蚯蚓纤溶酶分子生物学进展

蚯蚓纤溶酶是近年发现的一种新型的溶解血栓物质,属丝氨酸蛋白酶,不同种属的蚯蚓中均可分离到,具纤溶活性和溶栓活性。有较好的热稳定性,多为单体酶,多数兼有纤溶活性和纤溶酶原激活活性。不同种属的蚯蚓分离的纤溶酶性质上有一定差别。已获得多种纤溶酶的N端序列及部分核酸序列,相互之间及与某些蛋白酶之间有一定的同源性。纤溶酶通过降解目的蛋白的特定位点而起作用 。     

重组海蚯蚓纤溶酶的克隆、表达及活性鉴定北大核心CSCD

纤溶酶在溶栓治疗中起重要作用,能够溶解血凝块的主要成分纤维蛋白。采用RACE方法从海蚯蚓消化道组织中扩增出海蚯蚓纤溶酶编码序列,构建该基因原核表达载体,并进一步构建工程菌表达融合蛋白,经Ni2+树脂柱纯化后通过平板法检测该融合蛋白纤维蛋白酶原激活活性。结果获得海蚯蚓纤溶酶的c DNA序列和氨基酸序列,并成功构建重组表达载体p ET-21a-AFE,表达纯化出融合蛋白,该融合蛋白能够激活纤维蛋白酶原而溶解纤维蛋白。总之,本研究获得了海蚯蚓纤溶酶的c DNA序列和氨基酸序列,并初步证明其具有纤维蛋白酶原激活活性,为临床新型溶栓药物的开发提供实验基础。     

重组海蚯蚓纤溶酶的克隆、表达及活性鉴定

纤溶酶在溶栓治疗中起重要作用,能够溶解血凝块的主要成分纤维蛋白。采用RACE方法从海蚯蚓消化道组织中扩增出海蚯蚓纤溶酶编码序列,构建该基因原核表达载体,并进一步构建工程菌表达融合蛋白,经Ni2+树脂柱纯化后通过平板法检测该融合蛋白纤维蛋白酶原激活活性。结果获得海蚯蚓纤溶酶的c DNA序列和氨基酸序列,并成功构建重组表达载体p ET-21a-AFE,表达纯化出融合蛋白,该融合蛋白能够激活纤维蛋白酶原而溶解纤维蛋白。总之,本研究获得了海蚯蚓纤溶酶的c DNA序列和氨基酸序列,并初步证明其具有纤维蛋白酶原激活活性,为临床新型溶栓药物的开发提供实验基础。     

蚯蚓纤溶酶新基因EfP-0的电子克隆及其编码区序列RT-PCR验证

利用生物信息学手段,以期获得蚯蚓纤溶酶F-Ⅰ-0组分的基因。根据从粉正蚓(Lumbricusrubellus)中分离的F-Ⅰ-0组分的N端氨基酸序列VVGGSDTTIGQYPHQL,利用DNAMAN软件通过电子克隆方法,从Lumbricidae的dbEST中获得该组分的核酸序列信息,设计特异引物,经过RT-PCR,成功地从赤子爱胜蚓(Eiseniafoetida)中克隆到一条蚯蚓纤溶酶新基因,命名为EfP-0。EfP-0基因全长678bp,编码225个氨基酸的成熟肽,属丝氨酸蛋白酶,胰蛋白酶家族,与F-Ⅰ-0组分的氨基酸组成非常接近。BLAST证明,EfP-0与已报道的蚯蚓纤溶酶基因之间的相似性均低于40%,因此为蚯蚓纤溶酶中的一个新基因,GenBank登录号为DQ836917。构建的pMAL-c2x-EfP-0重组质粒,在大肠杆菌TB1中获得融合蛋白MBP-EfP-0的可溶性表达,表达产物有酪蛋白平板溶解活性。     

血栓病治疗药物-纤溶酶的生物来源

血栓病的干预方式包括抗血小板凝集、抗凝血和溶栓,对应临床应用的分别是抗血小板、抗凝血酶和纤溶酶溶栓药物;纤溶酶是主要的溶栓类药物,主要用于血栓发病后的治疗。纤溶酶种类多来自于生物体,更多来自于微生物的次级代谢。本文从作用方式、安全性和市场开发等方面总结了国内外纤溶酶的类别、研究现状和发展趋势,并对不同产纤溶酶的微生物菌株类别进行了总结,对不同来源的纤溶酶基因和氨基酸序列等信息进行了比较,发现不同物种的纤溶酶基因虽然有差异,但主要是丝氨酸蛋白酶类,氨基酸序列一致性比较高,说明丝氨酸蛋白酶活性功能区域是相对保守的。     

蚯蚓纤溶酶基因P239的原核表达、纯化及活性测定

通过RT-PCR方法从蚯蚓(Lumbricus bimastus)中获得蚯蚓纤溶酶基因,命名为P-239,含有 852 个核苷酸,成熟肽编码 239 个氨基酸,通过Genbank 序列同源性比较,与已知的蚯蚓纤溶酶有一定的同源性,为首次获得的新基因.随后构建了pBV-220/P-239重组质粒,在大肠杆菌DH5α中进行原核表达,再经亲和层析柱纯化复性,其产物经活性测定,确定不仅具有激酶作用,而且具有直接溶栓活性.     

蚯蚓纤溶酶底物特异性

蚯蚓纤溶酶是具有较强溶栓作用的丝氨酸蛋白酶,为研究蚯蚓纤溶酶在溶栓的同时是否对其他血液蛋白有破坏作用,本实验以一些血液功能蛋白为底物,用蚯蚓纤溶酶在体外对其进行水解,采用SDS—PAGE检测水解前后底物成分的变化。结果显示,蚯蚓纤溶酶短时间内能完全水解纤维蛋白和纤维蛋白原,长时间作用下能部分水解牛血清白蛋白和人免疫球蛋白重链,不水解牛血红蛋白、牛血超氧化物歧化酶和牛凝血酶原。表明蚯蚓纤溶酶对血栓成分具有较强的识别和水解能力,而对其他血液蛋白作用微弱,说明蚯蚓纤溶酶作为药物使用时具有较强的溶栓和预防血栓形成的作用,且副作用较小。     

蚯蚓纤溶酶新基因EfP-0的电子克隆及其编码区序列RT-PCR验证

利用生物信息学手段,以期获得蚯蚓纤溶酶F-Ⅰ-0组分的基因。根据从粉正蚓（Lumbricus rubellus）中分离的FⅠ0组分的N端氨基酸序列VVGGSDTTIGQYPHQL,利用DNAMAN软件通过电子克隆方法,从Lumbricidae 的dbEST中获得该组分的核酸序列信息,设计特异引物, 经过RT-PCR,成功地从赤子爱胜蚓（Eisenia foetida）中克隆到一条蚯蚓纤溶酶新基因,命名为EfP-0。EfP-0基因全长678bp, 编码225个氨基酸的成熟肽,属丝氨酸蛋白酶,胰蛋白酶家族,与F-Ⅰ-0组分的氨基酸组成非常接近。BLAST证明,EfP-0与已报道的蚯蚓纤溶酶基因之间的相似性均低于40％,因此为蚯蚓纤溶酶中的一个新基因,GenBank 登录号为DQ836917。构建的pMAL-c2x-EfP-0重组质粒,在大肠杆菌TB1中获得融合蛋白MBP-EfP-0的可溶性表达,表达产物有酪蛋白平板溶解活性。     

反相色谱分离蚯蚓纤溶酶的初步研究

蚯蚓纤溶酶是由日本宫崎医科大学的Ｍｉｈａｒａ^［１］于１９８２年从蚯蚓的肠和体液中发现的。由于蚯蚓纤溶酶有良好的溶解血检的作用,可以治疗一系列与血栓形成有关的疾病,因而在临床上有很大的应用价值^[2],有可能成为一种新型的溶栓药物,继尿激酶、链激酶等之后应用于临床[4].关于蚯蚓纤溶酶的分离纯化,大多采用盐析、凝胶层析及离子交换层析等方法^[2-6],也有人采用亲和层析的方法^[7].本文以赤子爱胜蚓纤溶酶粗品为对象,对用反相色谱技术分离蚯蚓纤溶酶进行了初步尝试,现将结果报道如下。     

赤爱胜蚯蚓(Eisenia Foetida Sarigny)纤溶酶的研究Ⅱ药理学作用

对蚯蚓纤溶酶进行了哈白兔体内、体外溶栓、抗凝试验,分别以蛇毒抗栓酶和尿激酶不同剂量组作对照试验,均有显著的溶解血栓功能.另外,蚯蚓纤溶酶溶解天然血块,对纤维蛋白原含量及凝血时间影响的药理学试验,结果证明蚯蚓纤溶酶具有溶栓与抗凝作用.     

具有纤溶活性作用的海洋真菌代谢产物的分离与菌株鉴定

本文旨在分离具有纤溶活性作用的化合物和鉴定产生纤溶活性化合物的菌株FG216的种属分类。以马铃薯蔗糖培养基为种子培养基,改良查氏培养基为发酵培养基对菌株进行发酵培养,用甲醇作为提取溶剂,通过半制备型高效液相色谱从真菌FG216的1 L发酵液中分离和精制了12 mg纤溶活性化合物,该纤溶活性化合物在纤溶酶原和单链尿激酶性纤溶酶原激活剂相互活化反应体系中添加10μg/mL活性最高。对FG216菌株rDNA的ITS基因(ITS-5.8 S rDNA)进行PCR扩增、测序,从GenBank获取相似序列,通过序列比对分析和系统发育分析表明菌株FG216与Stachybotrys longispora同源性最高。从分离的海洋微生物葡萄穗霉属菌株FG216分离得到的纤溶活性化合物具体促进纤溶酶原和单链尿激酶性纤溶酶原激活剂相互活化的作用。     

广西沿海裸体方格星虫纤维蛋白溶解酶的研究

采用离心、硫酸铵分级盐析、离子交换、凝胶过滤层析等方法进行分离纯化,从裸体方格星虫内脏得到纤维蛋白溶解酶(纤溶酶),SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳测定为单一组分,相对分子质量为33250;酶学分析结果最适反应温度约为45℃,最适反应pH值为7.5 Ba2+离子对该酶活力有一定的抑制作用,而Mg2+、Ca2+、K+、Na+和Ag+不影响该酶的活性。裸体方格星虫纤溶酶纤溶活性完全被苯甲基磺酰氟(PMSF)抑制,为丝氨酸蛋白酶;此外,裸体方格星虫纤溶酶具有直接溶解纤维蛋白和激活纤溶酶原的双重作用,对预防和治疗血栓性疾病具有一定的药用价值。     

蚯蚓纤溶酶的分离纯化及性质

蚯蚓纤溶酶的分离纯化及性质邢宝东殷慎敏茹炳根（北京大学生命科学学院生物化学及分子生物学系,北京１００８７１）关键词蚯蚓;纤溶酶;纤维蛋白收搞日期：１９９７－０１－２１;接收日期：１９９７－０３－２７。蚯蚓作为中药已有悠久历史,许多中医都把它作为活血药...     

豆豉纤溶酶的研究现状

豆豉纤溶酶是从中国传统风味食品豆豉中分离得到的一种由杆菌产生的丝氨酸蛋白酶,具有极强的纤溶活性.综述了豆豉纤溶酶的产生菌种、发酵工艺、酶学性质、分离纯化、作用机理以及分子生物学特性等研究现状.豆豉纤溶酶在溶栓的过程中有着溶栓能力强,无毒副作用,原材料丰富,在体内半衰期长等优点,因此该酶有着广阔的应用发展前景.     

蚯蚓纤溶酶的分离纯化及部分序列的测定

以新鲜蚯蚓为原料,经过保温抽提、乙醇沉淀、DEAE-SepharoseFastFlow离子交换层析、Lysine-Sepharose4B亲和层析以及SDS-PAGE制备电泳等纯化步聚,得到一种纯度达95％以上的蚯蚓纤溶酶．该酶具有强烈的溶解纤维蛋白的作用及蛋白酶活性,平板法测得其比活性为90OUK单位／毫克蛋白,TAME法测得其比活性为2500O单位／毫克蛋白．酶学性质研究表明其最适反应温度为65℃,最适反应PH值为8．5．该酶的分子量为33kD,等电点为pH3．5．还对该酶进行了氨基酸组成分析,并测定了其N端部分序列．     

蛹虫草无性型深层培养液中纤溶酶的分离纯化和酶学性质研究

【目的】确立蛹拟青霉深层培养液中高纯度、高纤溶活性纤溶酶的分离纯化方法并测定其酶学性质。【方法】采用硫酸铵盐析、Sephadex G-25凝胶色谱、Phenyl-Sepharose HP疏水相互作用色谱、CM-Sepharose FF弱阳离子交换色谱和Superdex 75凝胶色谱对蛹拟青霉纤溶酶进行分离。用Lowry法测定蛋白质浓度,纤维蛋白平板法测定其纤溶活性,SDS-PAGE鉴定其纯度并确定其分子量,IEF法测定其等电点。【结果】研究发现,以蔗糖和豆饼为培养基主要基质时,蛹拟青霉深层培养可以产生至少两种纤溶酶。提纯后的纤溶酶Ⅱ比活力达到800.46 U/mg,总纯化倍数为30.07倍。纤溶酶Ⅱ的相对分子量和等电点分别为32 kD和9.3±0.2。纤溶酶Ⅱ是一种糖蛋白,总含糖量为0.98%(W/V)。该酶可以顺次降解人血纤维蛋白(原)的α、β和γ链。其最适作用pH及温度分别为7.4和41°C。Aprotinine与PMSF对该纤溶酶的活性完全抑制,推测此纤溶酶可能是一种丝氨酸蛋白酶。【结论】单一的高纤溶活性纤溶酶的获得和酶学性质的确定,为该酶开发成为新型溶栓药物提供了理论依据。     

蚯蚓纤溶酶原激活剂的分离纯化及其性质

为了从赤子爱胜蚓中获得主要表现为纤溶酶原激活活性的蛋白酶,采用盐析、离子交换层析、凝胶过滤层析和疏水吸附层析从蚯蚓组织匀浆中纯化出6种具有纤溶活性的酶组分(F1、F2、F3、F4、F5和F6).它们均为单一多肽链;表观分子量分别为28500、29500、26100、26300、14850和32800;经非还原型SDSPAGE和扫描仪扫描,纯度分别为100%、95.2%、96.5%、93.6%、98%和97.8%;等电点(pI)均不高于3;SDSPAGE后,用Schiff试剂染色显示F5为糖蛋白;纯化的6种酶于20℃～50℃保温1h,酶活力基本不变;F1和F2、F3和F4、F5和F6分别在pH4～10、4～11、7～12范围内稳定;水解BAEE试验及纤溶活性抑制试验表明,F6既是丝氨酸蛋白酶,又是含金属离子的蛋白酶,其它5种酶为胰蛋白酶样的丝氨酸蛋白酶;免疫双扩散试验结果初步表明,F1和F5以及它们和其它4种组分之间无共同的抗原决定簇;用纤维蛋白平板法及以ChromozymU和ChromozymPL为底物测定,除F1外,其余5种酶的纤溶酶原激活活性明显强于其直接纤溶活性.     

赤爱胜蚯蚓(Eisenib Foetide Sorigng)纤溶酶的研究 1.提取纯化和生物化学性质

采用35％和65％的饱和硫酸铵分级沉淀法,获得蚯蚓纤溶酶活性蛋白,并对其纤溶酶的分子量,纤溶酶对其底物专一性,温度对纤溶酶的影响,纤溶酶最适pH值和pH值稳定性,纤溶酶的等电点,抑制剂对蚓蚯纤溶酶的影响几方面的测定,从而确定了蚯蚓纤溶酶的生物化学性质。     

蚯蚓中抗肿瘤蛋白组分的提取分离及其抗肿瘤活性

以赤子爱胜蚓为原料 ,通过蛋白质的丙酮沉淀和凝胶过滤 ,分离得到一组抗肿瘤活性蛋白成分 (简称蚯蚓抽提物 ) ;这组成分富含Fe、Zn、Cu以及Se等微量元素 ,蛋白含量为 6 0 4 3± 2 36 %(n =5 ) .体外实验中 ,通过MTT法和SRB法测定了蚯蚓抽提物对多种人癌细胞株 (HCT 116、SY5Y、K5 6 2、MGc80 3和HeLa)以及正常细胞株 (HEK2 93和COS 7)的抑制杀伤率 .结果表明 ,蚯蚓抽提物对癌细胞的杀伤有一定的选择性 ,受试人癌细胞达到 5 0 %生长抑制率所需作用浓度约 6 0～110mg L ;但是 ,10 0℃煮沸 5min后 ,该抑制活性完全消失 .通过纤维蛋白平板法 ,测得蚯蚓抽提物同时具有纤溶酶和纤溶酶原激活酶的活性 .体外测得丝氨酸蛋白酶抑制剂aprotinin和PMSF能显著抑制蚯蚓抽提物的细胞杀伤活性 .体内实验中 ,蚯蚓抽提物能有效延长荷瘤 (S180 )小鼠的生存时间 ,并使其身体机能得到明显改善 .腹膜内注射剂量为 2 8mg kg和 36mg kg时 ,生命延长率分别为135 3%和 12 3 5 % ,和标准药物 (环磷酰胺 )治疗后结果 (76 5 % )相比 ,有显著性差异     

赤爱胜蚯蚓（Eiseniba Foetida Sarigng）纤溶酶的研究──■蚯蚓纤溶酶活性测定方法的研究

本文主要阐述了蚯蚓纤溶酶活性（效价）的测定方法的研究结果。通过对气泡上升法,精氨酸脂酶法（ＴＡＭＥ法）和纤维蛋白平板法测定蚯蚓纤溶酶活性的比较,最后认为纤维蛋白平板法能够客观地表示出纤溶酶溶解血栓的能力,虽然方法较为复杂,难度较大,但准确性强,结果可靠。ＴＡＭＥ法由于受样品中混有杂蛋白酶其稳定性受到一定的影响,但此法简便易行可作为中间产品的快速检测。文中详细地介绍了纤维蛋白平板法。