采用遗传工程产生‘杂种’抗生素

最近发展起来的链霉菌分子克隆系统使得分离某些抗生素的生物合成基因成为可能,而众多的抗生素则是由细菌的这个重要属中的许多成员产生的。现在可以用上述克隆来检验如下设想:即通过生物合成基因在产生不同扰生素的链霉菌之间的转移,或许能产生新的抗生素。     

吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus 17997中噬菌体基因转移系统的建立及其应用

由吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus 17997产生的格尔德霉素geldanamycin(GA)属安莎类抗生素,具有良好的抗肿瘤和抗病毒活性。本文应用链霉菌温和噬菌体ΦC31衍生的KC515载体,在吸水链霉菌S．hygroscopicus 17997中建立并优化了S．hygroscopicus 17997的基因转染体系。利用所建立的基因转染体系,以基因阻断技术从S．hygroscopicus 17997基因文库含有多组PKS基因柯斯质粒中,鉴定了与GA PKS生物合成相关基因的柯斯质粒,该工作为GA生物合成基因簇的克隆奠定了基础。     

链孢霉生物钟基因已被克隆

两种显著不同的生物似乎使用类似的基因来控制它们的昼夜节律。研究24小时循环交替的称作近似昼夜节律之分子基础的科研人员已克隆了控制粉红色链孢霉(Neurospora)生物钟的基因。该霉的孢子生长周期是已知的最不复杂的近似昼夜节律中的一种。当新罕布什尔州Hanove城Dortmouth学院的J.Dunlap、J.Loros和C.Robertson McClung把克隆了的基因引入不具生物钟特性的链孢霉突变体里时,该链孢霉的孢子形成节律得到恢复。他们亦发现已克隆的链孢霉生物钟基因的遗传序列仅仅只与科学家们从果蝇中已经克隆的其他生物     

卡西霉素生物合成基因簇中调控基因calR1的功能

【背景】卡西霉素(calcimycin)是重要的离子载体抗生素,其生物合成基因簇已从教酒链霉菌NRRL3882的基因组DNA中成功克隆,但基因簇内的部分生物合成基因及调控基因的功能有待研究。【目的】研究卡西霉素产生菌教酒链霉菌NRRL3882中编码TylR家族同源转录调控蛋白的calR1基因的功能。【方法】通过PCR-targeting的方法,构建calR1基因敲除突变株及回补菌株,对突变菌株及回补菌株进行发酵,通过HPLC分析其代谢产物。利用荧光定量PCR检测ΔcalR1突变菌株和野生菌株的生物合成基因转录水平。【结果】calR1基因敲除突变株丧失产生卡西霉素的能力,但仍有中间产物噻唑霉素的积累,回补菌株中卡西霉素的产量有一定程度的恢复。RT-qPCR结果表明,卡西霉素合成相关的一些重要基因calC、calG、calU3等基因的表达量明显改变。【结论】TylR家族转录调控基因calR1是卡西霉素生物合成的调控基因。     

Tetramycin抗性基因克隆及生物活性的测定

为研究Tetramycin生物合成基因簇,提高产量,根据已知链霉菌抗性基因的保守核苷酸序列设计简并引物,以链霉菌11371基因组DNA为模板进行克隆Tetramycin抗性基因,并将其转化GS115中表达,以阳性克隆为指示菌,测定Tetramycin抗性基因生物活性。结果显示克隆的Tetramycin抗性基因1-2-1和2-1-1测定生物活性时并没有表现出对Tetramycin拮抗作用的提高,但为进一步研究Tetramycin生物合成基因簇、提高Tetramycin产量提供理论数据。     

灰色链霉菌质粒编码链霉素生物合成有关基因的研究

链霉素是由链霉糖、链霉胍和N甲基一L一葡萄糖胺三部分组成。我们证明了经高温消除质粒后不产链霉素的突变株不能合成链霉胍。在补加外源链霉胍、链霉胍磷酸酯酶、并有ATP和Mg~(2 )存在的条件下,由链霉胍磷酸酯酶催化外源链霉胍转变为O-磷酸链霉胍,进入链霉素的正常生物合成途径后产生链霉素。本文证明了灰色链霉菌质粒编码链霉胍磷酸酯酶的基因以及链霉胍合成的有关基因。     

麦迪霉素聚酮缩合酶基因的亚克隆及表达

利用与麦迪霉素生物合成有类似途径的放线紫红素聚酮缩台酶基因ActⅠ作为探针,将来源于麦迪霉素产生菌基因文库的与ActⅠ有同源性的阳性初级克隆pcN8812进一步缩小,亚克隆获得了2．4kb的麦迪霉素聚酮缩台酶基因,将其插入pwHM3载体中构建了重组质粒pcG2 DNA。pcG2 DNA在放线紫红素聚酮缩合酶基因缺陷型变株天蓝色链霉菌TKl7及螺旋霉素产生菌S．Ambofaciens中均获得表达。前者所得产物不同于麦迪霉素和放线紫红素,可能为新的杂合抗生素,后者能使螺旋霉素产量得到提高。另外pcG2 DNA在道诺红霉素产生菌调节变株S.peucetiusH6101中的表达产物经TLC及HPLC分析表明为紫红霉酮。pcG2 DNA在Tetracenomycin C产生菌S．Glaucescens中亦有一定的功能表达,而在红霉素产生菌红霉内酯阻断变株Saccharapolyspara erythraea WMH 15,26l中未观察到活性表达。推测pCG2 DNA具有一定调节或在某些聚酮类抗生素产生菌变株中超互补的功能。     

龟裂链霉菌原生质体的形成和再生

微生物原生质体形成、再生和融合技术已 广泛用于遗传学研究和工业微生物杂交育种。 1978年,BatlzF51进行了弗氏链霉菌和灰褐链霉 菌的原生质体融合,得到了稳定的重组体;1982 年Thoms pon等^[10]通过原生质体转化,将载有 抗性及营养基因的重组DNA片段在链霉菌 中进行了克隆。近年来,我国在这方面的研究 也取得了一些进展[^{1,2]相似文献}   

被孢霉cDNA文库的构建及△９脂肪酸脱饱和酶cDNA序列的筛选

为了克隆被孢霉不饱和脂肪酸生物合成途径的相关酶基因,构建了基于λgt10的被孢霉cDNA文库。cDNA文库库容量为2×１０.６pfu。以已克隆的被孢霉△９脂肪酸脱饱和酶保守区cDNA为探针对被孢霉cDNA文库进行筛选。经过两轮筛选获得1个阳性克隆,其插入片段长度大于16kb。     

吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus 17997中噬菌体基因转移系统的建立及其应用

由吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus 17997产生的格尔德霉素geldanamycin(GA)属安莎类抗生素, 具有良好的抗肿瘤和抗病毒活性。本文应用链霉菌温和噬菌体C31衍生的KC515载体,在吸水链霉菌S.hygroscopicus 17997中建立并优化了S. hygroscopicus　17997的基因转染体系。利用所建立的基因转染体系,以基因阻断技术从S. hygroscopicus 17997基因文库含有多组PKS基因柯斯质粒中,鉴定了与GA PKS生物合成相关基因的柯斯质粒,该工作为GA生物合成基因簇的克隆奠定了基础。     

被孢霉cDNA文库的构建及△^9脂肪酸脱饱和酶cDNA序列的筛选

为了克隆被孢霉不饱和脂肪酸生物合成途径的相关酶基因,构建了基于λgt10的被孢霉cDNA文库.cDNA文库库容量为2×106pfu.以已克隆的被孢霉△9脂肪酸脱饱和酶保守区cDNA为探针对被孢霉cDNA文库进行筛选.经过两轮筛选获得1个阳性克隆,其插入片段长度大于1.6kb.     

林可链霉菌黑色素生物合成基因的克隆与表达

以pIJ702的melCl－C2基因为探针杂交林可链霉菌（Streptomyceslincolnensis）78－11染色体DNA,呈现出3．2kb的BamHI片段和2．6kb的SphI片段等一系列阳性条带。构建了含3．0～3．5kbBamHI片段的林可链霉菌78-11基因文库,从中分离克隆了黑色素生物合成基因melCl和melC2,并测定了含有mel基因的重组子pRSB336插入片段的全部DNA顺序。3152bpBamHI片段含有5个开放阅读框架,其中melCl和melC2与链霉菌属三个种的相应基因具有较高的同源性。此外,林可链霉菌78－11的melC2基因产物与人和鼠的酪氨酸酶轻微同源,分别为17．3％和24．5％。种种迹象表明,melCl、melC2和orf3组成黑色素生物合成操纵子结构。为了进一步鉴定上述克隆的林可链霉菌78-11黑色素生物合成基因,构建了分别含有新霉素抗性基因启动子和正反方向mel基因的重组质粒pPZ518和pPZ519,并转化变铅青链霉菌TK23。随机挑选的12个pPZ518转化子在R2YE培养基上均能分泌淡褐色色素,而所有的pPZ519和pES1转化子则都呈白色。     

麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因的研究

将麦迪霉素产生菌基因文库中与放线紫红索酮基还原酶基因actⅢ有同源性的4·0kb DNA片段克隆到质粒载体pWHM3中,构成重组质粒pCB4。将质粒pCB4转入酮基还原酶基因缺陷菌株——加利利链霉菌ATCC3167l中,得到转化子。转化子发酵产物经TLC和HPLC分析证明是阿克拉菌酮,与加利利链霉菌原株ATCC31133的产物相同,说明麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因互补了加利利链霉菌ATCC31671中缺陷的酮基还原酶基因,使其恢复了产生阿克拉菌酮的能力。4．Okb DNA片段插入方向相反的重组质粒pCBR4在加利利链霉菌ATCC31671中发酵产物经TLC分析证明也是阿克拉菌酮,这说明4．0kbDNA片段中麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因具有自身的启动子。对4．0kb DNA片段进行了限制酶酶切分析,建立了其酶切图谱。以actⅢ基因为探针,经分子杂交以及亚克隆和DNA转化实验,将麦迪霉索产生菌酮基还原酶基因定位于BssH Ⅱ—BamH Ⅰ 1．3kb DNA片段上。对1．3kb DNA片段核苷酸序列分析结果表明：此1．3kbDNA片段中含有一个独立的ORF,起始密码ATG,终止密码TAG,含783bp;在起始密码上游有GGAGG5个核苷酸SD序列;此ORF编码260个氨基酸,与actⅢ基因编码的261个氨基酸相似性为77．4%,相同性为66．7％,对麦迪霉素产生苗酮基还原酶基因的可能作用进行了讨论。     

分予克隆链霉菌抗生素生物合成的整个途径以及它们在异源寄主中的表达

在产生抗生素的微生物上采用分子克隆将会导致抗生素产量的增加,同时通过种间体外重组将导致合成新的抗生素,~2为此目的,应将抗生素合成基因分离出来,进行分析,并可能还要修饰。链霉菌的一些种产生几乎已知抗生素的三分之二。最近在这个属内发展起来的克隆系统使得有可能分离并分析链霉菌的基因了。然而,抗生素是     

金霉素生物合成基因簇中调控基因ctcB的功能

【目的】研究金霉素产生菌中SARP家族转录调控基因ctc B的作用。【方法】利用大肠杆菌、链霉菌的属间接合转移和同源重组双交换的方法,构建ctc B基因缺失突变株。通过c DNA在相邻同转录方向的基因间隔进行PCR验证,确定金霉素生物合成基因簇中的转录单元。利用荧光定量RT-PCR方法进行突变株金霉素生物合成基因簇的转录水平检测。随后,生物信息学预测分析了金霉素生物合成基因簇内Ctc B与DNA的结合位点。【结果】获得了ctc B基因缺失的双交换突变株。发酵结果显示,该突变株失去产生金霉素与四环素的能力。金霉素生物合成基因簇内有6个共转录单元,其中4个共转录单元在ctc B基因缺失突变株中转录水平明显下降。软件分析预测到一致性较高的Ctc B结合重复序列。【结论】ctc B正调控金霉素生物合成结构基因ctc G-D、ctc H-K、ctc N-P、ctc W-T 4个转录单元和ctc Q,为进一步研究ctc B调控机制奠定了基础。     

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因sanA的克隆、结构和功能

圈卷产色链霉菌是尼可霉素产生菌,经紫外线诱变后,以赤星灰霉为指示菌筛选到遗传稳定的尼可霉素生物合成阻断突变株,选择其中的NBB19为受体,以质粒pIJ702为克隆载体,从野生型圈卷产色链霉菌的DNA文库中克隆到了6kb的DNA片段,能互补NBB19使之恢复尼可霉素的产生能力.对6kbDNA片段中的部分片段进行了序列分析,结果表明2710bpDNA片段包含一个1365bp的完整开放阅读框架,编码一个由454个氨基酸残基组成的蛋白质,该基因命名为sanA.蛋白序列数据库比较结果表明,sanA编码的蛋白质氨基酸序列与Pyrococcus horikoshii的甲基转移酶有较高的同源性,353个氨基酸残基中有25%的一致性.用基因破坏策略研究了sanA的功能,野生型菌株sanA基因被破坏后导致失去合成尼可霉素的能力,表明sanA是尼可霉素生物合成中的一个新的重要基因.     

绿色木霉纤维素酶CBHII基因的分子克隆

本文以噬菌体lambda EMBL3 DNA为载体,通过克隆绿色木酶(Trichoderma viride)高分子量基因组DNA的部分酶解片段,并将重组分子进行体外包装后侵染Escherichia.coli K802,由此构建了绿色木霉基因文库。以李氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶CBHII基因的末端片段为探针,用轮迥噬菌斑原位杂交从文库中筛选出CBHII基因的阳性克隆5个,随机取其中3个克隆用上述探针作斑点杂交,结果进一步证明克隆了全长或近全长的绿色木霉CBHII基因,用李氏木霉CBHI基因的末端片段探针作斑点杂交,结果提示CBHI与CBHII基因的末端序列之间无同源性存在。从斑点杂交的阳性克隆中提取DNA,酶切鉴定插入片段的长度,并克隆于质粒pUC19,Southern杂交结果证明获得了含绿色木霉CBHII基因的重组质粒pCBHII-14。     

吸水链霉菌17997格尔德霉素部分生物合成基因簇的克隆和分析

吸水链霉菌17997(Streptomyceshy groscopicus17997)是我所从中国云南土壤中分离到的格尔德霉素(geldanamycin,GDM)产生菌,GDM具有良好的抗肿瘤和抗病毒活性,但其肝毒性和水溶性差的缺点限制了其在临床上的应用。为了实现对GDM结构的生物学改造,首先要获得GDM的生物合成基因。根据GDM后修饰基因——氨甲酰基转移酶基因(gdmN)的保守序列筛选S.hygroscopicus17997的柯斯质粒基因组文库,共获得6个阳性克隆,选择CT-4阳性柯斯质粒进行亚克隆和测序,又通过PCR延伸的方法获得了与CT4连锁的将近5kb的外源序列,共获得28.356kb的外源DNA序列,其中包含了13个可能阅读框架,通过同源比较证实该序列与S.hygroscopicusNRRL3602中的GDM生物合成基因有很高的同源性。为进一步研究GDM生物合成基因的功能,并通过组合生物学的方法改造GDM的结构奠定了基础。     

被孢霉cDNA文库的构建及△9脂肪酸脱饱和酶cDNA序列的筛选

为了克隆被孢霉不饱和脂肪酸生物合成途径的相关酶基因,构建了基于λgt10的被孢霉cDNA文库。cDNA文库库容量为2×10     

珠江口沉积物来源链霉菌SCSIO 40020中bafilomycins的鉴定及其生物合成基因簇的异源表达

【目的】从珠江口沉积物来源的菌株SCSIO40020中分离bafilomycins,并对其生物合成基因簇进行克隆和异源表达研究。【方法】通过分析菌株SCSIO 40020的16S rRNA基因序列并构建系统发育树以鉴定菌种,以柱层析法和制备色谱法对次级代谢产物进行分离纯化,借助波谱学手段完成单体化合物的结构鉴定,采用生物信息学分析定位bafilomycins的生物合成基因簇,通过筛选菌株SCSIO 40020基因组的细菌人工染色体文库和接合转移将bafilomycins生物合成基因簇导入3种链霉菌进行异源表达,利用高效液相色谱检测异源表达菌株的发酵产物。【结果】菌株SCSIO 40020被鉴定为链霉菌属菌株,从其发酵产物中分离鉴定了2个单体化合物bafilomycinsA1和D。克隆了链霉菌SCSIO40020中bafilomycins的生物合成基因簇并推导了其生物合成途径,在3种链霉菌中表达产生了bafilomycins。【结论】从珠江口环境中获得了一株产生bafilomycins的链霉菌SCSIO 40020,成功建立了该菌株次级代谢产物生物合成基因簇的异源表达体系,并首次在链霉菌...