慢病毒载体介导GHRH基因在小鼠肌肉组织表达及对动物生长的影响

人与动物体内生长激素受生长激素释放激素(Growth Hormone Releasing Hormone,GHRH)与生长激素抑制激素(Somatostatin,SST)两种因子共同调节,在体内表达外源GHRH,可以提高体内GH基础水平,进而达到促进体内GH释放,加速动物生长的效果.对慢病毒载体系统加以改造,使之成为C...     

达氏鲟生长激素基因cDNA克隆、表达及免疫荧光定位研究

为研究达氏鲟(Acipenser dabryanus)生长激素(Growth Hormone, GH)基因的功能, 合成了达氏鲟垂体SMART cDNA, 克隆得到GH全长cDNA序列。达氏鲟GH全长cDNA序列为1008 bp, 由52 bp的5'端非编码区(Untranslated region, UTR)、编码214个氨基酸的645 bp开放阅读框(Open reading frame, ORF)和311 bp的3'UTR构成。运用GH氨基酸序列构建进化树分析发现, 达氏鲟与两栖类、爬行类和哺乳类的一致性要高于真骨鱼类。实时荧光定量PCR结果表明, 达氏鲟GH mRNA主要在垂体和下丘脑中表达, 且垂体中GH的表达量约为下丘脑的110倍; Western-blot研究结果与qRT-PCR一致, 仅在垂体和下丘脑中检测到生长激素蛋白, 且垂体中GH的表达量远高于下丘脑。免疫荧光定位结果显示, GH主要定位于垂体中部, 下丘脑中也有少量荧光信号; 苏木精-伊红组织切片染色研究表明, GH主要是由嗜酸性的生长激素分泌细胞分泌。研究为深入研究脊椎动物生长激素基因的进化和人工养殖达氏鲟的生长调控提供了基础。       

6种重要经济鱼类生长激素完整cDNA的克隆和序列分析

通过RT-PCR、3′RACE、5′-RACE方法,从6种重要经济鱼类——大眼鳜(Siniperca kneri)、石斑鱼(Epinephelus coioides)、黄鳝(Monopterus albus)、鲶鱼(Silurus asotus)、泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)和方正银鲫(Carassius auratus gibelio Bloch,Fang Zheng crucian carp)中克隆了生长激素(Growth Hormone,GH)的完整cDNA序列(除石斑鱼序列外,其他生长激素序列均系第一次克隆),并详细分析了其序列特征。测序结果显示,克隆的6种GH cDNA长度依次为953bp、1023bp、825bp、1082bp、1154bp和1180bp,它们均包含一个长度为600个左右核苷酸的完整阅读框,分别编码一个200个左右氨基酸的蛋白：大眼鳜、石斑鱼和黄鳝GH为204个氨基酸,鲶鱼GH为200个氨基酸,泥鳅和方正银鲫GH为210个氨基酸。这6种蛋白序列与其他已知的鱼类GH序列都有较高的同源性,特别是与相同目的鱼类序列相比。通过序列比对,在这些蛋白序列内鉴定了许多保守的氨基酸残基,其中的大多数聚集而成5个保守域。基于这6种鱼类序列的编码区和其他鱼类的GH编码序列进行分子系统学分析,结果(MP和NJ树)与根据形态特征构建的系统发育树基本一致,特别是在硬骨鱼类较大分类阶元(目间、目以上)的系统发育研究方面比较一致,尽管仍存在一定差异,说明生长激素基因的编码区应该在硬骨鱼类系统发育研究领域得到更多的重视。     

樟叶越桔熊果苷合成酶基因VdAS1的克隆及序列分析

根据樟叶越桔(Vaccinium dunalianum)叶芽转录组测序获得的熊果苷合成酶基因Vd AS1部分EST序列设计引物,结合RACE-PCR技术获得Vd AS1基因全长1 577 bp c DNA序列。其完整的开放阅读框推测编码由475个氨基酸残基组成的Vd AS1蛋白,理论相对分子量为52.22 k D,等电点p I=5.74,负电荷残基(Asp+Glu)总数为53个,正电荷残基(Arg+Lys)总数为45个,不稳定系数为37.93,属稳定性蛋白质。生物信息学分析表明Vd AS1与枸杞的糖基转移酶相似率高达74%,其二级结构主要构件为α-螺旋和随机卷曲,不存在跨膜区,属于亲水性蛋白质,并结合信号肽预测结果推测Vd AS1直接锚定在细胞基质中行使功能。该研究为后期Vd AS1的异源表达和功能研究奠定了基础。     

新的生长激素异形体基因的发现及全长cDNA的克隆

在通过大规模 ESTS技术对垂体基因表达谱的研究中 ,从垂体组织产生了 72 2 2个 ESTS,有385个 ESTs是代表生长激素 (GH)基因的 ,其中 1个为中间缺失 1 38bp的 GH异形体基因 ,并经巢式 RT- PCR及测序证实 ;该基因编码 1 71个氨基酸的前肽 ,去除信号肽后 ,其成熟肽由 1 45个氨基酸组成 ;经生物信息学处理 ,其分子量大小约 1 7k D;与正常生长激素分子内有 2个 GH受体结合位点不同 ,该新的 GH异形体分子内仅有一个生长激素受体的结合位点 .研究结果揭示 :正常垂体内存在着新的 GH异形体基因 ,该基因可能编码外周血中 1 6k D的生长激素 ;其功能可能为 2 2k D GH的生理拮挤剂 .     

革胡子鲶生长激素cDNA克隆与蛋白质结构分析

从革胡子鲶(Clarias lazera(Burchell))的脑垂体组织中提取总RNA, 应用RT-PCR方法, 扩增得到了革胡子鲶生长激素(Growth hormone, GH)基因cDNA的开放阅读框(Open reading frame, ORF)序列。ORF全长为603 nt, 编码由22个信号肽氨基酸和178个成熟肽氨基酸共同组成的生长激素前体蛋白。序列同源比较结果表明, 研究中得到的革胡子鲶生长激素氨基酸序列与GenBank中已报道的其他6种鲶形目鱼类的氨基酸序列同源性高达95.8%。二级结构预测分析结果表明, 革胡子鲶生长激素蛋白中含有a 螺旋、b 折叠和b 转角以及无规卷曲等二级结构, 以a 螺旋为主, 是典型的a 型结构蛋白质。此外, 抗原性分析表明, 在氨基酸序列中的4个区域均可形成优势抗原表位, 其结构特点非常适合改造成为重组生长激素疫苗或单克隆抗体制剂加以开发利用。     

樟叶越桔熊果苷合成酶基因VdAS1的克隆及序列分析?

根据樟叶越桔( Vaccinium dunalianum)叶芽转录组测序获得的熊果苷合成酶基因VdAS1部分EST序列设计引物,结合RACE￣PCR技术获得VdAS1基因全长1577 bp cDNA序列。其完整的开放阅读框推测编码由475个氨基酸残基组成的VdAS1蛋白,理论相对分子量为52?22 kD,等电点pI＝5?74,负电荷残基( Asp＋Glu)总数为53个,正电荷残基( Arg＋Lys)总数为45个,不稳定系数为37?93,属稳定性蛋白质。生物信息学分析表明VdAS1与枸杞的糖基转移酶相似率高达74％,其二级结构主要构件为α￣螺旋和随机卷曲,不存在跨膜区,属于亲水性蛋白质,并结合信号肽预测结果推测VdAS1直接锚定在细胞基质中行使功能。该研究为后期VdAS1的异源表达和功能研究奠定了基础。     

大口黑鲈GHRH-LP和GHRH基因序列同源性、基因结构和时序表达研究

促生长激素释放激素(Growth hormone releasing hormone,GHRH)是生长激素释放调控的重要因子。过去人们一直将鱼类的促生长激素释放激素样多肽(Growth hormone releasing hormone like peptide,GHRH-LP)误认为是GHRH,直到最近才分离出GHRH基因。为了了解GHRH和GHRH-LP基因的结构特征及表达差异,研究克隆了大口黑鲈(Micropterus salmoides)GHRH和GHRH-LP基因,同时应用实时定量PCR技术研究了这两个基因的组织表达及发育时序表达情况。结果显示,大口黑鲈GHRH的成熟肽由27个氨基酸残基组成,GHRH-LP的成熟肽由44个氨基酸残基组成。两个基因均由5个外显子和4个内含子组成,但两者成熟肽编码区在外显子上的分布有明显不同。与其他脊椎动物比较,GHRH同源性为74%100%,而GHRH-LP同源性为41%96%,两者间具有一定的相似性(37%63%)。GHRH基因仅在前脑和延脑中表达,而GHRH-LP基因在中枢神经系统及外周组织中均有表达;在胚胎发育过程中GHRH在神经胚后期检测到表达,其表达水平在仔鱼出膜1d后显著提高,而GHRH-LP在囊胚期及后续发育过程中均检测到表达。基因结构、序列同源性及表达谱研究均表明,GHRH和GHRH-LP存在显著差异,应为具有不同功能的两个基因。       

rh-GH在促进大鼠创面愈合中的作用研究

目的:通过在大鼠背部创面周围局部注射rh-GH(重组人生长激素,Recombinant Human Growth Hormone)来调控创面局部GH(生长激素,Growth Factor)水平,观察GH在创面愈合中的作用,并对其可能机制进行进一步研究。方法:在SD大鼠背部制作创面,创周定期注射不同浓度rh-GH,观察并分析创面愈合速度差异;选取rh-GH的最适浓度进行创周注射并定期取材,以Western-Blot检测创周组织中GH蛋白水平,并以RT-PCR检测创周组织中EGF(表皮生长因子,Epidermal Growth Factor)、FGF(成纤维细胞生长因子,Fibroblast Growth Factor)、VEGF(血管内皮细胞生长因子,Vascular Endothelial Growth Factor)的表达变化。结果:三个注射不同剂量rh-Gh的实验组大鼠创面平均愈合时间由快至慢依次为16.5±1.5天、17.1±2.9天、18.5±1.5天,与注射生理盐水的对照组平均愈合时间21.7±2.3天相比均明显增快,差异有统计学意义(P0.05)。创缘组织中GH的Western-Blot结果显示对照组GH水平在创面形成初期升高,但伤后4天开始GH表达水平即逐渐下降,而rh-GH注射组的GH水平在创面形成后逐渐升高,并维持GH在高表达水平。检测创周组织中EGF、FGF、VEGF的RNA转录水平,PCR结果显示实验组各生长因子的基因转录水平在伤后2天起即明显高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论:1.创伤初期创面周围组织中GH表达水平呈现一过性升高然后逐渐下降的过程;2.创面周围注射rh-GH可以提高组织中GH水平,并减少创面愈合时间;3.GH可以提高皮肤组织中EGF、FGF、VEGF水平,间接促进创面上皮化,加快创面愈合。     

生长激素释放肽的结构和功能

生长激素释放肽(growth hormone releasing peptide,Ghrelin,GHRP),是最近发现的可以促进GH分泌的肽激素,主要来源于胃,有28个氨基酸残基,其第三位氨基酸残基(一般是丝氨酸)被脂肪酸修饰,实验证明被修饰的N端是其活性核心部位。该文介绍ghrelin的主要结构和生物学功能。     

转基因枸杞表达HIV-1壳体蛋白病毒样颗粒疫苗表达载体的构建

利用PCR技术扩增出人免疫缺陷病毒HIV-1MA₄-CA融合基因,将其克隆到pGEM-T载体中,测定其核苷酸序列,并推导其氨基酸序列。该基因全长为450bp,与已发表的HIV-1的全序列基因(AF324493)完全同源,编码一个含150个氨基酸残基的蛋白质。将该基因与分泌型表达载体pCAMBIA1305.2连接,同时将水稻中富含甘氨酸蛋白的信号肽序列(GRP)引入MA₄-CA融合基因,构建了含MA₄-CA基因的植物分泌表达载体pCAMBIA1305.2-MA₄-CA。     

南江黄羊GH基因外显子4单核苷酸多态与生长性能的关联分析

以405只南江黄羊为试验动物,以生长激素(GH)为候选基因,利用PCR-SSCP技术和DNA序列分析技术筛选其多态位点,并与南江黄羊的生长性状进行关联分析,以期筛选与南江黄羊生长性状相关的分子标记.序列分析比对结果发现GH基因外显子4有个4 SNPs (27 G/A、68 C/A、136 G/A、170 C/T),其中...     

鲫两种不同生长激素cDNA的分子克隆和分析

从鲫脑垂体组织提取总RNA ,采用 3′RACE PCR的方法 ,从单一垂体总RNA中扩增出编码两种不同类型鲫生长激素的cDNA :生长激素Ⅰ (GrowthhormoneⅠ ,GHⅠ )和生长激素Ⅱ (GrowthhormoneⅡ ,GHⅡ )。将两种类型的鲫GHcDNA分别克隆到pGEM TEasyVector上进行序列测定和分析。克隆的鲫GHⅠ和GHⅡcDNA均包括编码 188个氨基酸残基的GH成熟肽序列和 3′端的非翻译区 ,但不含信号肽序列和 5′端非编码区。序列分析结果表明 ,鲫GHⅠ的碱基序列和推测的氨基酸序列与国外已经发表的金鱼GHⅠ的同源性分别为 98 7%和 97 9% ;GHⅡ的碱基序列和推测的氨基酸序列与金鱼GHⅡ的同源性分别为 99 1%和 99 5% ,虽然同源性较高 ,但仍具有一定的差异     

甘菊BADH基因cDNA的克隆及在盐胁迫下的表达

利用PCR、RT-PCR和PCR-RACE技术,从菊科植物甘菊(Dendranthema lavandulifolium)中克隆到2个甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase,BADH)基因的同源基因,分别命名为DlBADH1和DlBADH2,GenBank登录号分别为DQ011151和DQ011152。DlBADH1的cDNA全长1821 bp,其开放阅读框编码503个氨基酸的蛋白质;DlBADH2全长1918 bp,编码506个氨基酸的蛋白质。两个基因核苷酸序列的同源性为97%,推导的氨基酸序列的同源性为98%。与已发表的其它植物BADH基因氨基酸序列的同源性在64%以上。在推导的氨基酸序列中,均含有醛脱氢酶所具有的高度保守的十肽(VTLELGGKSP)以及与酶功能有关的半胱氨酸残基(C)。在推导的氨基酸序列的系统关系中,甘菊位于其它双子叶植物和单子叶植物之间,与其植物分类的系统关系相吻合。RT-PCR-Southern半定量表达分析表明,甘菊BADH基因家族中存在表达受盐诱导的成员。     

生长激素基因的克隆和表达及其对贵州地方黄牛骨骼肌细胞增殖的影响

本研究旨在探究生长激素(Growth hormone,GH)对贵州地方黄牛骨骼肌细胞增殖的表达调控,探明超表达GH基因对骨骼肌细胞增殖的影响。首先利用反转录PCR扩增黄牛GH基因的蛋白质编码区(Coding sequence,CDS),将其克隆至pUCM-T载体,并连接转化构建超表达载体pEGFP-N3-GH。同时使用实时荧光定量PCR检测GH基因在贵州地方黄牛骨骼肌相关组织(腰大肌与背最长肌)中的表达情况,然后培养牛原代骨骼肌细胞并进行鉴定,并将GH基因超表达载体导入细胞以研究GH基因对牛骨骼肌细胞增殖以及骨骼肌生长发育相关因子胰岛素样生长因子-1(Insulinlikegrowthfactor1,IGF-1)与胰岛素样生长因子-2(Insulinlikegrowth factor 2,IGF-2)基因表达的影响。实时荧光定量PCR结果显示,GH基因在贵州地方黄牛腰大肌中的表达量均高于背最长肌,其中在关岭牛和威宁牛腰大肌中的表达量显著高于背最长肌(P0.05)。细胞转染及增殖结果表明,相比于pEGFP-N3,pEGFP-N3-GH能极显著提高GH与IGF-1、IGF-2基因在骨骼肌细胞中的表达量,且在被检测的4个时期(6 h、12 h、24 h、48 h),超表达GH基因组也能够极显著地提高骨骼肌细胞的增殖速率(P0.01)。结果提示,GH基因可促进贵州地方黄牛骨骼肌细胞的增殖,对其具有正向的调控作用,这为进一步探究GH基因对贵州地方黄牛生长发育的影响机制奠定基础。     

南方鲇生长激素完整cDNA的克隆及其DNA序列分析

采用RT-PCR法和3'、5'RACE(Rapid amplification of cDNA ends）法从南方鲇脑垂体RNA克隆出生长激素(Growth hormone,GH）cDNA。此cDNA全长1087nt(含Rloy(A)),其5'端非编码区长52nt、阅读框（Open rdading frame,ORF）长603nt、3'端非编码区长415nt。其推导的GH由200个氨基酸组成,其中前24个氨基酸为信号肽部分。氨基酸序列比较表明,南方鲇（GH）与Pangasianodon gigas、Ictalurus punctatus 和Heteropneustes fossilis三种鲇类的同源性分别为97.5%和95.0%,与鲢、鳙、草、鲤鱼的GH同源性达76.0%以上,而与人的GH(I、Ⅱ)同源性最低为31.0%和29.5%。     

普氏野马线粒体DNA D-loop区序列多态性研究

目的:了解中国新疆吉木萨尔野马繁殖中心的普氏野马(Equus przewalskii)遗传多样性及其遗传背景.方法:采用PCR产物直接测序法,对15匹普氏野马线粒体DNA D-loop高变区进行测序分析.结果:测定15个个体的线粒体DNA D-loop高变区15464～15866片段序列402bp.检测到12种单倍型,包括37个多态位点,占全部序列的9.2%,其中转换位点24个、颠换位点20个、转换位点和颠换并存位点8个、缺失位点3个.A%+T%含量(56.1%)高于G%+C%含量(43.9%),平均A含量为28.4%,T含量为27.7%,C含量为29%,G含为14.9%.单倍型间平均遗传距离为0.030,单倍型多态性(h)为1±0.00116,核苷酸多态性(π)为2.90%.15匹普氏野马线粒体DNA D-loop高变区之间平均核苷酸变异率为2.48%.结论:研究表明我国新疆吉木萨尔野马繁殖中心的普氏野马线粒体DNA D-loop区序列存在丰富的多态性.     

生长激素和生长激素受体的多样性

生长激素及其受体对动物生长发育起着重要的作用。转录过程选择性剪接和存在多种降解途径可能是GH或GHR产生多样性的原因。随着GH结构形态的改变,其功能也在发生变化。GH基因的多样性对鸡的抗病选择性反应与产蛋性能有相关,GH和GHR基因的多样性会影响奶牛的产奶生产性能。GHR的分子多样性可能导致动物生长发育模式的变异,例如动物的矮小病。     

中华鲟生长激素受体的分子克隆和功能分析

为研究生长激素对中华鲟生长的调控机制,克隆了中华鲟生长激素受体cDNA.csGHRcDNA的可读框编码了611个氨基酸残基的跨膜蛋白质,含有GHR的所有特征结构域.序列对比发现其他种属GHR中高度保守的氨基酸残基在csGHR中发生了替换.我们利用CHO细胞分析了csGHR的生物功能和csGHR分子中高度保守性氨基酸残基替换的生物意义.csGHR稳定表达细胞中共转染的受丝氨酸蛋白酶抑制剂2.1（Spi1.2）启动子驱动的荧光素酶报告基因受海鲤生长激素（seabream GH,sbGH）诱导表达,并且sbGH诱导稳定表达细胞显著增殖.csGHR稳定表达细胞培养液中检测到中华鲟生长激素结合蛋白质,并且csGHBP的生成需要金属蛋白酶活性的参与.csGHR配体结合域的Asp突变为Glu显著提高csGHR介导的上述生物活性,而Asp突变为Ala则明显降低csGHR的生物活性.这些结果表明,克隆的csGHR具有完全生物功能,并且csGHBP可能通过csGHR蛋白酶解而生成.这些发现将有助于全面了解中华鲟生长调控机制.