牡丹PsAGL6基因克隆与表达分析

该研究在转录组数据分析基础上,通过RT-PCR方法从牡丹(Paeonia suffruticosa.L)品种‘洛阳红’中克隆AGL6基因,并分析了其在不同组织和花型中的表达模式。结果显示:(1)AGL6开放阅读框长度732bp,编码244个氨基酸;结构域分析显示,该基因具有高度保守的MADS MEF2区、K区、AGL6I与AGL6II基序,归类于MADS-box基因家族,命名为PsAGL6,GenBank登录号为MF563611。(2)同源比对分析显示,牡丹PsAGL6与葡萄VvAGL6氨基酸序列相似度最高,达79%。(3)qRT-PCR分析结果显示,PsAGL6在牡丹各器官中均有表达,但营养器官中表达量较低,花器官中表达量较高,其中以萼片最高,花瓣与雌蕊次之;对4种牡丹花型花瓣的表达分析显示,PsAGL6基因在不同花型花瓣中的表达量差异明显,且蔷薇型牡丹花瓣相对表达量最高。研究表明,AGL6基因参与牡丹花器官的形成,为深入研究花器官发育的分子机制提供了帮助。     

转甜瓜CmSAMDC基因拟南芥的获得及其耐盐性研究

该研究以哥伦比亚生态型野生拟南芥为材料,将甜瓜CmSAMDC基因构建到植物双元表达载体pCAMBIA1304上,采用农杆菌介导法转入拟南芥,在含有50mg/L潮霉素(Hyg)MS固体培养基上筛选转基因后代,并利用T3代转基因幼苗进行耐盐性分析。结果显示:(1)成功构建了植物超表达载体35S∷CmSAMDC,并经农杆菌介导法转化拟南芥,潮霉素抗性筛选后获得了转CmSAMDC基因拟南芥T3代植株。(2)转CmSAMDC基因拟南芥T3代幼苗在含100、150、200mmol/L NaCl培养基中,侧根长势比野生型植株更为健壮;在200mmol/L NaCl浇灌处理后,转CmSAMDC基因T3代植株仍能维持正常生长,而野生型植株的生长明显受到抑制;在400mmol/L NaCl浇灌处理后16d,野生型植株逐渐死亡,而转基因植株仍能继续存活;对盐胁迫后植株的脂质过氧化程度(MDA)测定显示,野生型植株MDA水平较转基因植株上升更为明显。研究表明,过表达甜瓜CmSAMDC基因增强了转基因拟南芥的耐盐性。     

核桃JrsHSP17.3基因克隆及温度胁迫响应模式分析

通过分析核桃（Juglans regia）转录组,鉴定获得核桃热激蛋白家族sHSP17.3基因的全长cDNA序列,命名为JrsHSP17.3。JrsHSP17.3基因开放读码框474 bp,编码产物含157个氨基酸,分子量为17.64 kD,理论等电点为5.35。为了研究该基因表达的组织特异性及温度响应模式,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法,对高温和低温胁迫下JrsHSP17.3基因在根、茎、叶中的转录水平进行分析。结果显示,JrsHSP17.3基因在不同组织中均有表达;经高温（36 ℃～52 ℃）和低温（16 ℃～6 ℃）处理后,JrsHSP17.3基因均可被显著诱导,其中12 ℃胁迫1 h表达最高,为对照（非处理情况）的142.02倍。研究表明核桃JrsHSP17.3基因能够响应冷热温度胁迫,为进一步研究JrsHSP17.3基因的抗寒耐高温特性奠定基础。     

长日照下IQM3在CO的下游调控拟南芥主根长度

拟南芥(Arabidopsis thaliana)中IQM家族是含有IQ基序的钙调素结合蛋白家族,IQM3突变能增加主根长度,CO (CONSTANS)是光周期成花调控途径的重要成员,CO突变可缩短主根长度。该研究构建二者的双突变体研究IQM3与CO基因的遗传学关系。结果表明,新CO突变体co-12序列的第1个外显子上缺失了9个碱基ACTTGCTAG,其中含有限制性核酸内切酶BfaI的酶切位点CTAG。建立了可鉴定该突变体的分子标记：利用BfaI酶切跨编码区PCR产物时,野生型Col因有3个位点而得到4个片段,co-12因只有2个位点而得3个片段,CO/co-12杂合子得5个片段。在长日照下,co-12的主根长度比野生型Col短,iqm3-2的比野生型Col长,而双突变体co-12 iqm3-2的主根长度表型偏向于iqm3-2。因此,在长日照下,IQM3在CO的下游参与调控拟南芥主根长度。     

香菜CsEF 1α基因克隆与表达分析

翻译延伸因子EF 1α(elongation factor 1 alpha)是细胞中最丰富的蛋白质之一,其在确保mRNA正确解码以产生细胞蛋白质方面发挥重要作用。该研究采用RT PCR扩增方法克隆香菜CsEF 1α基因序列,利用生物信息学对CsEF 1α基因结构、序列特征及系统进化等进行分析,并采用qPCR探究CsEF 1α基因在香菜不同生长时期和非生物胁迫下的表达模式,为进一步揭示EF 1α基因调控机制的研究奠定基础。结果显示：(1)成功克隆获得香菜CsEF 1α基因序列;CsEF 1α基因包含1个1 344 bp的开放阅读框,编码447个氨基酸,分子式为C₂₂₀₂H₃₅₄₄N₅₉₄O₆₄₄S₂₀,蛋白质分子量为49.29 kD,等电点为9.12;氨基酸序列组成中赖氨酸数量最多(49个,占11.0%),色氨酸数量最少(3个,占0.7%);属碱性蛋白。(2)CsEF 1α蛋白主要由无规则卷曲(36.91%)和α 螺旋(30.43%)构成,定位于细胞质;系统进化树分析显示,CsEF 1α与胡萝卜、野生番茄、青蒿素和非洲菊的亲缘关系较接近;启动子分析包括4种植物生长发育元件、3种激素响应元件和3种胁迫响应元件。(3)qRT PCR结果显示,CsEF 1α基因的表达量随着香菜生长发育时间的延长而升高,并且与转录丰度的变化一致;CsEF 1α基因对4种不同非生物胁迫的响应表达模式有所差异;随着胁迫时间的延长,在盐胁迫下CsEF 1α基因表现出先升高后降低趋势,而在低温、高温和干旱胁迫下表现出先降低再升高的趋势。研究表明,CsEF 1α基因参与了香菜对非生物胁迫的应答,在香菜生长发育和非生物胁迫中具有重要调控作用。     

沙柳SpsLAS基因超表达对拟南芥营养生长的影响

用沙柳SpsLAS基因构建35S∷SpsLAS超表达载体并转化野生型拟南芥,对转基因拟南芥进行表型观察,利用荧光定量PCR,对分枝、生长素及细胞分裂素相关基因进行表达分析。结果显示:(1)成功构建35S∷SpsLAS超表达载体,并获得9株纯合转基因株系,且转基因株系的萌芽速率快于野生型(对照),生活周期也较长;其中7个株系表现为生长迅速、株高增加、莲座叶叶片增大、分枝增加,2个株系表现为矮化、分枝增加、育性降低等一系列变化。(2)荧光定量PCR显示,与对照相比24h时转基因株系幼苗生长素及细胞分裂素途径关键基因无明显变化,4d时各基因在各转基因株系呈上调趋势;30d时分枝相关基因RAX1、RAX3表达量均上调,而MAX1、MAX3、REV、AXR1无明显变化。研究表明,SpsLAS基因过表达对拟南芥株型、莲座叶有明显影响,该研究结果为进一步研究该基因对分枝调控机制奠定了基础。     

白三叶TrFQR1基因克隆与表达分析

采用RACE和RT-PCR方法,克隆白三叶拉丁诺(Trifolium repens cv.‘Ladino’)的cDNA基因序列,命名为TrFQR1,对该序列进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR检测TrFQR1的表达模式。结果表明:(1)TrFQR1序列长为1 003bp,开放阅读框为612bp,编码203个氨基酸,该蛋白的理论分子质量21.88kD,等电点为5.96,属于亲水性稳定蛋白,无信号肽,无跨膜结构域,在进化上高度保守,N端11~15位氨基酸和C端112~165位氨基酸是FMN结合位点。(2)TrFQR1表达模式分析显示,白三叶TrFQR1基因对于8种处理均有响应,但不同处理响应不同,其中:用25μmol/L SNP、10mmol/L H_2O_2、5mmol/L CaCl_2处理1.5h以及15%PEG处理3h时,白三叶TrFQR1基因相对表达量显著增加;在200mmol/L NaCl和600μmol/L CdSO4处理下,TrFQR1基因相对表达量随处理时间的增加而增加;4℃处理6h和0.02mmol/L NaHS处理1.5h时,TrFQR1基因相对表达量显著减少。     

番茄LeRma1基因的克隆与表达

以番茄‘哈大粉801’为试材,利用RT-PCR技术,克隆得到1个E3泛素蛋白连接酶基因LeRma1（GenBank登录号XM_004243764.1）。对LeRma1基因进行序列分析,并对LeRma1基因在番茄植株的不同部位以及在非生物胁迫（干旱、盐、碱、高温、低温）下的表达和生理特性进行研究,为培育和改良番茄品种提供理论依据。结果表明：（1）序列分析显示,LeRma1基因的cDNA全长序列729 bp,编码242个氨基酸,分子量为27.05 kD,理论pI 7.97;同源分析显示,番茄LeRma1蛋白与马铃薯的一致性最高（91%）。（2）半定量PCR检测表明, LeRma1基因在番茄根、茎、叶、花、果实中均有表达,且表达差异不明显。（3）干旱胁迫下,LeRma1基因在番茄叶片中优势表达,而在整个干旱过程中根部的LeRma1基因表达量变化不明显;抗旱相关基因LEA、 DREB2A、ABI3在干旱胁迫过程中,番茄叶片中均有表达,且其表达量呈上升趋势,而在根部DREB2A、ABI3基因基本没有检测到。（4）干旱胁迫过程中,番茄植株中丙二醛（MDA）含量呈显著升高趋势,质膜系统严重损伤,体内保护酶（SOD、POD、CAT）活性上升,且根部活性总体明显高于叶片。（5）在非生物逆境（盐、碱、高温、低温）胁迫过程中,LeRma1基因在番茄叶片和根部的表达几乎都有增强的趋势,且在叶片中均是胁迫3 h后诱导起始增强表达。研究认为,LeRma1基因是一个受干旱胁迫诱导增强表达的基因,且在叶片中优势表达,说明LeRma1基因对植物耐受干旱胁迫所起的作用存在一定的组织差异性,而且LeRma1基因可能参与番茄的干旱应答及信号转导过程,在番茄抵抗其他非生物胁迫中LeRma1基因也可能具有一定的作用。     

基于Cre/loxP系统的睾丸组织特异性敲除Elovl4基因小鼠模型的构建及敲除效率检测

极长链多不饱和脂肪酸(very long chain polyunsaturated fatty acids,VLC-PUFAs)是哺乳动物视网膜、睾丸等极少数组织中特有的脂肪酸,其生物合成的关键酶为极长链脂肪酸延长酶4(very long chain fatty acid elongase 4,Elovl4)。建立组织特异性敲除Elovl4基因的动物模型有利于深入研究VLC-PUFAs的生物学功能,因此,本研究基于Cre/loxP系统,先分别构建了Stra8-Cre小鼠和Elovl4 floxed小鼠,通过杂交获得(Elovl4[flox/+],Stra8-Cre)杂合子基因敲除小鼠,再选择雌鼠与Elovl4 floxed纯合子雄鼠即Elovl4 [flox/flox]雄鼠杂交,通过基因型鉴定筛选获得(Elovl4[flox/flox], Stra8-Cre)纯合子小鼠。利用RT-PCR、qRT-PCR、Western blotting、免疫组化和免疫荧光检测Elovl4在睾丸组织中的敲除效率,结果表明,无论是杂合子还是纯合子基因敲除小鼠,其睾丸组织中Elovl4的表达在mRNA及蛋白水平显著下调,但其他组织未受影响。本研究成功构建了睾丸组织特异性敲除Elovl4基因小鼠,为后续研究VLC-PUFAs对雄性小鼠生殖功能的影响及相关分子机制提供可靠的动物模型。     

枸杞花药发育基因LbMS2的克隆及表达分析

MS2(Male sterily2)类基因编码脂肪酰基还原酶,参与了花药绒毡层中脂类代谢过程。该研究以宁夏枸杞(‘宁杞1号’)为试验材料,采用RACE方法从枸杞花药cDNA中获得枸杞LbMS2基因。结果显示,LbMS2基因开放阅读框为1 782bp,编码593个氨基酸,等电点为8.98;生物信息学分析显示,LbMS2蛋白定位于叶绿体;LbMS2蛋白序列与茄科植物矮牵牛、茸毛烟草、马铃薯、番茄以及甜辣椒中的MS2蛋白表现出较高的序列相似性;实时荧光定量PCR结果显示,LbMS2基因具有器官表达特异性,只在枸杞花器官中表达,并且在枸杞花药发育的四分体时期以及单核花粉时期表达量最高。研究表明,LbMS2基因是枸杞花器官发育过程中的重要基因。     

拟南芥ERD15基因缺失突变体的分子鉴定和表型分析

为探究ERD15基因功能,利用反向遗传学,通过PCR及半定量PCR筛选鉴定出拟南芥(Arabidopsis thaliana) ERD15基因的T-DNA插入纯合突变体,并对其表型进行观察分析。结果表明,erd15突变体莲座叶数目显著增多,提前3～4 d开花,突变体比野生型更早从营养生长转向生殖生长。拟南芥野生型植株主茎为圆柱体,平均直径1.29 mm,而erd15突变体主茎扁平,平均直径达到2.27mm,具极显著差异。与野生型相比,erd15突变体果实心皮发育受到影响,隔膜上排列有多排种子,果荚顶端膨大,长度缩短37.67%,但角果平均结籽数升高。因此,ERD15基因参与了调控拟南芥植株的生殖生长过程。     

In planta transformation of Arabidopsis thaliana

Transformants of Arabidopsis thaliana can be generated without using tissue culture techniques by cutting primary and secondary inflorescence shoots at their bases and inoculating the wound sites with Agrobacterium tumefaciens suspensions. After three successive inoculations, treated plants are grown to maturity, harvested and the progeny screened for transformants on a selective medium. We have investigated the reproducibility and the overall efficiency of this simple in planta transformation procedure. In addition, we determined the T-DNA copy number and inheritance in the transformants and examined whether transformed progeny recovered from the same Agrobacterium-treated plant represent one or several independent transformation events. Our results indicate that in planta transformation is very reproducible and yields stably transformed seeds in 7–8 weeks. Since it does not employ tissue culture, the in planta procedure may be particularly valuable for transformation of A. thaliana ecotypes and mutants recalcitrant to in vitro regeneration. The transformation frequency was variable and was not affected by lower growth temperature, shorter photoperiod or transformation vector. The majority of treated plants gave rise to only one transformant, but up to nine siblings were obtained from a single parental plant. Molecular analysis suggested that some of the siblings originated from a single transformed cell, while others were descended from multiple, independently transformed germ-line cells. More than 90% of the transformed progeny exhibited Mendelian segregation patterns of NPTII and GUS reporter genes. Of those, 60% contained one functional insert, 16% had two T-DNA inserts and 15% segregated for T-DNA inserts at more than two unlinked loci. The remaining transformants displayed non-Mendelian segregation ratios with a very high proportion of sensitive plants among the progeny. The small numbers of transformants recovered from individual T₁ plants and the fact that none of the T₂ progeny were homozygous for a specific T-DNA insert suggest that transformation occurs late in floral development.National Research Council of Canada Publication No. 38003     

GFP基因在新疆小拟南芥和拟南芥中的表达分析

以质粒pMCB30为模板,扩增GFP基因,连接到载体pCMBIA2300-35S-OCS上,构建过量表达载体p35S:GFP,将其转入农杆菌GV3101.通过农杆菌介导法将p35S:GFP载体分别转入新疆特色植物小拟南芥和拟南芥中.T0代经含有卡那霉素的1/2MS培养基筛选,获得了T1代转基因小拟南芥2株,T1代转基因拟南芥9株.通过激光共聚焦显微镜观察,在转基因小拟南芥和拟南芥的根尖细胞中均可检测到GFP绿色荧光蛋白;对转基因植株进行PCR扩增,均可检测到GFP基因,表明GFP基因已成功转入小拟南芥和拟南芥中.该研究建立了小拟南芥的遗传转化体系,为进一步利用GFP基因和进一步研究小拟南芥的功能基因奠定基础.     

拟南芥AtCDPK1基因克隆与转化马铃薯的研究

以野生拟南芥生态型(Col-0)为材料,利用PCR和DNA重组技术,克隆了拟南芥钙依赖蛋白激酶基因(AtCDPK1)。AtCDPK1基因全长为2 269bp,碱基序列与已知基因At1g18890完全一致。构建AtCDPK1基因的植物表达载体pCHF3-CDPK1,并利用农杆菌介导法将pCHF3-CDPK1转入马铃薯品种‘费乌瑞它’的脱毒试管微型薯中,经筛选与植株再生,共获得50个抗性再生植株。PCR检测显示,有36个植株基因组中含有AtCDPK1基因。RT-PCR分析证实,AtCDPK1基因在这些马铃薯植株的基因组中均能正常转录表达。这一结果为进一步开展AtCDPK1基因功能分析及转基因抗旱马铃薯新品种选育研究奠定了基础。     

UV-B预处理诱导拟南芥耐旱性的提高

为了解UV-B提高拟南芥(Arabidopsis thaliana)耐旱性的生理机制,将2周龄的野生型拟南芥(WT)和sto突变体幼苗用不同剂量UV-B预处理1周,再用30%PEG模拟干旱处理24 h,对植株的表型进行统计,并测定类黄酮、脯氨酸和MDA含量。结果表明,低剂量UV-B预处理能够提高拟南芥的耐旱性,植株的类黄酮与脯氨酸含量分别提高了20%～40%和50%～65%,细胞膜受损程度降低,从而提高了保水性。低剂量UV-B提高拟南芥耐旱性的效应在sto突变体中消失,证明这种效应在分子机制上可能与STO蛋白相关。     

镉胁迫下植物促生菌密歇根克雷伯氏菌TS8和Lelliottia jeotgali MR2对拟南芥生长及镉富集的影响北大核心CSCD

为了研究镉胁迫下植物促生菌密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)TS8和Lelliottia jeotgaliMR2对拟南芥(Arabidopsis thaliana)生长及镉富集的影响,文中以野生型拟南芥为试验材料,将其种植在不同镉浓度的土壤基质中,并施入MR2和TS8菌悬液。低浓度镉处理组(LC)为购买的基质营养土,初始镉浓度为14.17 mg/kg,高浓度处理组(HC)为在购买的基质营养土上额外喷洒200 mg/kg Cd^(2+)。结果表明,相比对照组,不同浓度镉胁迫下喷施MR2菌悬液均可显著促进拟南芥的生长,而TS8和MR2_TS8混合菌液仅在高浓度镉胁迫下表现出一定的促生效果。但值得关注的是,不同浓度镉胁迫下TS8菌悬液可显著降低拟南芥的地下部对重金属镉的富集(60%和59%),并有效提高地上部对重金属镉的富集(234%和35%)。此外,单菌和混合菌均能显著提高土壤中可还原态镉向酸可提取态镉转化,促进植物吸收,降低土壤总镉含量。因此,针对不同环境下,合理配施植物促生细菌在提高作物产量或修复土壤镉污染中具有一定的应用价值。     

盐胁迫对拟南芥AtPUB18基因的诱导表达及其启动子分析

用300mmol/L NaCl处理拟南芥幼苗,分别于处理后0、1、2、4、8、16、24、48h通过Northern Blot检测其AtPUB18基因的表达量。结果显示:拟南芥AtPUB18基因的表达量受高盐胁迫的诱导而升高,于处理后4h表达量达到最高,处理后16h表达量最低。采用PCR技术克隆AtPUB18的启动子,序列为1 974bp;序列分析发现启动子内含有大量与非生物胁迫相关的顺式作用元件,如HSE、LTR、MBS及ABRE;将启动子克隆到表达载体pCambia1300-221-GUS中,驱动报告基因GUS表达。组织化学染色结果表明,未经过高盐处理的幼苗中GUS基因表达水平很低;300mmol/L NaCl处理后GUS基因表达量显著升高。研究表明,AtPUB18的表达受高盐胁迫诱导,且AtPUB18基因的启动子是一个盐胁迫诱导型启动子。     

拟南芥基因密码子偏爱性分析

密码子偏爱性对外源基因的表达强度有一定影响,特别是编码蛋白质N端7～8个氨基酸残基的密码子.通过对拟南芥染色体中26 827个蛋白质对应的基因密码子进行分析,得到了编码氨基酸的61种密码子在拟南芥中的使用频率,并与大肠杆菌和哺乳动物进行了比较,结果表明三者间的密码子偏爱性有较大差异.这一分析结果对于动物基因在植物中的表达,及植物基因在微生物中的表达具有一定指导意义.同时提供了一种直接以XML文档为数据源解析巨型XML格式染色体数据的方法.     

拟南芥叶形态建成基因ABL1的图位克隆及鉴定

前期研究表明ABL1可能在植物叶发育过程中扮演重要的角色,其突变表现为叶片生长迟缓、成熟叶片叶缘缺刻明显等生长缺陷特征。该研究利用图位克隆及其精细定位技术,将ABL1基因锁定在2个SSLP标记T23K8和T8F5之间,该区间包含44个基因。通过生物信息学成功找到ABL1突变基因为拟南芥FAS1,该基因编码染色质组装因子CAF1的一个亚基,在植物顶端分生组织生长调控中扮演重要角色。RT-PCR结果显示,该基因表达受阻,功能互补实验证实abl1突变体的确是FAS1基因的一个新等位突变。研究结果暗示,ABL1/FAS1在植物叶形态建成中也起着重要作用。