cGAS/STING信号通路参与猪圆环病毒2型诱导猪肺泡巨噬细胞产生Ⅰ型干扰素

为研究猪圆环病毒2型 (Porcine circovirus type 2,PCV2) 感染的猪肺泡巨噬细胞 (Porcine alveolar macrophages,PAMs) 分泌Ⅰ型干扰素信号通路,以PCV2病毒感染PAMs为研究对象,采用酶联免疫吸附测定 (Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、实时荧光定量PCR和Western blotting,分析PCV2感染对PAMsⅠ型干扰素的诱导、cGAS/STING信号通路相关基因mRNA和蛋白表达的影响,并应用靶向cGAS和STING特异性siRNA、抑制剂BX795和BAY 11-7082,解析cGAS、STING、TBK1和NF-κB/P65在PAMs生成Ⅰ型干扰素中的作用。结果显示,PAMs感染PCV2病毒48 h后Ⅰ型干扰素的表达量显著升高 (P＜0.05),cGAS mRNA的表达量在感染48 h和72 h后显著升高 (P＜0.01),STING mRNA表达量在PCV2感染72 h后显著上升 (P＜0.01),TBK1 mRNA、IRF3 mRNA感染48 h后显著升高 (P＜0.01)。PCV2能够显著升高PAMs胞浆STING、TBK1和IRF3蛋白含量,降低胞浆NF-κB/p65的含量,促进NF-κB/p65和IRF3入核。敲低PAMs中cGAS或STING表达水平后,PCV2感染PAMs 48 h后,Ⅰ型干扰素的表达水平显著下降 (P＜0.01);BAX795抑制TBK1后,PCV2感染PAMs 48 hⅠ型干扰素的表达水平显著下降 (P＜0.01),BAY 11-7082 抑制NF-κB/P65表达后,PCV2感染PAMs 48 h I型干扰素的表达量与PCV2组相比无显著性差异 (P＞0.05)。结果表明,PAMs感染PCV2后通过cGAS/STING/TBK1/IRF3信号通路诱导Ⅰ型干扰素分泌。     

塞内卡病毒通过激活自噬降解FBXW7拮抗宿主的抗病毒应答

【背景】塞内卡病毒(seneca valley virus, SVV)可引起猪严重的水疱性疾病,但目前仍无商业化疫苗,解析其与宿主抗病毒分子的相互作用具有重要意义。【目的】探究E3泛素连接酶(F-box and WD repeat domain containing 7, FBXW7)在抗SVV感染中的作用及其机制。【方法】利用小干扰技术敲低PK-15细胞FBXW7,结合RT-qPCR、组织半数感染量(tissue culture infective dose 50%,TCID50)和Western blotting分析FBXW7对SVV在PK-15细胞中复制及细胞因子的影响。【结果】Western blotting结果显示,SVV感染能够抑制PK-15细胞中FBXW7蛋白表达水平;敲低FBXW7后促进SVV复制,同时炎性细胞因子IL-6、IFN-β、TNF-αmRNA水平均显著降低;进一步研究显示,敲低ATG5抑制自噬后抑制FBXW7蛋白降解,SVV复制水平下降。【结论】本研究发现FBXW7对SVV复制具有抑制作用,SVV通过激活自噬介导FBXW7降解,为研发抗病毒靶点提供了新策略。     

猪瘟病毒C株共感染口蹄疫病毒影响口蹄疫病毒复制

【背景】猪瘟(Classical Swine Fever)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的猪高度接触性传染病,致死率极高。在临床中存在着CSFV与猪其他病原菌共感染的情况,例如CSFV与口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)的共感染。【目的】利用CSFV与FMDV共感染猪源宿主细胞,研究CSFV与FMDV共感染对FMDV病毒复制的影响。【方法】构建体外共感染细胞模型,在正常PK-15细胞上进行CSFV共感染FMDV实验,通过观察细胞病变效应(Cytopathic Effect,CPE)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、Western Blot、间接免疫荧光检测CSFV和FMDV共感染及FMDV单独感染情况下FMDV复制水平的差异。利用RT-qPCR筛选鉴定能够影响FMDV复制的CSFV蛋白。【结果】CSFVC株共感染FMDV能够抑制FMDV的复制,而且灭活的CSFV同样抑制FMDV的复制。通过筛选鉴定出CSFV的C蛋白能够抑制FMDV复制。【结论】研究发现CSFV C株共感染FMDV能够抑制FMDV复制,而其C蛋白具有抑制FMDV复制的能力。     

MOI对PK-15细胞感染PPV后细胞因子mRNA转录时相的影响

【目的】更好地了解感染复数(MOI)对猪细小病毒(PPV)感染PK-15细胞后引起细胞因子的反应,探讨宿主-病毒之间的作用关系。【方法】运用荧光定量PCR技术,测定和分析3种感染复数对PPV感染PK-15细胞引起的病毒DNA量的变化和细胞因子IFN-、IRF-3、TNF-a和IL-18分泌水平。【结果】PPV感染PK-15细胞12 h病毒开始大量迅速增殖,感染48 h且MOI为1.0时达到最高峰;PPV感染后可引起PK-15细胞中IFN-、IRF-3、TNF-a和IL-18的表达量显著增加,其中IRF-3基因在感染后1 h且MOI为10.0时表达量达到967倍。【结论】细胞因子的分泌水平显著依赖感染复数和感染时间的交互作用。     

A型塞内卡病毒的病毒样颗粒的制备及其免疫原性分析

为了研制A型塞内卡病毒 (Senecavirus A,SVA) 的病毒样颗粒 (Virus-like particles,VLPs) 疫苗,以SVA田间流行毒株CH-FJ-2017结构蛋白基因序列为研究对象,构建了能够同时表达SVA的3种结构蛋白VP0、VP1和VP3的单个原核重组表达质粒pET28a-SVA-VP031。通过大肠杆菌Escherichia coli表达、亲和层析纯化和体外自组装,获得SVA VLPs。透射电子显微镜鉴定显示,SVA的3种结构蛋白在体外能够自组装成直径约25–30 nm的VLPs,并且动物免疫试验结果表明,该VLPs能够有效刺激豚鼠产生高水平的抗原特异性中和抗体。上述研究结果为SVA VLPs疫苗的研制奠定了基础。     

柯萨奇病毒B组5型非结构蛋白抑制NF-κB信号通路的作用机制研究

目的 柯萨奇病毒B组5型（CVB5）是手足口病的重要病原体之一,可导致发热、皮疹或疱疹等临床症状,重症者出现神经系统疾病,甚至死亡。天然免疫应答是机体抗病毒入侵的第一道防线,其中核因子κB (NF-κB)是宿主天然免疫反应中的重要蛋白质,然而关于CVB5感染后调控NF-κB介导信号通路的研究尚鲜有报道。方法 本研究通过检测启动子活性、促炎因子水平以及通路中关键蛋白表达等,阐明CVB5对NF-κB信号通路的调控作用机制。结果 CVB5感染可抑制促炎因子表达和p65的磷酸化。CVB5非结构蛋白（NSP）可抑制促炎因子表达以及重要蛋白p65和IκBα的磷酸化。经STRING11.1数据库预测表明,CVB5 3CD蛋白与宿主多聚胞嘧啶结合蛋白1 (PCBP1)具有相互作用,且PCBP1可促进IκBα和p65的磷酸化,抑制病毒复制。结论 CVB5 NSP可负调控NF-κB信号通路,且与3CD相互作用的PCBP1蛋白可通过调控NF-κB通路抑制CVB5复制。本研究探索病毒与宿主天然免疫应答的调控作用,从而为研制抗CVB5感染的药物提供作用靶点。     

塞内卡病毒A结构蛋白VP2诱导PK-15细胞自噬的研究

本研究在塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)诱导自噬的基础上,着重探究VP2蛋白在细胞自噬过程中的作用。构建VP2基因真核表达载体pcDNA3.1-VP2,将其转染至PK-15细胞,通过检测自噬蛋白和相关基因的表达情况,明确VP2蛋白对细胞自噬的影响。结果显示,本研究成功构建了pcDNA3.1-VP2真核表达载体,且SVA VP2基因在PK-15细胞中正常表达;与对照组相比,VP2蛋白显著上调LC3蛋白的表达水平（P<0.01）;同时,自噬基因LC3、Beclin-1和ATG5转录水平均显著提高（P<0.01）。综上所述,本研究证实SVA VP2蛋白可诱导PK-15细胞自噬,且VP2蛋白与自噬蛋白和基因表达水平呈正相关,为进一步研究病毒感染与致病机制打下基础。     

口蹄疫病毒结构蛋白VP0抑制Ⅰ型干扰素信号通路的激活

【目的】研究口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP0对Ⅰ型干扰素信号通路的影响。【方法】通过反转录PCR构建VP0真核表达载体,利用Western blotting验证VP0蛋白转染HEK-293T细胞后的表达情况;Real-time PCR检测VP0蛋白对FMDV在BHK细胞上复制的影响,检测VP0蛋白对SeV诱导的干扰素信号通路分子RIG-I、IRF3、IFN-β及下游刺激基因ISG15、ISG20表达的影响;双荧光素酶报告基因检测系统检测VP0蛋白对SeV诱导的IFN-β和NF-κB启动子激活以及对RIG-I样受体(RIG-I-like receptors,RLRs)信号通路分子激活IFN启动子的影响;免疫共沉淀检测VP0蛋白与RLRs信号通路中关键分子的相互作用。【结果】成功构建了p CAGGs-VP0真核表达载体,可以在HEK-293T细胞中表达;FMDV感染后的4–6 h,VP0蛋白显著促进FMDV在BHK细胞上的复制(P0.01或P0.05);VP0蛋白明显抑制干扰素下游刺激基因的表达(P0.01或P0.05)。在双荧光素酶报告基因检测实验中,VP0蛋白抑制SeV诱导IFN-β和NF-κB的活化具有剂量依赖性(P0.01),并对RIG-I、MDA5、VISA、TBK1和IRF3介导的IFN-β产生具有抑制作用,但是对IRF7没有明显的影响。免疫共沉淀显示VP0蛋白可与IRF3发生相互作用。【结论】证实VP0蛋白可以通过与IRF3相互作用来抑制Ⅰ型干扰素信号通路的激活。     

MicroRNA-98促进猪圆环病毒2型在3D4/21细胞中的复制

【目的】通过高通量测序的方法获得PCV2感染3D4/21细胞的miRNAs表达谱,并探讨miRNA-98在PCV2复制中的作用。【方法】本研究以猪肺泡巨噬细胞系3D4/21细胞为细胞模型,对PCV2感染过程中的3D4/21细胞进行miRNAs差异表达分析,筛选与病毒复制相关的特异性miRNAs,并探讨其在PCV2复制中的作用。【结果】经高通量测序,获得PCV2感染3D4/21细胞的miRNAs表达谱,结合实验室前期研究筛选获得miRNA-98。实验表明,miRNA-98的表达量随PCV2感染时间的延长而持续升高,其变化趋势与Cap蛋白表达变化基本一致,由此推测miRNA-98与PCV2复制正相关。过表达miRNA-98可显著上调Cap蛋白的表达量和PCV2的复制。进一步的研究表明,miRNA-98参与调节宿主免疫相关细胞因子的表达和PCV2的复制。【结论】miRNA-98可通过调节免疫相关细胞因子的表达调控宿主免疫功能,帮助PCV2逃逸宿主免疫,促进PCV2在3D4/21细胞中的复制。这些发现不仅为深入了解PCV2与宿主之间的关系提供了新视角,还有望为猪圆环病毒相关疾病的防控提供新的抗病毒策略。     

猪塞内卡病毒A型间接ELISA抗体检测方法的建立

为了建立一种基于固相合成多肽技术的猪塞内卡病毒A型抗体血清学检测方法。本研究对猪塞内卡病毒A型VP1、VP2和VP3三种重要结构蛋白的B细胞表位进行设计并筛选到SVA1601、SVA1602、SVA1603和SVA1605共四条表位多肽,进而建立了一种用于检测猪塞内卡病毒A型抗体的间接ELISA方法,并验证该方法的检测敏感性、特异性、重复性以及与血清中和试验的符合率。试验结果显示,建立的间接ELISA方法对6份感染血清的最高稀释倍数为1:640,特异性为99.1%,批内和批间变异系数分别为2.4%～6.5%和4.4%～10.3%。与血清中和试验比较,符合率为97.7%。结果显示采用SVA1601、SVA1602、SVA1603和SVA1605建立的间接ELISA方法的敏感性较高,且重复性较好,可用于临床血清中猪塞内卡病毒A型特异性抗体的检测。     

幽门螺杆菌感染激活NF-κB信号通路促进胃癌SGC-7901细胞炎症因子释放

为了探讨幽门螺杆菌对胃癌SGC-7901细胞炎症因子释放的影响,本研究将幽门螺杆菌感染SGC-7901细胞后,采用细胞计数盒(CCK-8)检测SGC-7901细胞活力,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测炎症因子TNF-α、IL-1β以及IL-8的水平,Real-time PCR检测细胞TNF-α、IL-1β以及IL-8 m RNA的表达,蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测NF-κB信号通路相关蛋白NF-κB p65蛋白表达以及IκBα磷酸化水平。研究结果表明,幽门螺杆菌感染后,SGC-7901细胞活力显著增加;幽门螺杆菌感染明显上调SGC-7901细胞TNF-α、IL-1β以及IL-8 mRNA的表达;本研究还进一步发现幽门螺杆菌感染显著增加SGC-7901细胞TNF-α、IL-1β以及IL-8的水平;此外,幽门螺杆菌处理的SGC-7901细胞,其NF-κB p65的蛋白表达以及IκBα磷酸化水平均显著上调。本研究的结论初步表明,幽门螺杆菌感染促进胃癌SGC-7901细胞炎症因子的释放,其机制可能涉及激活NF-κB信号通路。     

水泡性口炎病毒对IPEC-J2细胞因子转录时相的影响

摘要：【目的】为了更好的了解水泡性口炎病毒（VSV）感染后引起细胞炎性反应特别是炎性细胞因子的反应,探讨宿主-病毒之间的作用关系。【方法】我们运用荧光定量PCR技术,测定和分析VSV感染IPEC-J2细胞引起的病毒RNA量的变化和细胞因子IL-2、6、8、10、12、IFN-α、 IFN -γ、TNF-α、TGF-β和TLR3分泌水平。【结果】我们发现,VSV感染后引起IPEC-J2细胞分泌IL-6、8、12、TNF-α和TLR3显著增加,TGF-β无显著差异;IPEC-J2细胞不分泌IL-2、IL-10、IFN-α和IFN –γ。【结论】水泡性口炎病毒感染可引起IPEC-J2细胞炎性分子分泌增加。     

STING在宿主天然免疫信号通路中的调节作用

STING(stimulator of interferon genes)是天然免疫信号通路中一种新发现的蛋白质,在防御病毒及胞内细菌感染、介导Ⅰ型IFN产生过程中发挥重要功能.来自病原体的B型DNA与5′-3p dsRNA暴露在宿主细胞中后被相应的模式识别受体识别,通过不同的通路传递信号给STING.STING随后通过相似的机制招募TBK1激活IRF3,诱导干扰素表达.对细菌中的环二核苷酸c-di-GMP和c-di-AMP,STING则可以直接作为模式识别受体引发Ⅰ型干扰素反应.此外STING还能激活STAT6诱导特异趋化因子产生,吸引各种免疫细胞抵抗病毒感染.本文通过对STING的发现、结构、定位、功能、机理以及调节机制进行综述,以期为揭示病毒逃逸天然免疫调节机制和抗病毒新型免疫调节剂提供新的思路.     

猪塞内卡病毒病原学研究进展

2014年以来,巴西、美国、中国、泰国等多个国家相继暴发了塞内卡病毒（Senecavirus A,SVA）疫情,且流行范围呈扩大趋势,SVA逐渐成为研究和关注的热点。本文主要从SVA病毒蛋白结构功能、入侵机制、适应性免疫反应及免疫逃逸等方面对SVA相关病原学研究进行综述,以期为进一步开展猪SVA的致病机制研究以及疫苗研发提供帮助。     

中华蜜蜂NPC1蛋白AcNPC1的原核表达、多克隆抗体制备及功能鉴定

【目的】人类C型尼曼匹克病(Niemann-Pick disease type C, NPC)主要是由NPC1基因突变引起的一类遗传疾病。NPC1蛋白主要负责胞内胆固醇运输,同时也作为病毒侵染宿主细胞的重要受体之一近年来备受关注。本研究旨在探究NPC1蛋白与中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus, CSBV)感染的关系。【方法】通过PCR扩增中华蜜蜂Apis cerana cerana AcNPC1基因;将其克隆至pET-30a原核表达载体,转化至大肠杆菌Escherichia coli Rosetta^TM(DE3)进行IPTG诱导表达,采用镍柱纯化重组蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体。设计并合成AcNPC1 siRNA,添食中华蜜蜂幼虫;运用RT-qPCR检测和分析中华蜜蜂CSBV添毒幼虫中AcNPC1的表达量,以及RNAi干扰后不同时间AcNPC1基因和CSBV病毒衣壳蛋白VP1基因在感染CSBV的中华蜜蜂幼虫中的表达水平。【结果】成功构建重组表达质粒pET-30a-AcNPC1,在大肠杆菌中获得高效表达的重组蛋白,目的蛋白大小约为36...     

嗜酸乳杆菌NCFM对Caco-2细胞中PTX3基因表达的影响

【目的】研究嗜酸乳杆菌NCFM对肠道上皮细胞中免疫与炎症介质因子PTX3表达的影响,并进一步揭示其调节机制。【方法】嗜酸乳杆菌NCFM与Caco-2细胞共培养0、2、4、8和12 h,提取细胞RNA,采用RealTime RT-PCR方法检测PTX3基因的表达。嗜酸乳杆菌NCFM与Caco-2细胞共培养0、0.5、1、2和4 h,提取细胞蛋白质,采用Western blot方法检测NF-κB的磷酸化水平;用NF-κB的特异性抑制剂PDTC预处理Caco-2细胞30 min,然后加入嗜酸乳杆菌NCFM作用2 h,提取细胞RNA,采用Real Time RT-PCR方法检测PTX3基因的表达。【结果】嗜酸乳杆菌NCFM与Caco-2细胞共培养后能诱导PTX3的表达,并且在共培养4 h的时候PTX3的表达量达到最大,然后逐渐下降;嗜酸乳杆菌NCFM能快速的诱导NF-κB的磷酸化,并且在加入其特异性抑制剂PDTC后,PTX3的表达显著下降。【结论】嗜酸乳杆菌NCFM作用于肠道上皮细胞后能够通过迅速激活NF-κB途径暂时性的调控PTX3的表达。     

线粒体抗病毒蛋白对先天免疫的影响

病毒感染启动宿主先天免疫反应是通过激活转录因子NF-κB和干扰素调节因子3（IRF-3）,它们协同调控Ⅰ型干扰素的表达。病毒在复制过程中产生的复制中间体双链RNA作为一个病原相关分子模式,被细胞内具有RNA解旋酶活性的维甲酸诱导基因Ⅰ（RIG-1）编码蛋白检测到。线粒体抗病毒蛋白（MAVS）作为一个接头蛋白,在RIG-1信号通路的下游和NF-κB、IRF-3信号通路的上游扮演着重要的角色。MAVS通过其疏水跨膜结构域定位在线粒体外膜上,是线粒体中发现的第一个与先天免疫相关的蛋白质,将线粒体和先天免疫联系在一起。     

cGAS/STING通路的生物学功能及其在细菌感染中的作用北大核心

先天免疫是宿主抵御外来病原体入侵的第一道防线,而模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)是介导先天免疫应答关键分子。PRRs通过识别病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)来激活宿主先天免疫反应。二十一世纪先天免疫领域里程碑式发现-环磷酸鸟苷腺苷合成酶(cyclic GMP-AMP synthase,cGAS),cGAS在宿主先天免疫过程中发挥重要作用,通过识别外源DNA产生第二信使2’,3’-环化鸟苷酸腺苷酸(2’,3’-cyclic guanosine monophosphate adenosine monophosphate,2’,3’-cGAMP)来介导干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes,STING)的活化,从而促进下游干扰素(IFN)和其他细胞因子分泌来发挥宿主的抗病毒反应。近年研究发现,cGAS/STING通路在宿主抗细菌感染过程中发挥着重要作用,同时细菌也进化出不同机制来拮抗cGAS/STING通路。本文主要对cGAS/STING通路的生物学功能及其在细菌感染中的作用进行综述,为进一步研发新型抗菌药物提供理论参考。