质粒 pcDNA3中 ,构建pcDNA3/VP2、pcDNA3/VP1、pcDNA3/ 2A和pcDNA3/ 3D重组质粒 ,经酶切和测序证实扩增的序列并将各重组质粒体外转染真核细胞COS 7,用RT PCR检测mRNA的转录 ,用Western blot检测表达产物。结果 4种重组质粒酶切出相应大小的目的片段 ,经测序证实为CVB3相应序列 ,Western blot证实能够在体外真核细胞中表达。本文成功构建CVB3结构与非结构蛋白的重组质粒DNA疫苗 ,为进一步研究其免疫效果奠定了基础。     

IL-2与猪细小病毒VP2基因双表达载体的构建及免疫原性的研究

将白细胞介素-2基因和猪细小病毒VP2基因主要抗原区克隆至pCI-neo真核表达载体中,构建了pCIneo-IL2-VP2重组质粒,用脂质体将其转染到PK-15细胞中,利用免疫荧光方法检测在体外表达情况。并以小鼠为动物模型,将pCIneo-IL2-VP2重组质粒、对照组pCI-neo和猪细小病毒活疫苗通过肌肉注射进行免疫,检测免疫小鼠的淋巴细胞转化功能,特异性CTL杀伤活性和血清抗体滴度。结果显示,pCIneo-IL2-VP2在体外能够诱导PK-15细胞表达VP2蛋白,小鼠注射pCIneo-IL2-VP2质粒1周后能够诱导机体产生抗体,4周时达到峰值,与活疫苗对照组产生的抗体滴度、诱导T淋巴细胞增殖和诱导强的细胞毒性基本一致。试验表明,构建的pCIneo-IL2-VP2能够有效诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。     

口蹄疫病毒多基因重组质粒的体外表达及衣壳组装

PCR扩增获得包含口蹄疫病毒P1、2A、3C、3D及部分2B编码区的目的基因片段P12X3C3D,将P12X3C3D经AflⅡ和XbaⅠ双酶切后,定向克隆于真核表达质粒载体pcDNA3.1( );另将PCR扩增获得的P12X3C3D直接与真核表达质粒载体pTARGET^TM连接,进行筛选、鉴定及DNA序列分析,分别获得重组质粒pcDNA3．1／P12X3C3D、pTARGET／P12X3C3D。将重组质粒分别转染BHK-21细胞,通过双抗体夹心ELISA方法和间接免疫荧光标记方法检测细胞中表达的口蹄疫病毒抗原,用磷钨酸负染,以电子显微镜观察转染重组质粒的细胞中组装的口蹄疫病毒空衣壳。结果表明,口蹄疫病毒基因组片段正确克隆到真核表达质粒载体上,重组质粒pcDNA3．1／P12X3C3D、pTARGET／P12X3C3D均可在BHK-21细胞中表达FMDV目的蛋白。其中重组质粒pTARGET／P12X3C3D表达的口蹄疫病毒抗原蛋白,能够在细胞内正确组装成病毒空衣壳。     

埃博拉病毒GP和VP40蛋白在哺乳动物细胞中的共表达及病毒样颗粒装配

目的：制备基因重组埃博拉病毒样颗粒,为疫苗研究及埃博拉病毒特异抗原、抗体检测提供基础。方法：根据埃博拉病毒扎伊尔株的GP和VP40蛋白氨基酸序列,以哺乳动物细胞基因表达密码子偏好性进行基因优化设计;化学合成GP和VP40基因片段并分别构建于表达质粒pcDNA3.1或同时构建到具有双表达单元的质粒pBudCE4.1;重组质粒经lipofectamine2000转染293FT细胞;以Western blot检测重组蛋白GP和VP40的表达;通过电镜观察病毒样颗粒。结果：构建的重组质粒经酶切鉴定及测序分析证实构建成功;Western blot结果显示,共转染分别表达GP和VP40的两个质粒或转染共表达两个蛋白的质粒都发现GP特异反应条带产生,且大小与预期相符,此外,转染共表达质粒产生的GP蛋白表达明显强于两个质粒共转染,并同时可检测到VP40的表达;电镜观察到典型的丝状的埃博拉病毒样颗粒。结论：在293FT细胞中基因优化的埃博拉病毒GP和VP40可有效表达并装配为病毒样颗粒,为进一步研究奠定了基础。     

新城疫C3d-P29分子佐剂F基因疫苗的构建

C3d是补体C3的裂解产物之一,与抗原相连时可以明显提高抗原分子的免疫原性.CR2/CD21在其功能发挥过程中起到重要作用,P29为编码C3d与CR2结合区域的基因.从健康AA肉鸡肝脏中RT-PCR克隆C3d cDNA,设计引物克隆P29至pUC19载体,利用同裂酶BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ构建pUC-P29.n.酶切获得P29.n,将其克隆至真核表达载体pCDNA3.1( ).最后RT-PCR扩增新城疫F基因,定向克隆至真核表达载体pCDNA-P29.n中P29.n的上游,构建完成新城疫F基因疫苗.3周龄SPF鸡进行基因免疫,结果pCDNA-F-P29.4、pCDNA-F-P29.6较pCDNA-F都能够提高HI抗体水平及保护力,虽然HI抗体水平不及灭活苗,但是能够抵抗致死量病毒的攻击,并且pCDNA-F-P29.6效果更好.目前发表的关于C3d的佐剂作用的文章多是关于鼠C3d,相应的抗原不能够自然感染鼠类,关于鸡C3d的报道较少.研究结果为进一步开发和利用鸡C3d奠定了基础.     

小鼠IL-27真核表达载体的构建及其在RAW264.7 细胞中的表达

目的:构建小鼠白介素27(Interleukin 27,IL-27)单链融合基因的真核表达载体并检验其在RAW264.7细胞中的表达情况。方法:提取小鼠脾细胞总RNA,通过RT-PCR扩增出小鼠EBI3和p28 c DNA。采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE PCR)通过编码疏水性多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列连接小鼠EBI3和p28基因片段,构建小鼠IL-27单链融合基因(mouse single chain IL-27,msc IL-27),并将其克隆至pc DNA3.1(+)载体。通过酶切和测序鉴定阳性重组载体,将重组质粒pc DNA3.1-IL-27通过脂质体转染法转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7,通过RT-PCR方法检测目的基因的表达。结果:测序分析表明,小鼠IL-27单链融合基因中EBI3、linker和p28的连接顺序、方向及碱基序列与预期相符。在转染后的RAW264.7细胞中检测到了小鼠IL-27 m RNA的表达。结论:成功构建了小鼠IL-27单链融合基因及其真核表达载体,并在RAW264.7细胞中实现表达,为进一步探讨IL-27的生物学功能奠定了基础。     

可溶性55kD人肿瘤坏死因子受体(shTNFR55)在变铅青链霉菌中的分泌表达

从 Ｈｅ Ｌａ 细胞中提取总 Ｒ Ｎ Ａ,采用反转录 Ｐ Ｃ Ｒ 技术,从该总 Ｒ Ｎ Ａ 中扩增了约 ５３０ ｂｐ 的ｓｈ Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ５５ 基因的 ｃ Ｄ Ｎ Ａ,并克隆至质粒 ｐ Ｕ Ｃ ｍ ｅｌ中酪蛋白酶 ｍ ｅｌ Ｃｌ 分泌信号肽编码序列的下游,构建成含融合基因 ｍ ｅｌ／ Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ 的重组质粒 ｐ Ｕ Ｃ ｍ ｅｌ／ Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ．把融合基因 ｍ ｅｌ／ Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ 插入链霉菌表达质粒 ｐ Ｉ Ｊ４５９ 的多克隆位点,使之位于 ｅｒｍ 强启动子的下游,得到重组表达质粒 ｐ Ｉ Ｊ４５９ ｍ ｅｌ／ｓ Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ．经 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交证明重组质粒 ｐ Ｉ Ｊ４５９ ｍ ｅｌ／ｓ Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ 插入了 ｓ Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ５５ 基因片段．对重组菌株 Ｓｔｒｅｐｔｏｍ ｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ（ｐ Ｉ Ｊ４５９ ｍ ｅｌ／ｓ Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ）的发酵液进行 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ、受体配基杂交（ Ｌｉｇａｎｄ ｂｌｏｔ）分析、对 Ｔ Ｎ Ｆ 敏感的 Ｌ９２９ 细胞的细胞毒性中和试验表明,可溶性肿瘤坏死因子受体 ｓ Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ５５ 在链霉菌中得到了分泌表达,表达产物具有生物学活性．表达产物的分子量约在 ２６～２８ ｋ Ｄ 之间．     

共表达O型口蹄疫病毒P1-2A基因和猪白细胞介素18的重组鸡痘病毒的构建

目的:为获得能有效预防O型口蹄疫病毒的重组鸡痘病毒活载体疫苗奠定基础。方法：在O型口蹄疫病毒P1-2A基因上游引入Kozak序列,下游通过Linker与细胞因子IL-18联结,获得P1-2A基因与猪IL-18基因融合表达基因盒P1-2A-IL-18,将该表达基因盒克隆至鸡痘病毒中间转移载体pUTAL-3C中,构建重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-3C- P1-2A-IL-18。通过脂质体转染法,将pUTAL-3C- P1-2A-IL-18与鸡痘病毒282E4株共转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,通过BrdU三次加压筛选,挑选出单克隆重组病毒株。结果：经RT-PCR和间接免疫荧光法鉴定,证明所筛选的1株重组鸡痘病毒在CEF中能正确表达P1-2A-IL-18基因盒。结论：成功获得了一株共表达O型口蹄疫病毒P1-2A基因和猪白细胞介素18基因的重组鸡痘毒疫苗候选株rFPV-3C-P1-2A-IL-18。     

Characterization and in vitro expression of non-structural 1 protein of canine parvovirus (CPV-2) in mammalian cell line

Parvoviruses are small, 260-A-diameter, icosahedral, non-enveloped, single-stranded DNA viruses with a genome of approximately 5 kb. Non structural protein, (NS-1) is especially relevant, being both essential for virus replication and the main factor responsible for virus pathogenicity and cytotoxicity. This protein has also been reported to possess the property of killing of transformed cells. The present study was carried out to clone, characterize and express the NS-1 gene of canine parvovirus. NS-1 complete CDS 2020bp was amplified, cloned into eukaryotic expression vector pcDNA 3.1(+), sequenced and characterized by in vitro expression analysis. Functional activity of recombinant construct, pcDNA.cpv.NS-1, was evaluated by RT-PCR and flow cytometry for the expression of NS-1 specific mRNA and NS-1 protein, respectively, in transfected HeLa cells. This recombinant plasmid may serve as an important tool to evaluate the apoptotic potential of NS-1 protein of canine parvovirus in cultured HeLa cells.