MCF细胞中人干细胞因子基因新调控元件的鉴定

人干细胞因子（ｈｕｍａｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ,ｈＳＣＦ）是一个多功能细胞生长因子,调节某些哺乳动物干细胞如原始胚细胞的增殖、分化和移居。为研究ｈＳＣＦ基因的转录调控机理,对ｈＳＣＦ基因５’旁侧序列不同长度片段进行亚克隆,构建系列重组ｐＧＬ２荧光素酶报告基因载体,转染人乳腺癌细胞株ＭＣＦ并检测ｌｕｃ基因一过性表达活性。然后应用电泳迁移率变动分析技术,鉴定活性片段与ＭＣＦ细胞核抽提蛋白质     

重组人干细胞因子

选择大肠杆菌的偏性密码,合成了可溶形式的人干细胞因子的ＣＤＮＡ。通过ＰＣＲ完成了合成片段的一次性组装与克隆,并在Ｅ．ｃｏｌｉ中进行了温控型的高效表达,目的蛋白中菌体总蛋白的４０％左右。表达产物复性后,经离子交换,凝胶过滤层析,得到了电泳纯的ｒｈＳＣＦ。经测定,ｒｈＳＣＦ氨基端序更及其它理化性质一天然ｈＳＣＦ完全一致,并要刺激人骨髓细胞的增殖,导致粒、巨核系集落（ＣＦＵ－ＧＭ）大小、数量的明显增加,     

重组人干细胞因子在大肠杆菌中的表达及活性鉴定

采用ＰＣＲ方法从重组载体ｐＫＫＳＣＦ扩增出人干细胞因子（ＳＣＦ）基因ｃＤＮＡ片段,经亚克隆构建成表达载体ｐＥＴ１１ｄＳＣＦ,经限制性酶谱分析鉴定证实．继用ＩＰＴＧ诱导重组ｐＥＴ１１ｄＳＣＦ在大肠杆菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）中表达,经初步纯化获得重组人ＳＣＦ蛋白质,经检测具有生理活性,对脐带血ＣＦＵ－ＣＭ和ＨＰＰ－ＣＦＣ增殖有明显刺激作用,为进一步的生物工程研究奠定了基础．     

重组人干细胞因子的研究

利用基因工程的方法制备了高纯度的人干细胞因子,并对制备的重组人干细胞因子的结构和生物活性进行了研究。结果表明rhSCF在磷酸盐缓冲液中以非共价的二聚体形式存在,其精确分子量、质量肽谱、氨基酸组成及N端、C段序列等均与理论值一致,二硫键位置正确。rhSCF单用或与rhG-CSF合用,对猴外周血造血祖细胞有明显的动员作用。     

重组人干细胞因子

选择大肠杆菌的偏性密码,合成了可溶形式的人干细胞因子（ｈＳＣＦ）的ｃＤＮＡ。通过ＰＣＲ完成了合成片段的一次性组装与克隆,并在Ｅ．ｃｏｌｉ中进行了温控型的高效表达,目的蛋白可占菌体总蛋白的４０％左右。表达产物复性后,经离子交换、凝胶过滤层析,得到了电泳纯的ｒｈＳＣＦ。经测定,ｒｈＳＣＦ氨基端序列及其它理化性质与天然ｈＳＣＦ完全一致,并可刺激人骨髓细胞的增殖,导致粒、巨核系集落（ＣＦＵ－ＧＭ）大小、数量的明显增加,显示天然ｈＳＣＦ的生物活性。     

实时定量RT-PCR技术及在植物基因表达分析中的应用

近年来实时定量RT-PCR（real-time quantitative RT-PCR,qPCR）由于其具有敏感性,广阔的动力学范围,可靠性的特点,成为基因表达研究的标准方法。介绍了实时定量RT-PCR的原理和实验过程中的潜在问题,并且讨论了实时定量RT-PCR在植物基因表达研究中的应用。     

人干细胞因子基因5′旁侧序列的克隆和功能研究

人干细胞因子 ( human stem cell factor,h SCF)在多种哺乳动物干细胞的增殖、分化和移居中发挥重要作用 .利用改进的 PCR体系 ,从人类基因组 DNA中扩增出自 h SCF基因编码起始位点( 1 81 )至 5′旁侧 - 1 1 90位点共 1 372 bp的片段 ,将其克隆至 p GEM- T载体中 ,经序列分析证明无误 .为探寻此片段中对转录调控起作用的具体区域 ,用基因缺失技术从 - 1 62 ( Bst X )位点向上游分别延伸至 - 2 73( Pst )、- 339( Sma )、- 381 ( Sac )、- 44 0 ( Eco R )、- 570 ( H inc )、-853( Bgl )及 - 1 1 90 ( Xho )等位点 ,共获 7个不同长度的 h SCF基因 5′旁侧序列片段 ,随后将这7个片段分别克隆入荧光素酶 ( luc)报告基因载体 p GL2 - Promoter.经阳离子脂质体包埋技术介导转染 He La细胞 ,培养 48h后检测 Luc活性 .结果表明 :h SCF基因 5′旁侧 - 1 1 90～ - 853区域对luc表达有明显的增强作用 ,而 - 339～ - 2 73区域则显示有抑制作用 .分别以包含这两个区域的片段为探针进行竞争性凝胶阻滞实验 ,结果均出现一个或多个特异性滞留区带 ,说明这两个区域存在转录因子的结合位点 .实验结果表明 ,h SCF基因 5′旁侧 - 1 1 90～ - 853区域富含 AT,是一典型基质结合区 ,而 - 339～ - 2 73区域为一新的沉默子 ,在     

重组人干细胞因子的纯化

干细胞因子 (SCF)是一种重要的造血生长因子 ,它在自体造血干细胞动员、肿瘤放疗化疗的辅助治疗、贫血和其它血液病的治疗上具有良好的应用前景 .为建立一种实用的rhSCF制备工艺 ,从表达rhSCF的工程菌分离包涵体 ,用尿素变性 ,低浓度尿素溶液稀释复性 .复性液中的rhSCF经离子交换层析吸附、浓缩 ,凝胶排阻层析分离去除共价二聚体和疏水层析精纯化 ,获得纯化的rhSCF .纯化的rhSCF纯度大于 95 % ,回收率为 4 7% ,可促进人红白血病细胞TF - 1的生长 ,比活性为 0 .9× 10 6U mg ,与英国NIBSC的rhSCF标准品相似 .上述结果表明 ,所建立的制备高纯度rhSCF工艺高效简便 ,产物具有良好的生物活性     

人干细胞因子基因5′旁侧序列的克隆和功能研究

人干细胞因子 ( human stem cell factor,h SCF)在多种哺乳动物干细胞的增殖、分化和移居中发挥重要作用 .利用改进的 PCR体系 ,从人类基因组 DNA中扩增出自 h SCF基因编码起始位点( + 1 81 )至 5′旁侧 - 1 1 90位点共 1 372 bp的片段 ,将其克隆至 p GEM- T载体中 ,经序列分析证明无误 .为探寻此片段中对转录调控起作用的具体区域 ,用基因缺失技术从 - 1 62 ( Bst X )位点向上游分别延伸至 - 2 73( Pst )、- 339( Sma )、- 381 ( Sac )、- 44 0 ( Eco R )、- 570 ( H inc )、-853( Bgl )及 - 1 1 90 ( Xho )等位点 ,共获 7个不同长度的 h SCF基因 5′旁侧序列片段 ,随后将这7个片段分别克隆入荧光素酶 ( luc)报告基因载体 p GL2 - Promoter.经阳离子脂质体包埋技术介导转染 He La细胞 ,培养 48h后检测 Luc活性 .结果表明 :h SCF基因 5′旁侧 - 1 1 90～ - 853区域对luc表达有明显的增强作用 ,而 - 339～ - 2 73区域则显示有抑制作用 .分别以包含这两个区域的片段为探针进行竞争性凝胶阻滞实验 ,结果均出现一个或多个特异性滞留区带 ,说明这两个区域存在转录因子的结合位点 .实验结果表明 ,h SCF基因 5′旁侧 - 1 1 90～ - 853区域富含 AT,是一典型基质结合区 ,而 - 339～ - 2 73区域为一新的沉默子 ,在     

半定量RT-PCR检测运动发酵单胞菌中外源基因转录水平的研究

本研究运用半定量RT-PCR法检测运动发酵单胞菌重组菌中外源基因xylB的转录水平。提取野生型运动发酵单胞菌CP4及其2个重组菌的总RNA, 检测无DNA污染后定量至同一浓度、并反转录为cDNA。观测目的基因xylB和内标基因16S rRNA的PCR扩增曲线、并确定合适的循环数, 选用相同量的cDNA为模板, PCR检测各样本中xylB相对16S rRNA的转录水平。结果表明野生型菌株CP4中xylB基因没有转录, 而两株重组菌中皆有xylB的转录本, 且转录丰度基本一致, 酶活测定也进一步证实该基因在重组菌中有效表达。该方法可用于鉴定运动发酵单胞菌中特定基因的转录水平, 是一种快速有效的检测方法。     

干细胞因子逆转录病毒表达载体的构建及体外性质研究

目的通过逆转录病毒介导两种类型人干细胞因子在NIH3T3细胞中稳定表达,并研究它们对白血病细胞的作用。方法用DNA重组技术构建并鉴定可溶型及膜结合型干细胞因子的重组逆转录病毒表达载体MSCV—PGK—GFP—sSCF、MSCV—PGK—GFP—mSCF,与空载体对照MSCV—PGK—GFP分别转染Phoenix细胞包装病毒,并感染NIH3T3细胞,流式分选术获得3种阳性细胞,CCK8法分别检测与其共培养的K562细胞的增殖情况。结果成功构建了sSCF、mSCF逆转录病毒表达载体;经Phoenix包装的重组及对照逆转录病毒成功感染NIH3T3细胞,获得了稳定表达细胞株NIH3T3-S、NIH3T3-M和对照细胞株NIH3T3-V。共培养中NIH3T3-S、NIH3T3-M均可促进K562细胞的增殖,且在低血清条件下,NIH3T3-M的作用高于NIH3T3-S。结论可溶性及膜结合SCF分别通过旁分泌和并置性作用促进白血病细胞的增殖。     

人干细胞生长因子Ca2+依赖糖识别结构域缺失突变体的重组表达及生物学活性的初步探讨

本作已有的研究结果证明,完整的人干细胞生长因子(hSCGF)没有种属特异性,即可以作用于小鼠骨髓造血细胞。这一点与在Ca^2 依赖糖识别结构域(CRD)缺失了78个氨基酸残基的截短分子(hSCGFβ)有所不同。本研究从hSCGF全长cDNA中完全删除了CRD结构域编码序列,进一步探讨CRD结构域的生物学功能。由于该突变体序列GC含量较高．因此将该缺失突变体序列克隆在GST融合表达载体中进行融合表达。通过低温(28℃)诱导,表达产物主要以可溶蛋白的形式存在。利用亲和层析纯化CRD结构域完全缺失的hSCGF突变体融合蛋白,通过检测重组突变分子的协同刺激造血活性有无改变来初步探讨CRD结构域在hSCGF分子中的生物学功能。研究结果表明,去掉完整CRD结构域的突变分子仍然具有造血刺激活性。据此推断CRD结构域在hSCGF分子中可能对于受体配体结合起辅助作用。     

人SCF基因5′旁侧-1190～- 853 AT富集区功能研究

 已有的报告基因和EMSA实验研究表明 ,人干细胞生长因子 (SCF)基因 5′旁侧AT富集区- 1 1 90～ - 853在HeLa和MCF 7细胞中均能增强下游基因转录 ,可能为一个核基质结合区(MAR) ,对人SCF基因的转录发挥调控作用 .为进一步研究该AT富集区的功能 ,将人SCF基因 5′旁侧 - 1 1 90～ - 853AT富集区分别克隆入SV40或CMV启动子前后紧接着CAT报告基因 ,瞬时转染Jurkat,HepG2和 3T3细胞 ,检测CAT报告基因的瞬时表达活性 .结果表明 :人SCF基因 5′旁侧- 1 1 90～ - 853AT富集区在Jurkat和HepG2细胞中 ,对分别由SV40和CMV启动子引导的CAT基因表达均有抑制作用 ;但在 3T3细胞中对SV40启动子的转录活性表现出增强作用 ,对CMV启动子的转录活性无明显影响 .这些结果提示 ,人SCF基因 5′旁侧 - 1 1 90～ - 853AT富集区转录调控具有组织细胞特异性 ,在不同的细胞中可能发挥转录增强或抑制作用     

番木瓜果实扩展蛋白Cp-EXP1基因表达的荧光定量PCR分析

目的：对番木瓜果实扩展蛋白Cp-EXP1的基因进行荧光定量PCR分析,以便对其功能做进一步研究。方法：以不同成熟阶段的番木瓜果实总RNA为模板,设计引物进行荧光定量PCR。结果：Cp-EXP1基因在不同成熟阶段的番木瓜果实中的表达是有差异的,其表达水平受乙烯调控。结论：Cp-EXP1基因的表达与番木瓜的成熟软化密切相关,其表达分析为研究番木瓜的生长发育及其品种改良打下了良好的基础。     

人干细胞因子受体c-Kit稳定表达细胞株的构建

 干细胞因子 (SCF)是一种重要的造血因子 ,其受体c Kit具有酪氨酸激酶活性 .SCF c Kit介导的细胞内信号转导在造血、肥大细胞的生成及其功能、以及生殖细胞和黑色素细胞的发育中起着关键的作用 .通过构建人c kitcDNA的pcDNA3.1真核表达载体 ,转染不表达人c kit的小鼠髓系祖细胞FDC P1.经Zeocin抗性筛选 ,PCR、RT PCR、Western印迹分析、流式细胞仪分析等方法检测到人c kit基因的稳定整合和表达 ,并分布于细胞表面 ,证明获得了稳定表达人c Kit受体的细胞株 .用MTT法检测重组细胞株增殖特性 ,表明重组人SCF可刺激其增殖 .为进一步研究人c Kit受体介导的细胞内信号转导及检测重组人干细胞因子生物学活性提供了有效的细胞模型     

rhSCF在大肠埃希菌中的高效表达及纯化

干细胞因子（SCF）是一种重要的造血生长因子,它在自体造血干细胞动员、肿瘤放疗化疗的辅助治疗以及其它血液病的治疗上具有良好的应用前景。为了制备高纯度、活性的重组人SCF,将人工合成的SCF的cDNA序列,克隆入原核表达载体pET43．1a中,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,获得了高效表达菌株。SCF通过诱导表达形成包涵体,包涵体经洗涤、变性和初步纯化后,进行直接稀释复性,复性液经离子交换层析、分子筛层析等分离除去共价二聚体和异构体,获得纯度大于95％的重组人SCF样品,生物学比活性在7．0×10^5U／mg以上。结果表明：建立了有效的rhSCF制备工艺,且产物具有较高的纯度和生物学活性。