香蕉胁迫相关蛋白基因的克隆及其表达分析

通过随机克隆测序的方法从香蕉根系cDNA文库中获得胁迫相关蛋白基因,命名为MaSAP1(GenBank登录号为AGH14257.1)。扩增获得的cDNA序列与质粒OZ092的目的片段序列一致,表明MaSAP1是香蕉SAP基因编码框全长cDNA,包含一个510bp的最大开放阅读框,编码一个长169个氨基酸的蛋白质。蛋白质序列同源比对发现其含有完整的A20和AN1基序结构。系统进化树比对分析表明,MaSAP1与水稻和獐茅的亲缘关系较近。组织特异性研究表明,MaSAP1基因在香蕉根和果实中的表达量较高,在茎中的表达量最低。实时荧光定量PCR分析表明MaSAP1响应激素的处理,同时也响应干旱、低温、高盐和枯萎病菌的侵染等胁迫。可见,MaSAP1基因在植物生长发育和植物响应逆境中具有重要作用。     

植物甜蛋白brazzein基因的克隆与表达

根据大肠杆菌偏爱的密码子,利用PCR技术体外人工合成brazzein cDNA序列,并将其克隆至原核高效表达载体pET30a( )中。重组载体pET30a( )-brazzein转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE结果证明pET30a( )-brazzein在大肠杆菌中获得高效表达,目的蛋白占总菌体蛋白25％左右。     

香蕉BTB/POZ域基因的克隆及表达分析

利用抑制缩减杂交文库从香蕉中分离获得一个cDNA片段,结合RACE技术获得该基因的全长序列,命名为MaBTB基因,该cDNA的ORF全长1 080个碱基。通过Blastx同源性分析结果显示该基因的氨基酸序列与水稻OsBTB、苜蓿MtBTB/POZ、拟南芥AtBPM4、葡萄VvBTB、玉米ZmBTB 、松树PsBTB基因的氨基酸序列同源性很高,分别为86%、85%、84%、84%、86%和87%。遗传进化树分析发现该基因与苜蓿MtBTB/POZ和拟南芥AtBPM4基因亲缘关系较近。用RT-PCR的方法研究该基因在不同胁迫处理下的表达特性,结果表明该基因在盐、乙烯和紫外线处理后其表达量逐渐增强;低温处理和香蕉尖孢镰刀菌4号生理小种处理后该基因表达量开始降低,随后逐渐升高;伤害处理后该基因的表达量没有明显变化。     

番茄LeRma1基因的克隆与表达

以番茄‘哈大粉801’为试材,利用RT-PCR技术,克隆得到1个E3泛素蛋白连接酶基因LeRma1（GenBank登录号XM_004243764.1）。对LeRma1基因进行序列分析,并对LeRma1基因在番茄植株的不同部位以及在非生物胁迫（干旱、盐、碱、高温、低温）下的表达和生理特性进行研究,为培育和改良番茄品种提供理论依据。结果表明：（1）序列分析显示,LeRma1基因的cDNA全长序列729 bp,编码242个氨基酸,分子量为27.05 kD,理论pI 7.97;同源分析显示,番茄LeRma1蛋白与马铃薯的一致性最高（91%）。（2）半定量PCR检测表明, LeRma1基因在番茄根、茎、叶、花、果实中均有表达,且表达差异不明显。（3）干旱胁迫下,LeRma1基因在番茄叶片中优势表达,而在整个干旱过程中根部的LeRma1基因表达量变化不明显;抗旱相关基因LEA、 DREB2A、ABI3在干旱胁迫过程中,番茄叶片中均有表达,且其表达量呈上升趋势,而在根部DREB2A、ABI3基因基本没有检测到。（4）干旱胁迫过程中,番茄植株中丙二醛（MDA）含量呈显著升高趋势,质膜系统严重损伤,体内保护酶（SOD、POD、CAT）活性上升,且根部活性总体明显高于叶片。（5）在非生物逆境（盐、碱、高温、低温）胁迫过程中,LeRma1基因在番茄叶片和根部的表达几乎都有增强的趋势,且在叶片中均是胁迫3 h后诱导起始增强表达。研究认为,LeRma1基因是一个受干旱胁迫诱导增强表达的基因,且在叶片中优势表达,说明LeRma1基因对植物耐受干旱胁迫所起的作用存在一定的组织差异性,而且LeRma1基因可能参与番茄的干旱应答及信号转导过程,在番茄抵抗其他非生物胁迫中LeRma1基因也可能具有一定的作用。     

植物甜蛋白des-pGlu1-Brazzein基因在乙醇氧化酶缺陷型甲醇酵母中的表达及其活性分析

采用BglⅡ酶切重组表达载体pPIC9K-Bra,纯化后电击转化甲醇酵母菌GS115,构建乙醇氧化酶缺陷型表达菌株GS115-pPIC9K-Bra,筛选鉴定后,以0.5％的甲醇进行诱导,表达的目的蛋白约占上清总蛋白的95％,纯度较高,并具有一定的甜度.成功构建了乙醇氧化酶缺陷型的甲醇酵母表达菌株,为深入研究其应用奠定了基础.     

黄瓜过敏性诱导反应蛋白基因(CsHIR1)原核表达及其多克隆抗体制备

该试验用黄瓜霜霉菌侵染黄瓜幼苗,并通过PCR方法克隆其过敏性诱导反应蛋白(HIR)的基因CsHIR1,构建原核表达载体pET28a-CsHIR1,实现在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中的高效表达;对诱导表达的时间和IPTG的浓度进行了优化;利用钴离子螯合层析纯化了重组蛋白并制备高效价多克隆抗血清。结果表明:该黄瓜过敏性反应诱导蛋白以包涵体的形式表达,最佳诱导时间和IPTG浓度分别为4h和0.5mmol·L-1;经纯化,得到高纯度的分子量为34kD重组蛋白CsHIR1。Western blotting显示CsHIR1的抗体具有较好的特异性。原核表达体系的建立和多克隆抗体的制备为进一步研究CsHIR1基因在黄瓜中的功能奠定了基础。     

甘蓝型油菜BnFLA基因的克隆及表达分析

利用同源克隆法从甘蓝型油菜中获得了1个类成束阿拉伯半乳聚糖蛋白基因(FLA),命名为BnFLA。BnFLA基因开放阅读框长为1 200bp,编码399个氨基酸,分子量为42 885.9Da,等电点为6.37。预测的BnFLA蛋白包含N-端信号肽、2个AGP-like结构域、2个fasciclin-like结构域和C-端GPI-anchor序列。系统进化分析表明BnFLA氨基酸序列与BrFLA17和AtFLA2进化关系较近,一致性分别为98%和87%。qRT-PCR分析表明,BnFLA基因在油菜各组织均有表达,并以下胚轴中表达量最高,其次为子叶,茎秆中表达最少;BnFLA基因的表达受到GA3、BR、IAA、ABA和NaCl的诱导,但受6-BA、蔗糖、低温和PEG抑制。研究认为,油菜中BnFLA基因可能参与激素信号转导途径和非生物胁迫应答。     

小鼠和鸡的类E1酶新基因UBAL的克隆和表达分析

根据含有UBA_NADbindingdomain的EST序列,利用同源性序列查找和EST拼接的方法,克隆得到鼠、鸡的新基因UBAL(ubiquitin-activatingenzymelikeprotein),它们都具有泛素活化酶Uba1的保守结构域Ⅰ,可能的ATP结合序列GVGGVG和Cys活性位点.用半定量RT-PCR分析11种成年小鼠组织的mUBAL表达量,显示mUBAL在成年小鼠多种组织中都有表达,在肾、睾丸、脑、心脏中尤为丰富.用mUBAL的编码区为探针进行的小鼠胚胎整体原位杂交显示,mUBAL在胚胎发育早期即开始表达,并随着前内脏内胚层(AVE)的向前迁移而迁移,随后在胚胎的端脑区特异性表达.与小鼠胚胎的表达谱相类似,gUBAL在HH14、HH16和HH18期鸡胚中的表达主要集中在头部.根据mUBAL和gUBAL的序列相似性保守结构域和活性位点,可以初步断定它们可能是类泛素活化酶E1的新成员,可能通过活化类泛素蛋白参与胚胎脑部的发育和调控成体组织的功能.     

海岛棉GbTCP15基因的克隆与表达分析

根据陆地棉GhTCP15基因序列,设计1对引物,通过PCR技术从海岛棉品种‘新海21号’中克隆一个同源基因,命名为GbTCP15。海岛棉GbTCP15基因具有一个1 056 bp开放阅读框,编码351个氨基酸,预测分子量约为38 057.4 kD,等电点为9.01,序列中含有一个高度保守的TCP结构域。氨基酸序列对比表明,海岛棉GbTCP15蛋白与其他植物中的TCP蛋白有较高的一致性,说明该基因在进化过程中是相当保守的。亚细胞定位结果显示,GbTCP15主要分布在细胞核上,推测GbTCP15在复制和转录的过程中发挥着信号转导以及转录调控等作用。进化树分析表明,海岛棉GbTCP15基因与雷蒙德氏棉GrTCP15基因分布在同一分支上。实时荧光定量PCR表明,海岛棉GbTCP15基因在茎部和15 d纤维中表达量较高。研究表明,GbTCP15转录因子可能参与棉花纤维以及表皮毛的发育。     

香蕉谷氨酸脱羧酶基因克隆与表达

根据抑制缩减杂交文库获得的香蕉谷氨酸脱羧酶基因片段,利用RACE技术,首次从香蕉果实中克隆了谷氨酸脱羧酶基因的cDNA全长.结果表明,该cDNA的ORF全长1 500 bp,编码499个氨基酸.Blast分析表明,该基因所推导的氨基酸序列与水稻、柑橘、白杨、番茄等具有较高的一致性,分别为82%、81% 、79% 、78%,推测其编码的蛋白质分子量为56.25 kD,等电点5.21,具有与钙调蛋白结合的C端延伸区域和磷酸吡哆醛结合位点.组织特异性和果实采后正常成熟不同阶段表达结果显示,该基因在香蕉根、茎、叶、花、果实中均有表达,果实中的表达量较高,正常成熟表达量的增加可能受内源乙烯诱导并促进乙烯生物合成,推测其可能在不同的生理过程中起作用,并且与果实成熟及乙烯生物合成密切相关.     

棉花微管结合蛋白基因GhCLASP1的克隆与表达分析

CLASP蛋白(CLASPs)是一种能够特异地与微管结合,参与调节微管结构与功能的微管结合蛋白(MAPs),在植物细胞形成、细胞伸长等方面起着关键作用。该研究利用电子克隆结合RT-PCR技术从陆地棉(Gossypium hirsutum L.)中克隆获得1个CLASP基因,命名为GhCLASP1(NCBI登录号为KP742966)。序列分析显示,GhCLASP1属于CLASP基因家族,开放阅读框长度为4 188bp,编码含1 395个氨基酸残基的蛋白;GhCLASP1蛋白含有1个HEAT重复结构域和2个CLASP-N端结构域。进化分析表明,GhCLASP1与可可树(Theobroma cacao)CLASP蛋白的亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,GhCLASP1在棉花的根、茎、叶、花及纤维发育的不同时期均有表达,且GhCLASP1基因表达量最大值出现在纤维发育次生壁加厚期(开花后27d),推测GhCLASP1基因可能对棉花纤维次生壁的形成起着重要的作用。利用本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达系统对GhCLASP1基因编码的蛋白进行亚细胞定位结果显示,GhCLASP1蛋白定位在细胞膜上。上述结果为进一步研究CLASP基因在棉花中的功能奠定了基础。     

香蕉肉桂醇脱氢酶基因的克隆及表达分析

肉桂醇脱氢酶(CAD)在木质素合成过程中起关键作用。通过RACE(rapid-amplification of cDNA ends)方法从香蕉根系cDNA均一化全长文库中获得一个肉桂醇脱氢酶基因,命名为MaCAD1(GenBank登录号为KF582533)。MaCAD1是香蕉MYB基因编码框全长cDNA,包含一个1 077bp的最大开放阅读框(ORF),编码358个氨基酸。蛋白质序列同源比对发现,其含有完整的醇脱氧酶的典型保守结构域,属于典型的CAD蛋白。系统进化树比对分析表明,MaCAD1与水稻OsCAD6(CAD39907)的亲缘关系较近。组织特异性研究表明MaCAD1基因组成型表达于香蕉各个组织。在耐病和感病品种中,MaCAD1均上调表达,但在耐病品种中MaCAD1在所有时间点相对于对照增加的倍数均高于感病品种,表明MaCAD1基因在香蕉的抗病性中起着重要作用,MaCAD1可以作为一个新的响应枯萎病侵染的标记基因。     

葡萄病程相关蛋白1基因的克隆和表达分析

以葡萄品种‘左优红’组培苗叶片为材料,利用同源克隆法获得其病程相关蛋白1基因VvPR1的cDNA全长序列。扩增片段大小为486bp,编码161个氨基酸,分子量17.5kDa,等电点PI=8.69,含有6个保守半胱氨酸,4个allergenV5/Tpx-1related保守结构域。VvPR1与多种植物PR1高度同源。实时定量PCR检测结果表明VvPR1在葡萄叶片中相对表达量最高;霜霉病菌、低温、盐和干旱胁迫均可显著诱导其表达;水杨酸、脱落酸、茉莉酸、一氧化氮、过氧化氢和硫化氢等亦可诱导其大量表达,据此推测,VvPR1参与了多种生物胁迫和非生物胁迫过程。     

香蕉（‘威廉斯突变体’）苯丙氨酸解氨酶基因克隆、表达及酶活性分析

选用抗枯萎病突变体‘威廉斯突变体(Musa spp.AAA,Williams Mutant)'为试材,用RT-PCR技术从香蕉叶中克隆得到一个长为1 504 bp,编码501个氨基酸的苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因cDNA序列.序列分析与其它植物PAL蛋白有较高同源性,尤其是麻疯树和柑橘属同源性高达93%.半定量PCR和酶活性测定被采用研究威廉斯突变体在接种枯萎病菌Fusarium oxysporum f. sp.cubense.roce 4(FOC4)茎中PAL表达的变化,结果显示茎中PAL活性呈规律性变化,且均高于同期对照,与其它植物相关研究结果类似,表明PAL与香蕉抗枯萎病密切相关.     

香蕉凝集素基因的克隆及在成熟果实中的特异性表达

采用RT-PCR的方法克隆香蕉凝集素(Bankc)基因,对其全序列进行了测定并与已发表的BanLec基因序列进行了比较。采用定量PCR的方法对该基因在果实成熟过程中和香蕉不同组织中的表达进行了研究,结果表明：BanLec基因的表达同时具有发育特异性和组织特异性,即仅在果实中表达,而且其表达量随果实成熟度的变化而变化。     

茶树脂氢过氧化物裂解酶基因CsiHPL1的克隆及表达

根据茶树基因CsiHPL1的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR方法从茶树品种龙井43′中克隆了CsiHPL1序列,并分析了CsiHPL1在生物和非生物胁迫下的诱导表达情况及亚细胞定位。结果表明,CsiHPL1包含一个1 476 bp的最大开放阅读框,编码491个氨基酸,预测为13-HPL基因。Real-Time PCR分析结果表明,CsiHPL1的表达受到茶尺蠖取食、机械损伤和茉莉酸的诱导;构建了CsiHPL1与绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组表达载体,经农杆菌瞬时转化烟草叶片,利用激光共聚焦显微镜在叶绿体中观察到GFP荧光,表明CsiHPL1编码的蛋白质为叶绿体蛋白质。     

路易斯安那鸢尾LiPCS1基因克隆和表达分析

通过对路易斯安那鸢尾转录组进行分析,获得路易斯安那鸢尾络合素合酶基因(LiPCS1)的中间片段,利用RACE技术分别克隆到其全长,并对该基因进行生物信息学分析。结果表明,该基因全长1 683bp,预测编码501aa,含有半胱氨酸(Cys)、组氨酸(His)和天冬氨酸(Asp)3个必需氨基酸活性位点和重金属离子传感器基序(C368 C369 RMTC373 VRC376),与猴面花等植物同源PCS的相似位点达91.6%。表达分析结果表明,LiPCS1基因在内花瓣表达量最高,与其他组织差异显著,雄蕊、叶和茎的表达量基本在同一水平,外花瓣、根和雌蕊表达较低,雌蕊最低;随着铅处理时间增加,LiPCS1基因表达量在根系和叶片中表现先升高后下降的趋势,在铅处理3h达到最大并且差异显著。     

葡萄VvBAP1基因的克隆及表达特性分析

以抗性葡萄品种‘F-242’组培苗为材料, 利用同源克隆法克隆了葡萄VvBAP1基因。测序结果显示, VvBAP1扩增片段大小为531 bp, 可编码176个氨基酸序列。利用生物信息学分析VvBAP1基因编码的蛋白序列显示, 该蛋白分子量为19.43 kDa, 含有保守的钙离子依赖性的C2结构域; 等电点pI为9.42; 不稳定系数为37.09, 推测为稳定的亲水性蛋白; 含有多个丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点。实时荧光定量PCR表明, 该基因在根茎叶中均有表达, 其中在叶片中表达量较高; 盐胁迫、低温等逆境因子及逆境相关的信号物质, 如水杨酸和一氧化氮均可诱导VvBAP1的表达, 其中低温对其表达量影响更为显著, 推测该基因参与了葡萄抵御逆境胁迫的过程, 尤其是与低温相关的过程。