沙门氏菌毒力岛及其Ⅲ型分泌系统

沙门氏菌含两个编码三型分泌系统的毒力岛(SPIs),每个毒力岛编码一个Ⅲ型分泌系统.SPI1与细菌的侵袭性有关,而SPI2与系统感染和沙门氏菌在真核细胞中的聚集有关.本文对SPI1和SPI2的分子结构、Ⅲ型分泌系统的功能、基因表达的调节及SPI1和SPI2的进化进行了综述.     

鼠伤寒沙门氏菌噬菌体型的相变异

经过反复检查1980～1993年间在新疆维吾尔自治区各地收集的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)菌株,发现了鼠伤寒沙门氏菌噬菌体型的相变异(phase variation)。在4774或4776噬菌体型(完全型)的培养物中,有一小部分可以发生变异,有的变为4000(第1相),有的变为0776或0774(第2相)。这种4000和0776(0774)噬菌体型培养物的多数,容易发生回复变异,变为原来的噬菌体型4774(或4776);有时,4000噬菌体型(第1相)可以变为0776(第2相),而0774噬菌体型(第2相)也可以变为4000(第1相)。在7776噬菌体型(完全型)的培养物中,也有一小部分可以变为7000(第1相)或0776(第2相)。7000(或7002)和0776噬菌体型培养物的多数容易发生回复变异,变为原来的噬菌体型7776(或7774)。从完全型培养物变为第1相或第2相的变异率为156%,从第1相或第2相培养物变为完全型的变异率为532%。这一现象的阐明,将有助于鼠伤寒沙门氏菌的噬菌体分型,和对鼠伤寒沙门氏菌感染的流行病学分析有重要意义。     

利用Red重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌VI型分泌系统相关基因

【背景】沙门氏菌是一种重要的人畜共患病原菌,可引起广泛的胃肠炎以及伤寒、副伤寒,其致病机制一直未被阐明。基因敲除技术在研究沙门氏菌致病性方面发挥了重要作用,然而目前的敲除技术仍存在费时、成功率低的问题。研究发现鼠伤寒沙门氏菌含有VI型分泌系统,其组成成分之一溶血素共调节蛋白(Hemolysin-coregulated protein,Hcp)可能在其致病过程中发挥了重要作用。【目的】拟通过对3个编码Hcp蛋白的基因进行敲除,在鼠伤寒沙门氏菌中建立一套方便快捷的重组系统,从而用于沙门氏菌致病性的研究。【方法】以pKD4为模板,扩增两端带有目的基因同源序列的卡那霉素抗性基因片段,将片段导入含重组酶系统的目的菌,重组后再导入质粒pCP20消除抗性基因片段,达到无痕敲除的效果。【结果】对3个单独的hcp基因及其组合进行了敲除,得到了所需的基因缺失株,并总结出了一些实验过程中可能遇到的问题的解决方案。【结论】Red重组系统可用于鼠伤寒沙门菌的基因敲除,通过优化同源片段的长度、PCR模板浓度、L-阿拉伯糖加入时间、实验过程中的温度等实验条件,提高Red重组系统在沙门氏菌中的重组效率。此方法简单、快速,重组效率高,值得推广。     

鼠伤寒沙门氏菌Ⅵ型分泌系统相关基因敲除及其功能特性

Ⅵ型分泌系统(T6SS)是大多数革兰氏阴性细菌中都存在的一种重要的分泌系统,能介导细菌与细菌之间以及细菌和宿主细胞之间的相互作用,溶血素共调节蛋白(Hcp)和缬氨酸甘氨酸重复蛋白G(VgrG)是组成T6SS穿刺装置的重要组分。但鼠伤寒沙门氏菌Ⅵ型分泌系统的Hcp与VgrG在该菌入侵宿主细胞及抗吞噬过程中发挥的作用尚不十分清楚。【目的】本研究旨在利用基因敲除技术构建的鼠伤寒沙门氏菌hcp及vgrg基因缺失株体外接种真核上皮细胞和巨噬细胞,并以其亲本株作为对照,以研究Hcp及VgrG在该菌粘附、侵入上皮细胞及抗吞噬过程中所发挥的作用。【方法】通过优化Red同源重组系统操作过程中各个条件,建立一套快速敲除鼠伤寒沙门氏菌Ⅵ型分泌系统相关基因的操作系统,成功构建鼠伤寒沙门氏菌CVCC541的hcp及vgrg单基因缺失株、双基因缺失株及三基因缺失株,并用Hela细胞接种试验和菌落计数试验,评估不同菌株的粘附和侵袭能力;用小鼠巨噬细胞RAW 264.7接种试验,评估不同菌株的抗吞噬能力。【结果】与亲本株CVCC541粘附侵袭Hela细胞相比,基因缺失株CVCC541Δvgrg、CVCC541Δhcp2Δvgrg和CVCC541Δhcp1Δhcp2Δhcp3的粘附率分别为17.17%±2.1%、14.73%±2.5%和82%±3.7%;CVCC541Δvgrg、CVCC541Δhcp2Δvgrg和CVCC541Δhcp1Δhcp2Δhcp3的侵袭率分别为7.05%±1.05%、6.21%±1.35%和87%±3.25%;与亲本株CVCC541在小鼠巨噬细胞RAW 264.7中的存活相比,基因缺失株CVCC541Δvgrg、CVCC541Δhcp2Δvgrg和CVCC541Δhcp1Δhcp2Δhcp3的存活率分别为15.67%±2.9%、14.47%±1.87%和56.12%±3.48%。【结论】鼠伤寒沙门氏菌Ⅵ型分泌系统VgrG和Hcp对该菌入侵细胞和抗吞噬方面具有重要作用,该研究为鼠伤寒沙门氏菌通过六型分泌系统与宿主细胞相互作用的机制研究奠定了基础。     

沙门氏茵毒力岛及其Ⅲ型分泌系统

沙门氏菌含两个编码三型分泌系统的毒力岛(SPIs),每个毒力岛编码一个Ⅲ型分泌系统。SPI1与细菌的侵袭性有关,而SPI2与系统感染和沙门氏菌在真核细胞中的聚集有关。本对SPIl和SPI2的分子结构、Ⅲ型分泌系统的功能、基因表达的调节及SPIl和SPI2的进化进行了综述。     

细菌Ⅲ型分泌系统

1 .细菌分泌机制概述致病细菌和宿主细胞相互作用的特点是将致病因子定位到细菌表面或分泌到胞外。虽然其分泌的细菌蛋白质数量和种类都很多且具有范围很广的作用 (包括蛋白质水解、溶血、细胞毒性、蛋白质的磷酸化和去磷酸化 ) ,但是只存在几种途径把这些蛋白质从细菌的细胞质运输到胞外。在革兰氏阴性细菌中已发现四种蛋白质分泌途径 ,称为Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ型分泌机制。另外 ,第五种大分子分泌途径和质粒的接合转移有关。根癌农杆菌Ｔ ＤＮＡ的转移 ,百日咳杆菌毒素的分泌 ,称之为Ｖ型分泌 ,这方面的研究很少[1] 。ＩＩ型和ＩＶ型是…     

细菌的Ⅲ型和Ⅳ型分泌系统

细菌拥有很多分泌系统,通过这些系统,许多分泌性蛋白和外露蛋白被输送到菌体细胞外,与宿主细胞发生相互作用而发挥其毒性。革兰阴性菌拥有5型蛋白分泌系统,其中Ⅲ型和Ⅳ型分泌系统与细菌的致病性密切相关,正日益受到各方学者的关注。本文对细菌Ⅲ型和Ⅳ型分泌系统的组成、结构和功能等进行概述。     

鼠伤寒沙门菌六型分泌系统效应蛋白Clpv对巨噬细胞极化的影响北大核心

【目的】探讨Ⅵ型分泌系统(typeⅥsecretion system,T6SS)效应蛋白Clpv在鼠伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium)致病过程中的功能。【方法】以鼠伤寒沙门菌SL1344基因组为模板克隆clpv基因,并比较与其他革兰氏阴性菌台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)、植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)、鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)、菠萝多源菌(Pantoea ananatis)、粘放线菌(Actinomyces viscosus)和大肠埃希菌(Escherichia coli)的同源性;将clpv基因克隆至pEGFP-N1载体构建重组质粒pEGFP-Clpv,利用Western blotting、实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,q-PCR)、荧光显微镜以及流式细胞术检测蛋白表达、定位及诱导小鼠巨噬细胞M1型和M2型极化水平。【结果】clpv基因全长为2637 bp,与台湾假单胞菌的同源性最高;Western blotting、qPCR和免疫荧光检测表明重组蛋白大小约120 kDa,在细胞中有明显绿色荧光并且主要定位于细胞膜;q-PCR和流式细胞术结果发现Clpv转染组巨噬细胞M1型极化显著增加(P<0.01),M2型巨噬细胞极化显著减少(P<0.01)。【结论】成功克隆表达鼠伤寒沙门菌T6SS效应蛋白Clpv,并明确其胞内表达定位以及对巨噬细胞极化的影响。     

Ⅲ型分泌系统抑制剂对铜绿假单胞菌PAO1毒性因子的影响

【目的】进一步研究Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,TTSS)抑制剂对条件致病菌Pseudomonas aeruginosa PAO1的TTSS相关蛋白、鞭毛和纤毛等主要毒性因子的影响,评估TTSS抑制剂的防治效果及潜在风险。【方法】构建TTSS效应蛋白合成基因exo Y和exo T转录报告质粒p AT-exo Y、p AT-exo T,并将其转入菌株PAO1中。菌株PAO1(p AT-exo Y)、PAO1(p AT-exo T)与TTSS抑制剂共同培养后,检测exo Y和exo T的表达。通过SDS-PAGE检测TTSS抑制剂对鞭毛结构蛋白Fli C的影响。将PAO1单菌落穿刺接种于含有TTSS抑制剂的1%琼脂糖平板,观察细菌纤毛介导的蹭行运动(Twitching motility)。【结果】转录报告实验结果表明4个TTSS抑制剂可显著抑制exo Y和exo T的转录;化合物TS52、TS53和TS94虽不影响胞内TTSS针状顶端结构蛋白Pcr V的产量,但可抑制Pcr V蛋白的胞外运输。化合物TS53可降低鞭毛结构蛋白Fli C的产生。另外,化合物TS52、TS53和TS88可降低菌株PAO1的蹭行运动能力,但TS94可提高菌株PAO1的这种运动能力。【结论】TTSS抑制剂除通过抑制TTSS表达外,还可能通过影响其它毒性因子如鞭毛的合成、IV型分泌系统介导的蹭行运动等方式影响菌株PAO1致病性。     

构建化学发光-绿色荧光稳定标记的鼠伤寒沙门氏菌

基因改造的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)作为弱毒疫苗活载体被广泛应用于多种病毒、细菌、寄生虫等的免疫研究和生产实践中,甚至在肿瘤治疗方面也有诸多研究。在科学研究中,可视化技术为研究提供十分方便的手段。在鼠伤寒沙门氏菌强毒株ATCC 14028s基因组上插入Lux operon和gfp基因,使其同时具有化学发光和绿色荧光的特征,而这种基因组的改变并未影响其生长和毒力;在荧光显微镜下可观察到其在食管癌细胞TE1和乳腺癌细胞MDA-MB-468的分布情况;用小动物活体成像系统可检测其在小鼠体内的分布情况。该菌株在细胞水平下的绿色荧光信号和在小鼠体内的化学发光信号搜集方便,信号明显,为今后进一步研究鼠伤寒沙门氏菌提供了良好的可视化手段。     

焦磷酸测序检测食品中鼠伤寒沙门氏菌

根据鼠伤寒沙门氏菌的特异序列,分别设计扩增引物和测序引物,建立焦磷酸测序检测鼠伤寒沙门氏菌的方法。针对鼠伤寒沙门氏菌设计特异性扩增引物,对目标片段进行PCR扩增,然后制备单链模板,并利用测序引物进行焦磷酸测序。测序结果表明,6株不同来源的鼠伤寒沙门氏菌均可以扩增出碱基序列为TACAACCGGA GTGCACATTA ATCCCGCAGC的基因片段,而30株阴性对照菌株均未得到扩增。进行BLAST比对表明,该序列与GenBank中鼠伤寒沙门氏菌的碱基序列100%匹配。焦磷酸测序法是一种快速、准确的检测方法,可用于食品中鼠伤寒沙门氏菌的快速检测。     

鼠伤寒沙门氏菌外膜蛋白诱发BALB／C小鼠免疫保护的研究

本文采用超声破碎ＴｒｉｔｏｎＸ—１００和超速离心技术提取了鼠伤寒杆菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ,ＳＴＭ）的外膜蛋白（Ｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｓ,ＯＭＰｓ）,并发现ＯＭＰｓ中脂多糖ＬＰＳ的含量约为５％,ＯＭＰｓ经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ显示１０余条蛋白带。对ＯＭＰｓ诱发ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠产生典型迟发型变态反应ＤＴＨ和ＩＬ—２的水平进行了检测。经腹腔免疫的小鼠用５００ＬＤ５０鼠伤寒杆菌（５０１１５）攻击,１００％可得到保护;用５００ＬＤ５０伤寒杆菌（Ｅ６８６）攻击,３３．３％可得到交叉保护。免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠的Ｔ淋巴细胞,经尾静脉注射给非免疫小鼠,可使后者得到８５．７％的被动免疫保护,上述结果说明ＯＭＰｓ能诱发ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠细胞免疫和保护性免疫,并提示成为分子疫苗的可能性。     

鼠伤寒沙门氏菌嘌呤生物合成调控研究

为研究16bp PUR box中8个完全保守的碱基中的2个碱基在与purR\++阻遏蛋白结合中的功能,对它们分别作了定点突变,使其分别从C,G突变为G,A。凝胶阻滞实验结果表明,含上述保守碱基突变的PUR box均不能与purR\++阻遏蛋白结合。证明这2个保守碱基对维持PUR box的功能是必须的,其中任一改变都导致PUR box功能的丧失。     

进境鸡腿肉中鼠伤寒沙门氏菌分离与鉴定

2002年沈阳某公司从美国进口鸡腿肉5200余t,依据GB6869-2000鲜、冻禽产品检验标准及国检动函(2000)428号“关于进一步加强进境内类检验检疫工作的通知”要求,进行微生物检测。从送检的样品中分离到1株强致病的鼠伤寒沙门氏菌,血清型为1,4,12:Ⅰ:1,2。药敏试验表明,该菌对多种药物具有较强的抗药性。     

鼠伤寒沙门氏菌嘌呤生物合成基因表达的调控研究：Ⅱ.O^c突变体的…

已有研究证明,编码阻遏蛋白的调节基因ｐｕｒＲ能调节嘌呤从头合成途径中除ｐｕｒＢ外所有结构基因的表达。但迄今还缺乏阻遏蛋白与这些基因的操作基因相结合的直接证据。本文报道以嘌呤结构基因ｐｕｒＤ和ｐｕｒＧ的ＭｕｄＪ插入物为出发株,在外加过量腺嘌呤核苷（２ｍｍｏｌ／Ｌ）的ＭａｃＣｏｎｋｅｙ平板上通过选择红色菌落分离Ｏ＾ｃ突变体的结果,从上述两株出发株分别获得了８株和９株独立的消阻遏突变体。共转导分析和顺反     

鼠伤寒沙门氏菌参与细菌竞争相关基因

[背景]细菌在环境中以复杂的微生物群落形式存在,细菌间的竞争是细菌生存的一种重要方式.鼠伤寒沙门氏菌是一种可引起胃肠道疾病的重要人畜共患病病原体,其在水源、食物或是宿主肠道等环境中均需与其他细菌进行相互作用以获得生存优势.[目的]通过转座子技术构建鼠伤寒沙门氏菌转座子插入突变体库,从中筛选鼠伤寒沙门氏菌与细菌竞争能力相...     

短双歧杆菌对鼠伤寒沙门氏菌的抑制

【背景】鼠伤寒沙门氏菌是主要的肠道病原菌之一,利用益生菌治疗肠道病原菌感染已成为一种新型、绿色的微生态疗法。【目的】研究筛选出的短双歧杆菌无细胞发酵上清液(Cell-free supernatant,CFS)对鼠伤寒沙门氏菌的体外抑制作用及机制。【方法】采用微量稀释法测定短双歧杆菌YH68 CFS对鼠伤寒沙门氏菌的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)和亚抑制浓度(Sub-inhibitory concentrations,SIC),并从鼠伤寒沙门氏菌的细胞形态、细胞膜通透性、膜完整性以及毒力基因表达的变化探讨YH68 CFS对鼠伤寒沙门氏菌的抑菌机理,同时检测YH68 CFS对鼠伤寒沙门氏菌粘附和侵袭肠上皮细胞HT29的影响。【结果】YH68 CFS (3×109 CFU/mL)对鼠伤寒沙门氏菌具有较好的抑制效果,抑菌圈直径为22.27±0.44 mm,最小抑菌浓度为250μL/mL,对鼠伤寒沙门氏菌的抑制机制是通过增加其细胞膜通透性破坏其完整性,形成难以修复的孔洞,最终达到抑菌的目的;亚抑制浓度为62.5μL/mL时YH68 CFS并不能影响鼠伤寒沙门氏菌的生长,但仍然能通过下调毒力基因表达的方式抑制其对肠上皮细胞的粘附和入侵。【结论】短双歧杆菌YH68对鼠伤寒沙门氏菌具有良好的抑菌作用,可作为治疗沙门氏菌感染的潜在益生菌。