苏氨酸醛缩酶的研究进展

苏氨酸醛缩酶(TAs)以磷酸吡哆醛为辅酶,催化不同的醛与α-氨基酸发生醇醛缩合反应,形成具有2个手性中心的β-羟基-α-氨基酸。TAs在不对称催化过程中可以控制产物α-碳位的立体构型,而对β-碳位的立体构型控制相对较弱。增强TAs在β-碳位的立体选择性是近年来研究TAs不对称催化的热点。本文重点阐述了TAs的结构与作用机制、定向进化,以及在生物催化合成中的应用,对TAs的研究与开发进行了展望。     

苏氨酸醛缩酶的催化机理、分子改造及合成应用

苏氨酸醛缩酶催化醛和甘氨酸羟醛缩合,一步反应即可构建产物β-羟基-α-氨基酸的两个手性中心,从原子经济性和环境影响角度,是非常具有潜力的绿色合成光学纯β-羟基-α-氨基酸的方式之一.多个不同生物来源的苏氨酸醛缩酶得到分离和表征,较低的β-碳立体选择性以及反应过程中动力学和热力学控制难题,使其在合成应用中面临很大挑战.文...     

两种新型L-苏氨酸醛缩酶的鉴定及活性检测方法

为了实现重要医药中间体p-羟基-α-氨基酸的生物酶法合成,挖掘验证新型的L-苏氨酸醛缩酶.以pET-28a(+)作为表达载体,通过蛋白表达纯化、薄层层析色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)技术分析L-苏氨酸醛缩酶及其催化产物的性质.基于4-氨基-3-肼基-5-巯基-1,2,4-三氮唑(Purpald)显色试剂开发检...     

氨基树脂固定化L-苏氨酸醛缩酶及其应用*

L-苏氨酸醛缩酶(L-Threonine aldolase,L-TA)可以催化甘氨酸和醛合成β-羟基-α-氨基酸。β-羟基-α-氨基酸具有两个手性中心,是多种手性药物的中间体。但是,游离的L-TA难以重复利用,分离纯化困难,严重阻碍了工业化应用。固定化技术可以有效解决这些问题。利用氨基树脂NAA固定化来源于Bacillus nealsonii的L-苏氨酸醛缩酶,采用戊二醛作为交联剂,经过条件优化确定最佳固定化条件为:加酶量13 U、载体量0.6 g、0.4%(V/V)戊二醛、活化时间2 h、pH 8.5、35℃、固定化5 h。在此条件下,固定化酶酶活回收率为85.7%。在30℃下半衰期可达59天,为游离酶的6.5倍。将其应用于合成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸,使用460 h后,残余酶活为79.4%。进一步开发了载体再利用策略,将失活固定化酶表面的氨基用戊二醛活化后,再与新的游离酶进行固定化,实现载体的再利用。利用该方法载体可重复利用两次,制备的固定化酶仍能使用460 h。该方法大大降低了固定化成本,为固定化L-TA的工业化应用打下坚实的基础。     

α-氨基酸的立体有择合成

简述了α－氨基酸立体有择合成中几个代表性方法：消旋氨基酸不对称转化、α,β－脱氢氨基酸不对称氢化、甘氨酸等量体不对称烷化和手性自身再生。引用文献１８篇。     

鱼腥藻Ⅱ型果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

随着更多蓝藻全基因组序列测定完成,蓝藻基因工程研究现已进入后基因组时代。2001年Kaneko等完成了鱼腥藻7120全基因组序列测定,随后人们利用生物信息学的方法对其中一些基因的功能进行了预测,包括Ⅱ型果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（FBA）基因,但该基因是否编码Ⅱ型果糖-1,6-二磷酸醛缩酶及该产物的相关酶学特性至今尚未见报道。通过PCR克隆到鱼腥藻7120中预测的Ⅱ型FBA基因,插入到质粒pET-32a的相应位点,构建成原核表达载体pET-FBA-Ⅱ。蛋白电泳结果显示,重组蛋白的表达量占总蛋白含量的23．4％,与蛋白分子标记相比,其分子量约为40kDa。酶学活性测定结果表明,其蛋白粗提物的比活力为11．8U（mgprotein）^-1,具有标准Ⅱ型FBA活性。证实了Cyanobase中关于该基因功能的预测,也为进一步研究该基因表达产物的生理生化特性及功能提供了重要资料。     

受NaCl诱导的盐藻果糖-1,6-二磷酸醛缩酶cDNA的克隆及其在烟草中的表达

采用快速扩增cDNA末端(RACE)技术, 获得了盐藻(Dunaliella salina)受诱导表达的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶全长cDNA (DsALDP). 蛋白质序列分析发现, DsALDP与许多植物叶绿体的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(AldP)具有较高的同源性(66%~73%). 系统进化分析进一步证明DsALDP与藻类的AldP亲缘关系最近. 就表达谱而言, DsALDP是NaCl诱导下新表达的转录本, 其表达水平随诱导时间的不同而呈显著变化. 筛选的DsALDP cDNA构建到双元载体pBI121并导入农杆菌用以转化烟草, 对4个T₁代转基因植株进行Southern检测, 证明DsALDP已整合入转基因植株的基因组. RT-PCR分析显示DsALDP在这些植株中均得到有效表达. 生物测试表明, T₁-1, T₁-2和T₁-3植株在100~200 mmol/L NaCl下仍保持醛缩酶活性, 且其脯氨酸含量均有不同程度的升高.     

非蛋白质氨基酸的结构与功能

<正> 自然界除了组成蛋白质的20种氨基酸外,还存在许多非蛋白质氨基酸,现据统计已测分子结构的非蛋白氨基酸已多达400多种,其中在植物中发现的约有240多种、在动物中发现50多种,其余多存在微生物中,这些天然产物大都具有芳香或杂环的结构,存在于各种细胞或组织中,有的呈游离状,有的呈结合状,但并不存在于蛋白质中,它们大多数是蛋白质中存在的α-氨基酸的衍生     

NDM-1结构功能及抑制剂的抑制机理

在过去的10年中,以新德里金属β-内酰胺酶-1(NDM-1)为代表的金属β-内酰胺酶在全球范围内广泛传播,对公共卫生安全产生了较大的威胁.尤其是近些年这些酶的突变体的出现使得耐药菌给人类健康造成了更加复杂和困难的挑战.目前,临床上仍然缺乏有效的治疗药物和手段.研发有效广谱的抑制剂成为解决此问题的重点.因此本文将针对ND...     

遗传密码扩充技术及其在蛋白质功能研究及标记成像中的应用

遗传密码扩充(genetic code expansion,GCE)技术利用终止密码子将非天然氨基酸掺入到蛋白质中,再结合点击反应对蛋白质实现定点标记.相较于荧光蛋白、标签抗体等其他标记工具,该技术在蛋白标记中使用的化合物分子较小、对蛋白空间结构影响较小,且能通过点击反应实现蛋白分子与染料分子1∶1的化学计量比,从而能...     

Formation of Threonine Aldolase by Bacteria and Yeasts

Threonine aldolase was found to be formed in various strains of bacteria and yeasts when they were grown in media containing l-threonine as a sole source of carbon. As the other sources of carbon, d, l-allothreonine, l-serine and glycine were effective but glucose and sucrose were inert for the formation of the enzyme.

The maximal formation of the enzyme was observed in the initial of stationary phase of growth and, thereafter, the enzyme disappeared with the consumption of l-threonine. It seems that the enzyme is adaptive in nature and that it is responsible for the growth in threonine as the carbon source.     

Threonine Aldolase Overexpression plus Threonine Supplementation Enhanced Riboflavin Production in Ashbya gossypii

Riboflavin production in the filamentous fungus Ashbya gossypii is limited by glycine, an early precursor required for purine synthesis. We report an improvement of riboflavin production in this fungus by overexpression of the glycine biosynthetic enzyme threonine aldolase. The GLY1 gene encoding the threonine aldolase of A. gossypii was isolated by heterologous complementation of the glycine-auxotrophic Saccharomyces cerevisiae strain YM13 with a genomic library from A. gossypii. The deduced amino acid sequence of GLY1 showed 88% similarity to threonine aldolase from S. cerevisiae. In the presence of the GLY1 gene, 25 mU of threonine aldolase specific activity mg⁻¹ was detectable in crude extracts of S. cerevisiae YM13. Disruption of GLY1 led to a complete loss of threonine aldolase activity in A. gossypii crude extracts, but growth of and riboflavin production by the knockout mutant were not affected. This indicated a minor role of the enzyme in glycine biosynthesis of A. gossypii. However, overexpression of GLY1 under the control of the constitutive TEF promoter and terminator led to a 10-fold increase of threonine aldolase specific activity in crude extracts along with a 9-fold increase of riboflavin production when the medium was supplemented with threonine. This strong enhancement, which could not be achieved by supplementation with glycine alone, was attributed to an almost quantitative uptake of threonine and its intracellular conversion into glycine. This became evident by a subsequent partial efflux of the glycine formed.     

POU同源域蛋白的结构及发育中的功能

POU同源域蛋白含有两个保守的亚结构域以及它们之间有变化的连接区.两个亚结构域与DNA相互作用,在连接区可塑性和辅因子的帮助下,POU蛋白作为调控因子和转录因子,显示出错综复杂的DNA结合和识别能力.在脊椎动物和无脊椎动物中,POU蛋白参与胚胎发生的早期过程,在细胞谱系的分化和神经发育中起调控作用.     

d-Glucose 6-Phosphate Cycloaldolase: Inhibition Studies and Aldolase Function

d-Glucose 6-phosphate cycloaldolase is inhibited 83% by 0.66 mm EDTA and stimulated 1.7-fold by 0.6 mm KCl. Dihydroxyacetone phosphate, an analog of the last three carbons in the proposed intermediate, d-xylo-5-hexulose 6-phosphate, acts as a partially competitive inhibitor. Treatment with NaBH₄ in the presence of dihydroxyacetone phosphate does not cause permanent inactivation as would be expected if a Schiff base were being formed. In these properties it resembles a type II, metal-containing aldolase. Photooxidation in the presence of Rose Bengal inactivates this enzyme. NAD⁺ partially protects against this photooxidation. Cells grown on medium lacking myoinositol had four times as much enzyme activity as cells grown on medium containing 100 mg of myoinositol per liter.     

Dicer 的结构功能及其与肿瘤的关系

Dicer蛋白是RNaseⅢ家族中重要的一员,对miRNA或siRNA的产生起着至关重要的作用。Dicer蛋白通常由1个DEXH盒子或H盒子、1个DUF283结构域、1个PAZ结构域、2个RNaseⅢ结构域(RNaseⅢa和RNaseⅢb)和1个dsRNA结合结构域组成。Dicer蛋白的分子结构决定了其在miRNAs合成中发挥着重要作用。Dicer及生成的miRNA与肿瘤又有着密切关系。本文主要针对Dicer及其与肿瘤的关系作简要综述。     

MAR的结构、功能及其应用研究现状

真核细胞表达外源基因克服了原核细胞表达外源基因的种种不足(如mRNA的成熟、翻译后的加工),因而得到广泛应用。但真核细胞表达外源基因也有不足之处,即表达效率低。造成真核细胞外源基因表达效率低的原因有很多,如基因结构、表达载体、调控元件等,而宿主细胞染色质DNA对外源基因的影响是一个不可忽视的原因。人们在通过载体将外源基     

血管紧张素转换酶的结构功能及相关抑制剂

血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme, ACE, EC 3.4.15.1)是一种位于细胞膜上, 依赖锌离子的羧二肽酶, 催化水解十肽血管紧张素I羧基末端两个氨基酸, 生成具有血管收缩作用的八肽血管紧张素II。ACE在血压调节系统renin - angiotensin system (RAS系统)中具有重要作用, 从ACE的结构功能、基因多态性及其抑制剂等方面进行了详细综述。发现体细胞ACE两个活性中心催化血管紧张素I和缓激肽的机制不同, 因此以体细胞ACE单个活性中心为靶点的研究, 将会为研制开发副作用更少, 安全性更高的ACE抑制剂提供新的途径。