紫云英根瘤菌基因文库的构建及含完整结瘤基因的重组质粒pRaZ15的分离

以紫云英根瘤菌菌株7653R为材料,制备总DNA,经EcoRⅠ限制酶部分酶解,通过10—50％蔗糖梯度离心,分离到20一30 kb的DNA片段。利用能在革兰氏阴性菌中转移和复制的广谱寄主载体——pLAFRl质粒,构建了紫云英根瘤菌基因文库。通过与苜蓿根瘤菌102l菌株中8．7kb的共同结瘤基因(作探针DNA)杂交,从基因文库中分离到紫云英根瘤菌共同结瘤基因片段。以紫云英根瘤菌不结瘤突变株7653R+1(7653R消除共生质粒)为受体、构建的7653R基因文库(E．Coli C600)为供体,通过协助转移质粒pRK2013(LE392)进行三亲交配,在含四环素的根瘤菌台成培养基(sM)上选择接合转移子。将得到的所有接台转移子混合在一起接种植物,通过植物结瘤试验,分离到含紫云英根瘤菌结瘤基因的重组质粒pRaz15。将该质粒用EcoRⅠ完全酶切,得到25kb左右的外源DNA片段,该片段携带完整的结瘤基因簇。     

遗传饰变的微生物及其制备和使用方法(续)

3.菌株传递遗传信息的潜力 A.在允许条件下共接合受体能力: 嵌合质体的接合传递很可能是无性繁殖的DNA逸出和永久存活下去的有效措施,因此必须把它与X1776、其衍生菌和原始菌株进行五百多次的接合,以评价在各种不同条件下受体和给体的能力。要做这些实验,可采用22个不同的接合质体(代表15个不同的不相容性群)。     

Tn2促进基因缺失与R质粒接合转移有关的遗传学证据

通过R100-1的接合转移和非接合转移的温度选择两种方法分别获得了一系列mer::Tn2突变体。回复试验和杂交结果表明,通过接合转移分得的22株mer::Tn2突变体中有7株发生了长度不等的缺失;但通过非接合转移的温度选择法获得的17株mer::Tn2突变体中没有发现缺失株。这一结果进一步证明Tn2促进缺失形成与R因子的接合转移有关。     

弗氏痢疾杆菌和大肠杆菌多重抗药因子的接合转移和抗药因子的消除

病原菌多重抗药性的研究在医学上有重要意义。发生抗药性突变的频率一般比较低,而通过抗药因子接合转移获得抗药性的频率较高,而且常常是多重抗药因子同时转移。这种转移可在种间和属间进行。抗药性的遗传因子是由染色体外的质体携带的。我们用痢疾杆菌的抗药性菌株进行了多重抗药因子接合转移和抗药因子消除的试验,结     

大肠杆菌R质粒接合转移到霍乱弧菌

个别类型的大肠杆菌能同霍乱弧菌接合配对,使不耐药的霍乱弧菌同时获得对链霉素、庆大霉素、卡那霉素、土霉素、四环素、红霉素、台霉素、氯霉素、金霉素、新霉素等多种抗生素的耐药性。研究了影响接合率的各种因素。讨论了大肠杆菌肠毒素基因有可能同R质粒一起通过接合转移给霍乱弧菌,从而使无毒霍乱弧菌转变成有毒霍乱弧菌。     

江苏部分地区食源性和人源沙门氏菌的多重耐药性研究

从江苏省部分地区收集了117个沙门氏菌分离株,其中食物源和人源菌株分别有81株和36株。16种抗生素敏感性试验表明,有111个分离株对2种或2种以上的抗生素有耐药性,人源沙门氏菌分离株的抗生素耐药率比食物源的高,单一抗生素以链霉素耐药率(92.3%,108/117)最高。对5种或5种以上抗生素耐药的分离株有59株(50.4%),其中对特定六种抗生素:氨苄青霉素、氯霉素、链霉素、磺胺、四环素和卡那霉素耐药(ACSSuTK,R型)的菌株有12株。设计18对耐药基因和I类整合子保守区的引物,对36株有不同来源和耐药特征的多重耐药菌株进行耐药基因和I类整合子的检测,PCR扩增结果与抗生素敏感性表型一致。有30株细菌携带有I类整合子,大小为0.3、0.6、1.0、1.2和1.6kb,其中1.6kb(aadA5-dfr17)大小的整合子在25株细菌中分布(24/36)。接合试验表明,氨苄青霉素、氯霉素、链霉素、甲氧苄氨嘧啶和四环素的耐药特性是由接合性质粒携带。结果显示,耐药基因多数由I类整合子和质粒携带,可以通过接合试验发生转移,可移动的DNA成分可能在耐药特性的转移和分布中起到重要作用。     

嗜水气单胞菌若干毒力因子同时缺失的突变株的构建及特性分析

以携带质粒pAM12 0 (Tcr Tn916 )的大肠杆菌CG12 0株为供体菌 ,采用滤膜接合法与受体菌嗜水气单胞菌J_1株 (cfzr)进行接合转移 ,在含Tc和cfz选择平板上进行筛选。共获接合转移菌落 380 0个 ,其接合频率为 3× 10 - 5(按供体细胞计算 )。任取 38个接合子 ,提取基因组DNA ,以嗜水气单胞菌特异性 16SrDNA引物进行PCR扩增 ,所有接合子均阳性。为证明Tn916确实插入基因组 ,以四环素基因 (tet)引物进行PCR扩增 ,结果所有抗性接合子均扩增出一条特异条带。与亲本J_1株相比 ,所有接合子的主要毒力因子如蛋白酶、溶血素、DNA酶和淀粉酶等均不表达 ,对小鼠失去致病力 ,其LD50 大于 10 9CFU。接合子连传 10次后 ,四环素抗性消失 ,但毒力未恢复 ,说明通过转座子Tn916的插入可获得稳定的无毒嗜水气单胞菌突变株。Tn916引起嗜水气单胞菌毒力性状改变的机制有待研究 ,推测可能与该菌染色体上存在Tn916的热点或毒力岛有关。     

质粒R144drd3对于大肠杆菌DNA复制发动突变型dnaP18的非整合抑制

通过接合转移,把F1、F11、P、W、X、Ⅰ型的14种质粒分别引入大肠杆菌复制发动突变型dnaP 18,发现只有Ⅰ型质粒R144对于dnaP18具有抑制作用,消阻遏质粒R144 drd3的抑制能力高于质粒R144约一万倍而达到完全的抑制。以下事实说明R144 drd3并不通过整合到dnaP18细菌的染色体上而带来对于dnaP18的抑制:(1)dnaP18(R144drd3)细菌的染色体标记的转移频率在10~(-7)以下,而其质粒标记Km~R的转移频率约10~(-1);(2)这些菌株的DNA抽提物的电泳图谱和电子显微镜照相都说明质粒DNA的存在。 用带有质粒R144 drd3的E.coli作为供体,用E.coli dnaP18菌株作为受体,通过噬菌体P1转导得到的两种Km~R转导子中一种能在42℃形成菌落,而另一种则不能;将转座子Tn10转座到R144drd3上以后,同样使受体成为能在42℃形成菌落或不能形成菌落两类。这些结果表明,质粒R144drd3上存在着与dnaP18抑制有关的特定区域或基因。     

阿维链霉菌QL0827接合转移体系的建立

目的:建立工业生产菌株阿维链霉菌QL0827的接合转移体系。方法:优化接合转移条件,建立该菌株的接合转移体系;应用优化后的接合转移体系,将基因中断质粒导入该菌,定向敲除基因组上的序列;再将携带基因组上特定序列的整合型质粒和复制型质粒导入该菌体,建立该菌株的基因过表达体系。结果:相比标准的接合转移方法,优化后接合转移效率提高了近150倍,达到2.45×10-6;并成功地将pks3基因簇的部分序列删除。结论:建立了阿维链霉菌QL0827的接合转移体系。     

黑暗链霉菌DNA转移系统的建立

研究了黑暗链霉菌的基因转移系统,探索了通过PEG介导的原生质体转化、接合转移向黑暗链霉菌中转入外源DNA的可能性。多次尝试用质粒pIJ702转化黑暗链霉菌9904原生质体均未成功。对原生质体进行“热处理”后转化、利用单链DNA转化等都不能将质粒导入黑暗链霉菌中,表明黑暗链霉菌对外源DNA有很强的限制修饰作用。利用接合转移将具有oriT的大肠杆菌链霉菌穿梭质粒pHZ132转入大肠杆菌ET12567(pUZ8002)中,获得供体菌ET12567(pUZ8002,pHZ132)。将供体菌与预萌发的黑暗链霉菌9904的孢子进行接合转移,成功地将pHZ132转入黑暗链霉菌9904中。质粒pHZ132经黑暗链霉菌自身修饰后也可转入黑暗链霉菌9904菌株的原生质体中,转化率约为103/μg DNA(pHZ132)。     

转座子Tn916对固氮螺菌Azospirillum brasilense的接合诱变及氨分 …

以携带质粒ｐＡＭ１２０（Ａｐ＾ｒ,Ｔｃ＾ｒ／Ｔｎ９１６）的大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧ１２０）为供体菌株,与受体菌巴西固氮螺菌采用膜接合法进行接合转移,在选择平板上得到具较高频率的接合子（１０＾－５／每个供体菌,选择四环素抗性）。从８４６株四环素抗性接合子中进一步用奈氏法筛选得到氨分泌突变株３株。在无氮培养基上,其氨分泌量可达７．５￣１４．０ｍｍｏｌ／Ｌ。用乙炔还原法分析氨分泌突变株在不同浓度氮源     

变铅青链霉菌内源线性质粒接合转移必需功能区的鉴定

通常细菌间环型质粒在接合转移过程中,单链质粒DNA在质粒内部“oriT”接合转移起始位点发生缺刻.随后,打开的单链质粒DNA通过细胞膜的Ⅳ型分泌系统转移到受体菌中.但是,链霉菌中的接合型线型质粒带有游离3′端,5′端与末端蛋白结合,因而不能以细胞-细胞间方式转移单链缺刻DNA.报道了变铅青链霉菌线型质粒SLP2衍生的环型质粒,与SLP2一样可以高频高效接合转移,并鉴定了接合转移功能区.质粒有效的接合转移功能区包含6个共转录的基因,分别编码一个Tra样的DNA转移酶、胞壁水解酶、2个膜蛋白(可以与ATP结合蛋白相互作用)和一个功能未知的蛋白质.从SalⅠR-/M-向SalⅠR/M宿主转移的质粒频率下降表明,线型和环型的质粒都是以双链的形式转移的.上述研究结果表明SLP2衍生的线型质粒和环型质粒以相似的与细胞膜/胞壁功能相关的机理进行接合转移.     

子囊霉素产生菌吸水链霉菌FIM260840基因转移系统的建立

目的:建立子囊霉素产生菌吸水链霉菌FIM260840的接合基因转移体系,以便基因敲除和外源基因表达等遗传操作。方法:以整合型质粒p SET152为出发质粒,通过接合转移构建并子囊霉素产生菌FIM260840的基因转移系统。结果:12.5μg/m L安普霉素可有效筛选接合子。经PCR验证,质粒成功整合到菌株FIM260840基因组DNA中,所获接合子的安普霉素抗性高达400μg/m L以上。接合子经多次传代后,导入的质粒p SET152仍稳定整合于接合子基因组DNA上。结论:建立了高效、简便的吸水链霉菌FIM260840的基因转移系统,为该菌的生物合成基因改造奠定了基础。     

转座子Tn916对固氮螺菌Azospirillum brasilense的接合诱变及氨分泌菌株的筛选

以携带质粒pAM120(Ap~r,Tc~r/Tn916)的大肠杆菌(E.coli CG120)为供体菌株,与受体菌巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)采用滤膜接合法进行接合转移,在选择平板上得到具较高频率的接合子(10~(-5)/每个供体菌,选择四环素抗性)。从846株四环素抗性接合子中进一步用奈氏法筛选得到氨分泌突变株3株。在无氮培养基上,其氨分泌量可达7.5～14.0mmol/L。用乙炔还原法分析氨分泌突变株在不同浓度氮源上的固氮活力,发现20mmol/L NH Cl的存在不抑制其固氮活性,固氮活力与无氮条件下野生株的活力相差不多。无选择压力下细胞分裂50代后的稳定性实验证明,转座子Tn916在氨分泌突变株中的稳定性在50％～80％之间。以固氮螺菌氨分泌突变株为供体菌株,对E.coli HBX1进行反向接合转移实验,证实Tn916确实存在于氨分泌固氮螺菌接合子中。     

浑球红细菌Rhodobacter sphaeroides吸氨酶(hup)基因簇的分离与鉴定

以Rhodobactercapsulatus的hopS’L基因DNA片段为探针,通过Southem杂交,从构建的Rhodobactersphaeroides601基因库中调取hup基因。阳性克隆Cosmid1可与Hup突变株JP91（HupS－）、RCC8（HupR-）以及BSE8（HupT-）互补,而Cosmid3和Cosmid9只能与BSE8互补;试验所产生的接合转移子均恢复了吸氢酶的活性和自养生长能力、将Cosmidl的3．5kbPstⅠ和4．5kbBamHⅠ片段分别亚克隆到pWY11和pWY10中。pWY11和pWY10的部分DNA序列与R．capsulatus中的相关基因具有很高的同源性,从而证明了所得到的Cosmid1确实含有R．sphaeroides的基因簇。     

慢生型大豆根瘤菌的结瘤基因转入快生型大豆根瘤菌中

通过三亲本杂交把慢生型大豆根瘤菌USDAllO的基因文库转移至Tn5诱变的不结瘤的快生型大豆根瘤菌321,338中,用链霉素和四环素平板选择大量接合子,接种大豆,通过结瘤基因功能互补,获得7个根瘤,从中分离出的每个菌株都仍具有链霉素和四环素抗性。分离其质粒,发现每个菌株都多了一条较载体质粒pLAFRl分子量大的质粒。将这些质粒转移至大肠杆菌HBl01中,分离其质粒,用32P标记的ncd探针进行DNA—DNA分子杂交,除载体质粒pLAFRl为阴性反应外,其他重组质粒均为阳性反应,即所获得pLAFRl克隆的DNA片段上确有nod结构基因。回收重组质粒pLAFRl：：nod,用限制性内切酶EcoR I进行酶切,从其琼脂糖凝胶电泳图上估计pLAFRl上克隆的DNA片段分子量为32kb。     

根癌土壤杆菌接合转移和生物型特性的遗传学研究

用转座子Tn5-Mob和辅助诱动转移质粒R 68.45将根癌土壤杆菌(Agrobacterium tu-mefaciens)生物型(giotype)II和III接合转移到具三重缺陷的生物型I的菌株中,获得了七组转移接合子。通过对其中六组转移接合子生物型分类的主要生理生化特性(3-酮基乳糖反应、石蕊牛奶反应、赤藓糖醇产酸、乙醇产酸、松三糖产酸、粘酸产碱及在New和Keer的选择性生长培养基上能否生长等)测试,发现这些性状通过接合转移而被转移到受体菌中。     

庆丰链霉菌SQP1质粒的种间转移和表达

庆丰链霉菌A201菌株的SQP1质粒可以通过混合培养接合转移到井冈链霉菌VA4菌株的细胞中,转移频率为2—8％。接合子p菌株的形态特征和亲株VA4相似,但却获得了产生抑制细菌的抗生素的能力,这种抑制细菌的能力在遗传上是稳定的。高温预培养能使接合子P2菌株抑细菌活性受到消除,消除频率达10％以上。鉴定P2接合子的发酵产物证明包含二个抗菌物质,一个是它本来的产物井冈霉素,另一个是新获得的抑制细菌物质庆丰霉素,后者的产生是由于SQP1进入新寄主细胞的结果。     

体外建成带有λ噬菌体DNA片段的重组质体

将大肠杆菌抗四环素及抗氨苄青霉素的质体pBR322的DNA、大肠杆菌λ噬菌体DNA在体外经限制性核酸内切酶Hin d Ⅲ切割,并用T4DNA连接酶连接后,以大肠杆菌K 12 HB 101(recA~- r_k~- m_k~-)为受体进行转化,采用插入钝化(insertional inactivation)方法选择重组质体。利用环丝氨酸浓缩Ap~rT_c~3转化体。在648株Ap~r转化体中选出120个无性繁殖系为Ap~rT_c~3。随机挑出3株含有重组质体的无性繁殖系进行大肠杆菌素     

细菌抗药质粒中抗性基因的转座作用

ER275、ER396(Tc~r、Ap~r、Cm~r、Sm~r、Su~r)与DR233、DR416(Tc~r、Cm~r、Sm~r、Su~r)是来自临床的抗药质粒。当带有这些质粒的菌株分别与大肠杆菌J5-3/R144drd3(Km~r)配对时,组成了两种质粒共存的菌株。用这种质粒共存的菌株作为接合转移的给体,并以Ap或Sm作为选择药物,得到ApKm或SmSuKm抗性类型的转移接合子,此种转移接合子能将ApKm或SmSuKm抗性作为一个单位连锁地转移到受体菌株,而且转移频率与R144drd3相似。 生化的研究表明,ER275、ER396质粒中的Ap抗性基因编码β-内酰胺酶,DR233与DR416质粒中的Sm抗性基因编码链霉素钝化酶,而带有Ap Km或Sm Su Km重组质粒的转移接合子也分别具有了合成这二种酶的能力。因此我们推测在ER275、ER396与DR233、DR416质粒中分别有可转座的Ap抗性基因与可转座的SmSu抗性基因存在。