温度对马铃薯甲虫生长发育的影响

为了进一步明确温度对马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata (Say)生长发育的影响, 在恒温条件, 研究了温度对马铃薯甲虫实验种群生长发育的影响。结果表明：温度对马铃薯甲虫各虫态的发育历期、存活率及种群的繁殖力有显著的影响。发育历期随温度的升高而缩短, 发育速率与温度呈显著的正相关。马铃薯甲虫世代存活率由大到小的顺序为27℃＞23℃＞19℃＞31℃＞15℃。27℃时成虫的产卵量最高, 单雌平均卵量为729.7粒;其次为23℃, 单雌平均卵量为639.2粒。并测得马铃薯甲虫卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、4龄幼虫、幼虫期、蛹期及全世代的发育起点温度分别为9.14, 10.50, 8.17, 10.28, 9.04, 9.59, 10.23和10.90℃, 有效积温分别为73.26, 43.22, 39.23, 34.05, 161.97, 273.02, 100.38和542.58日·度。据此认为温度对马铃薯甲虫实验种群的生长发育、存活和繁殖影响明显。     

异色瓢虫成虫体型及体内脂肪含量对其耐寒能力的影响

为明确异色瓢虫Harmonia axyridis (Pallas)成虫体型及体内脂肪含量对其耐寒能力的影响, 本研究在2种发育温度(18℃和25℃)下通过表型可塑性诱导获得了不同体型的异色瓢虫成虫, 测定了成虫体型大小、体内脂肪含量、过冷却点(supercooling point, SCP)及其在恒定低温(constant low temperature, CLT)和变温(fluctuating thermal regime, FTR)下的存活率。结果表明: 较低发育温度(18℃)下的成虫体型比25℃下的明显大(P<0.01), 体内脂肪含量显著高于25℃下的(P<0.01); 且两2种发育温度下成虫体内脂肪含量与虫体干重呈较好的正相关关系。由SCP频次分布图可知, 饲养在18℃下的成虫SCP主要集中在-8 ~ -6℃范围内, 饲养在25℃下的成虫SCP主要集中在-10 ~ -9℃范围内; 且成虫体型大小与过冷却能力呈现负相关关系。经过相同时间低温暴露后成虫的存活率按下列顺序降低: FTR18℃＞FTR25℃＞CLT18℃＞CLT25℃。结果表明低温暴露过程中脂肪贮存对异色瓢虫成虫存活是非常重要的, 但是冷伤害是影响存活的基本因素。     

小菜蛾对阿维菌素抗性基因的AFLP连锁图谱的构建

世界性害虫小菜蛾Plutella xylostella (L.) 田间种群已对阿维菌素药剂产生了高抗药性。本研究以小菜蛾对阿维菌素的抗性品系、敏感品系和回交群体组建作图家系,再利用AFLP技术构建小菜蛾对阿维菌素抗性基因的连锁图谱。用10组AFLP引物组合对未经药剂处理的小菜蛾成虫DNA选择性扩增,共获得1 044条可区分的DNA条带,271条带具有多态性,χ²检验表明只有123个位点符合1∶1 （P=0.05）,其中的112个构成28个连锁群,其总长度为1 222.7 cM; 用10组AFLP引物对经药剂处理后存活的小菜蛾成虫DNA扩增,所得的DNA条带中有54个条带符合分离比1∶1,经Mapmaker 3.0对多态性位点分析,只有E1M4-15、E1M1-4和E1M4-2标记位点位于同一连锁群,3个AFLP标记与抗性基因的遗传距离分别为0 cM,8.3 cM和13.1 cM。比较分析得出,抗性基因所在的连锁群是第5连锁群。结果显示AFLP连锁图谱对小菜蛾对阿维菌素的抗性监测具有很好的应用潜力。     

RNAi介导的棉铃虫氨肽酶N基因Haapn1和钙粘蛋白基因Ha_BtR沉默对Cry1Ac毒力的影响

氨肽酶N（aminopeptidase N, APN）和钙粘蛋白（cadherin）是存在于鳞翅目昆虫中肠刷状缘膜囊（brush border membrane vesicles, BBMV）上Bt毒素Cry1A的受体。本实验将棉铃虫Helicoverpa armigera氨肽酶N1基因Haapn1和钙粘蛋白基因Ha_BtR双链RNA（dsRNA）注入棉铃虫4龄幼虫体内, 以研究这两种受体基因沉默后对Cry1Ac毒力的影响。结果表明: 注射dsRNA（1 μg/头）进行基因沉默后, Haapn1 mRNA表达量比注射缓冲液（elution solution, ES）的对照下降了30%~49%, Ha_BtR mRNA表达量下降了30%~37%。注射Haapn1 dsRNA的幼虫在40和70 μg/cm² Cry1Ac活化毒素下的死亡率显著低于注射ES的幼虫, 而在 100 和 170 μg/cm² Cry1Ac原毒素处理下两者死亡率无显著差异; Cry1Ac活化毒素以及原毒素对注射Ha_BtR dsRNA幼虫与注射ES幼虫的毒力均无显著差异。当同时注射Haapn1及Ha_BtR dsRNA后, 干扰后的幼虫对Cry1Ac活化毒素和原毒素的敏感性均显著下降。本研究进一步证明了棉铃虫Haapn1和Ha_BtR均是Bt毒素Cry1Ac的功能受体, 这两种受体蛋白共同参与Cry1Ac的毒杀作用过程。该结果也提示, Haapn1或Ha_BtR基因产生突变都可能导致棉铃虫对Cry1Ac产生抗性。     

菲律宾实蝇生物学特性研究

菲律宾实蝇Bactrocera (Bactrocera) philippinensis (Drew & Hancock)是重要的检疫性有害生物, 严重危害芒果Mangifera indica L.、木瓜Carica papaya L.和菠萝蜜Artocarpus heterophyllus Lam.等水果。本文在室内实验条件下对菲律宾实蝇生物学特性进行了较为系统的研究。结果表明: 菲律宾实蝇在6~18 h羽化率达93.93%。成虫活动、寿命、交配和产卵与温度、光照密切相关。补充营养能显著延长成虫寿命。菲律宾实蝇生长、发育和繁殖的适宜温度为25~30℃。25℃和30℃时平均产卵量分别为627.35粒和652.57粒。发育起点温度和世代有效积温分别为14.31℃和450.43日·度。温度与发育历期呈显著的负相关（r=-0.9005）。本研究为菲律宾实蝇的检疫处理和田间防治技术研究提供了重要的基础资料。     

甜菜夜蛾低龄幼虫取食含Cry1Ac毒素的人工饲料对其生长发育和成虫繁殖的影响

为了更全面地评价转Bt基因作物对甜菜夜蛾Spodoptera exigua (Hübner)（鳞翅目: 夜蛾科）的影响, 在室内研究了甜菜夜蛾低龄幼虫连续6 d取食含不同浓度Cry1Ac毒素的人工饲料后转移到不含毒素的饲料上, 其生长发育与成虫繁殖的变化。结果表明: 低龄幼虫取食含Cry1Ac的饲料6 d内, 校正死亡率随Cry1Ac浓度的升高以及取食时间的延长而升高。与一直取食不含Cry1Ac饲料的对照相比, 取食含Cry1Ac饲料的幼虫体重显著下降; 幼虫历期、预蛹期及雌雄蛹期均显著延长, 但雌雄蛹重均与对照无显著差异; 幼虫化蛹率显著下降, 但羽化率与对照无显著差异; 成虫产卵前期显著延长, 产卵期与对照无显著差异, 仅在5 μg/g处理下较对照显著延长1.3 d; 每雌产卵量以10 μg/g处理最高（719粒）, 但各处理均与对照无显著差异; 雌蛾寿命均显著延长, 而雄蛾寿命仅在最高浓度80 μg/g下显著延长2.4 d。这表明, 尽管含不同浓度Cry1Ac毒素的饲料对甜菜夜蛾低龄幼虫有明显的生长发育抑制作用或导致死亡, 但转移至不含毒素的饲料上取食后, 幼虫能迅速恢复生长, 顺利化蛹、羽化并产卵。因此, 在转Bt基因作物田生长后期, 甜菜夜蛾低龄幼虫取食表达Cry1Ac蛋白的组织若能存活并完成世代发育和繁殖, 这无疑将增加甜菜夜蛾对Bt作物产生抗性的风险, 因此亟需制定Bt作物生态系统中甜菜夜蛾的治理策略。     

Cry1Ac毒蛋白对粘虫生长发育、繁殖及飞行能力的影响

为了更全面地评价转基因作物对粘虫Mythimna separata (Walker)（鳞翅目: 夜蛾科）的影响, 在室内用生测法研究了粘虫初孵幼虫连续取食含不同浓度的Cry1Ac毒蛋白的人工饲料后, 其生长发育、繁殖及飞行能力的变化。结果表明: 取食0（对照）, 3, 6, 12, 24, 48和96 μg/g Cry1Ac毒蛋白人工饲料6 d后的幼虫头宽、 体长、 18 d后的体重随着毒蛋白浓度的升高显著降低, 幼虫发育历期显著延长, 死亡率显著升高。取食含毒蛋白浓度>12 μg/g饲料的幼虫不能正常化蛹; 取食含0, 3和6 μg/g毒蛋白饲料的幼虫能正常化蛹、 羽化, 化蛹率随着毒蛋白浓度的升高而显著降低、 蛹历期显著延长; 取食含0, 3和6 μg/g毒蛋白饲料的幼虫羽化的成虫繁殖能力有显著差异, 产卵前期随毒蛋白浓度的升高显著延长, 产卵量显著降低; 而1日龄成虫飞行能力（飞行距离、 时间和速度）则随毒蛋白浓度的升高显著降低。这些结果表明, Cry1Ac毒蛋白对粘虫的生长发育、 繁殖及飞行具有显著影响, 从而为完善转Bt作物的生态安全性风险评估提供了重要的实验依据。     

光滑鳖甲热休克蛋白70基因的克隆及表达

根据GenBank中发表的昆虫热休克蛋白70 (heat shock protein 70, HSP70) 基因的保守序列设计引物,利用PCR结合RACE扩增的方法,获得新疆荒漠昆虫光滑鳖甲Anatolica polita borealis热休克蛋白70基因,命名为APhsp70 (GenBank注册号为EF569673)。测序结果表明,序列长为2 092 bp,由核酸序列推演出的蛋白质分子量为70 kD,含653个氨基酸残基。基因结构分析表明APhsp70不含内含子序列。通过Northern blotting和半定量RT-PCR技术研究昆虫在受到不同温度胁迫时该基因的表达规律,结果表明：在45℃处理时,昆虫体内该基因的表达水平显著上升。并且,当机体受到-5℃低温胁迫并在室温恢复15 min后APhsp70的表达量也显著升高;但是4℃和-10℃低温处理组APhsp70的表达未见明显变化。     

黄粉甲抗冻蛋白AFP84a在大肠杆菌中的高效表达及活性检测

为表达和纯化黄粉甲Tenebrio molitor抗冻蛋白, 采用RT-PCR方法扩增得到黄粉甲抗冻蛋白基因afp84a cDNA, 将其连接到pMAL-p2X质粒上, 构建分泌型融合表达载体pMAL-p2X-afp84a, 并在大肠杆菌Escherichia coli TBI中表达; 进一步利用Amylose柱亲和纯化出该重组蛋白, 后利用细菌抗寒性检测重组蛋白的生物活性。结果显示: 融合蛋白含量占总可溶蛋白的40%。SDS-PAGE分析表明, 用MgSO4处理法与超声波细胞破碎法均可使融合蛋白从细胞中释放; 融合蛋白经Amylose柱亲和纯化, Factor Xa因子酶切, 电泳显示获得的目的蛋白呈单一条带。细菌抗寒性检测表明该重组蛋白具有较高的抗冻活性。黄粉甲抗冻蛋白基因afp84a cDNA的克隆、 原核表达为进一步研究抗冻蛋白的性质和应用提供了有用的实验材料。     

家蚕吡哆醛激酶的融合表达与纯化

【目的】吡哆醛激酶（pyridoxal kinase, PLK, EC 2.7.1.35）是维生素B6的关键代谢酶。本研究原核表达家蚕Bombyx mori重组PLK, 为进一步开展家蚕PLK的催化作用机制和表达调控机制的研究奠定基础。【方法】构建家蚕PLK基因融合表达质粒, 转化大肠杆菌Escherichia coli诱导表达, 经Ni²⁺ 亲和层析纯化后, 对融合蛋白的催化活性进行分析。【结果】纯化后的家蚕重组PLK经SDS-PAGE鉴定为单一条带, 比活力为1 800 U/mg, 纯化倍数为40倍。在底物过量的条件下, 该重组酶的体外最适反应温度是50℃; 最适pH为5.5~6; Zn²⁺ 是酶促反应有效的激活剂。【结论】重组家蚕PLK与来源于家蚕组织的PLK具有相同的催化性质。     

十一星瓢虫在不同温度下的实验种群生命表

组建了十一星瓢虫在16℃、20℃、24℃、28℃和32℃下的实验种群生命表。结果表明：各 虫态的发育速率随温度的升高而加快,在16℃下世代的发育历期最长(64.2天),而32℃时仅为16.4天,24℃和28℃时分别为27.1天和21.5天。卵、幼虫、蛹和世代的发育起点温度分别为10.9℃,11.1℃,12.5℃和10.6℃,有效积温分别为40.9,110.3,39.7,359.4日·度。成虫寿命随温度升高而逐渐缩短,16℃时最长,为34.7天,在32℃下最短,为14.1天; 单雌产卵量在24℃时最高,平均为463.8粒,32℃时最低,为96.4粒。在恒温24℃～28℃内, 十一星瓢虫的种群趋势指数和内禀增长力较高, 种群加倍时间较短。16℃时种群增长受到较大制约,种群趋势指数仅为24℃时的10.7%,种群加倍时间约22.3天,为24℃时的4.1倍。32℃时十一星瓢虫的发育历期缩短,存活率、繁殖力降低。     

桔小实蝇不同发育阶段过冷却点的测定

对桔小实蝇Bactrocera dorsalis (Hendel)不同发育阶段的过冷却点进行了测定。结果表明：同一虫期个体间的过冷却点出现不同程度的变异,但均服从正态分布。不同虫期的过冷却点差异显著,其中蛹的过冷却点最低（-12.2℃～-15.0℃）。老熟幼虫的过冷却点为-8.1℃。成虫的过冷却点最低值为7日龄雄虫（-10.5℃）和雌虫（-10.1℃）,最高值为60日龄雄虫（-5.9℃）和雌虫（-6.4℃）,但同一发育时期的雌、雄成虫之间的过冷却点没有差异。测定结果提示蛹期最有可能是该虫在温带地区越冬的虫态。     

温度对食菌小蠹光滑足距小蠹实验种群发育和繁殖的影响

为了明确温度对光滑足距小蠹Xylosandrus germanus发育和繁殖的影响, 本研究分别采用真菌Acremonium kiliense和Ambrosiella hartigii在培养皿中饲养雌成虫和幼虫, 以及半人工饲料在试管中培养雌成虫的方法, 系统地研究了该食菌小蠹在16~31℃范围内6个恒温条件下的发育和16~28℃范围内5个恒温条件下的繁殖力和性比。结果表明: 从16~28℃, 光滑足距小蠹未成熟期各虫态和卵至成虫的发育历期均随温度升高而缩短, 16℃时蠹虫的发育历期为28℃时的3~4倍, 31℃时除蛹外发育历期又有延长。各温度下均以幼虫的发育历期为最长, 占卵至成虫羽化整个发育历期的50%以上。幼虫发育的最适温度为26.44℃。发育起点温度在11.0℃（蛹）至12.7℃（卵至成虫）之间。卵期有效积温最小（61.5日·度）, 幼虫期最大（189.7日·度）, 卵至成虫需要12.7℃以上约305日·度的积温才能完成发育。卵至成虫的存活率在16~25℃范围内从53.3%增大至68.3%, 28~31℃范围内又从35.0%降至3.3%。31℃时幼虫几乎不能化蛹。在半人工饲料中, 22~25℃范围内每雌平均后代数为114.3~121.5头, 以25℃时为最大, 约为16℃时的3倍、19℃和28℃时的2倍。雌雄性比以16℃时为最小（9.6∶1）, 25℃时最大（23.3∶1）, 其余温度下均为19.0∶1以上。结果说明, 温度直接影响光滑足距小蠹的发育, 主要通过影响虫道真菌生长和产孢而影响光滑足距小蠹的繁殖。     

棉铃虫P450基因CYP6AE12和CYP9A18的克隆与mRNA表达水平

采用RT-PCR和RACE技术克隆到2个新的棉铃虫细胞色素P450基因：CYP6AE12和CYP9A18。CYP6AE12的cDNA编码区长1 569 bp,编码523个氨基酸;CYP9A18的cDNA编码区长1 590 bp,编码530个氨基酸。用实时定量PCR技术分析了这2个基因在棉铃虫YS敏感品系和YS-FP抗性品系(由氰戊菊酯加辛硫磷混剂筛选YS品系而得) 6龄幼虫脂肪体和中肠中mRNA的表达水平。结果表明：CYP6AE12和CYP9A18的mRNA表达具有组织特异性,CYP6AE12在脂肪体中表达量较高,而CYP9A18在中肠中的表达量较高。与相对敏感品系YS相比,CYP6AE12在YS-FP抗性品系中肠和脂肪体中的mRNA表达量分别为YS品系的3.6倍和1.3倍;CYP9A18在YS-FP品系中肠和脂肪体的mRNA表达量分别为YS品系的0.3倍和1.0倍。CYP6AE12的过量表达与YS-FP品系棉铃虫的抗药性可能有一定关系。