Über den histochemischen und mikrochemischen Nachweis der β-Galactosidase mit 1-Naphthyl-β-galactopyranosid

Zusammenfassung Es wird ein simultanes Azokupplungsverfahren zur intrazellulären Darstellung der sauren (Hetero-) und neutralen -Galactosidase (Lactase) in verschiedenen Organen von Ratte, Maus und Meerschweinchen beschrieben.Das Inkubationsmedium enthält 4,5–9mg 1-Naphthyl--galactopyranosid (gelöst in 0,4ml NN-Dimethylformamid) und 0,5–0,8ml 2% Hexazonium-p-rosanilin in 9 ml 0,1 M Citrat-Puffer, pH 5 (Hetero--galactosidase) oder 5,5 (Lactase).Unter allen Organen reagiert die saure -Galactosidase am kräftigsten in den Lysosomen von Nebenhoden, Niere, Nebenniere, Schilddrüse, Glandula präputialis und inguinalis, Milz, Colon und Plexus chorioideus; die neutrale -Galactosidase kommt in mittlerer Aktivität nur im intestinalen Stäbchensaum vor.Die intralysosomale Darstellung der löslichen Hetero--galactosidase erfordert Blockfixation in Glutaraldehyd; die Lactase kann an frischen oder gefriergetrockneten Schnitten untersucht werden. Im proximalen Tubulus der Rattenniere wird die saure -Galactosidase durch Formol unabhängig von der Konzentration des Fixans verglichen mit Glutaraldehyd stärker gehemmt. Spätestens 10 min nach Beginn der Fixation hat das Enzym seine Basisaktivität erreicht. Spülen in hypertoner Zuckerlösung macht die Inhibition der Hetero--galactosidase teilweise rückgängig.Die mit dem Azokupplungs- und Indigogen-Verfahren gewonnenen Befunde sind weitgehend identisch.

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On the histochemical and microchemical demonstration of -galactosidase by means of 1-naphthyl--galactopyranoside

Summary A simultaneous azo coupling method for the intracellular demonstration of acid (hetero-) and neutral -galactosidase (lactase) in various organs of rats, mice and guinea-pigs is described.The recommended incubation medium consists of 4.5–9 mg 1-naphthyl--galactopyranoside (dissolved in 0.4 ml NN-dimethylformamide) and 0.5–0.8 ml 2% hexazonium-p-rosaniline in 9 ml 0.1 M citrate buffer, pH 5.0 (hetero--galactosidase) or 5.5 (lactase).Among all organs investigated the strongest acid -galactosidase reaction regularly occurs in the lysosomes of the epididymis, kidney, adrenal, thyroid, preputial and inguinal gland, spleen, colon and chorioid plexus; the neutral -galactosidase can only be detected in the intestinal brush border exhibiting a moderate activity.Because hetero--galactosidase is a highly soluble enzyme bloc-fixation using glutaraldehyde becomes necessary to achieve a precise intralysosomal localization; for the demonstration of lactase fresh or freeze-dried cryostat sections are suitable. —In the proximal tubule of the rat kidney independent of their concentration the inhibition of acid -galactosidase following treatment with formol surpasses that of glutaraldehyde. Within the first ten minutes of fixation the enzyme reaches its basis activity. The recovery rate of renal hetero--galactosidase considerably increases in the course of washing in hypertonic sugar solution.In comparison with the indigogenic technique nearly identical results can be obtained with the azo coupling procedure.

     

Ein fluoreszenzmikroskopischer Nachweis von β-Glucosidase in Wurzeln vonCicer arietinum (L.)

Zusammenfassung Die Lokalisierung von -Glucosidasen in Wurzeln der Kichererbse [Cicer arietinum (L.)] wurde in einem einstufigen fluoreszenz-optischen Verfahren mit 4-Methyl-umbelliferyl-D-glucosid untersucht. Am Beispiel der Kichererbse wird gezeigt, daß in polyphenolhaltigen Pflanzen herkömmliche Azokupplungsverfahren zur Glucosidaselokalisierung nicht anwendbar sind. Die mit der neuen Methode erhaltenen Ergebnisse decken sich im wesentlichen mit denen aus vergleichbaren Untersuchungen und zeigen, daß -Glucosidasen nicht vorhanden sind. Aryl--Glucosidasen wurden vorwiegend im äußeren Cortexbereich gefunden und nehmen mengenmäßig zur Wurzelspitze hin zu.

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Localization of -glucosidase in roots ofCicer arietinum (L.) by a fluorescence technique

Summary The localization of -glucosidases in roots of garbanzo beans [Cicer arietinum (L.)] has been investigated by a one-step fluorescence optical procedure using 4-methylumbelliferyl--D-glucoside. It is shown that the well known azo-coupling test for the localization of glucosidases cannot be applied in polyphenol containing plants. The results obtained with the new method are comparable with those described in other investigations and further show that -glucosidases are absent from the root tissues investigated. The aryl--glucosidases were mainly detected in the outer region of the cortex and quantitatively increase towards the root tip.

     

Azoindoxylverfahren zum histochemischen Hydrolasennachweis

Zusammenfassung Es wird eine Azoindoxylmethode zum histochemischen Nachweis der Lactase (Lactase--glucosidase-Komplex) beschrieben.Das Inkubationsmedium enthält 5 mg 5-Br-4-Cl-3-Indolyl--d-fucoside (gelöst in 0,5 ml N,N-Dimethylformamid) und 0,02 ml Hexazonium-p-rosanilin in 10 ml 0,1 M Citronensäure-Phosphat-Puffer, pH 6–6,5.Mit diesem Verfahren kann die Lactase im Jejunum von Rattensäuglingen exakt im Bürstensaum der Enterozyten dargestellt werden. Verglichen mit der entsprechenden Indigogenmethode läuft die Azoindoxylreaktion schneller ab und lokalisiert in frischem und fixiertem Material häufig präziser.

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Azoindoxyl methods for the histochemical investigation of hydrolases. I. Lactase (lactase--glucosidase complex)

Summary An azoindoxyl method for the histochemical demonstration of lactase (lactase--glucosidase complex) is described.The incubation medium consists of 5 mg 5-Br-4-Cl-3-indolyl--d-fucoside (dissolved in 0.5 ml N,N-dimethylformamide) and 0.02 ml hexazotized p-rosaniline in 10 ml 0.1 M citric acid phosphate buffer, pH 6–6.5.By means of this method lactase can be exactly localized in the brush border of the enterozytes in the jejunum of suckling rats. Compared to the corresponding indigogenic method the azoindoxyl reaction proceeds faster and the reaction product is often precipitated more precisely.

     

Über die β-Glucosidase und Lactase im Darm von Vertebraten

Zusammenfassung Mit 1-Naphthylderivaten kann die -Glucosidase im Darm von Ratte, Kröte und Goldfisch nachgewiesen werden; die Lactase kommt nur bei Ratte und Kröte vor. Das Intestinum von Taube, Grünfink, Schildkröte und Frosch reagiert negativ. Mit Ausnahme der Kröte, bei der beide Enzyme im Cytoplasma lokalisiert sind, färbt sich stets der Bürstensaum der Enterozyten an.Im Darm von Rattensäuglingen besitzen -Glucosidase und Lactase die höchste Aktivität während der ersten Lebenswoche, wobei das Aktivitätsmaximum bereits am Geburtstermin auftritt. Verglichen mit dem entsprechenden Galactosid wird 1-Naphthyl--glucosid etwa 5mal schneller gespalten. Hemmversuche erbringen für die -Glucosidase und Lactase nahezu identische Resultate.

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-Glucosidase and lactase in the intestine of vertebrates

Summary By means of 1-naphthyl derivates -glucosidase has been demonstrated in the intestine of rats, toads and gold-fishes; lactase can only be detected in rats and toads. The intestine of pigeons, finches, turtles and frogs does not react. With the exception of the toad where both enzymes are localized in the cytoplasm the brush border of the enterocytes is always stained.In the intestine of suckling rats the highest -glucosidase and lactase activity occurs dnring the first week of life. At birth these enzymes have already reached their maximal activity. In comparison with the corresponding galactosid 1-naphthyl--glucoside exhibits an about five times higher splitting rate. The results obtained in the inhibition tests are nearly the same for -glucosidase and lactase.

     

Azoindoxylverfahren zum Hydrolasennachweis

Zusammenfassung Untersucht wird die Eignung verschiedener Azoindoxyl-methoden zum lichtmikroskopisch-histochemischen Nachweis der -N-Acetylglucosaminidase. Die Inkubationsmedien enthalten 0,5 mg N-Acetyl-(5-bromindol-3-yl)--d-glucosaminid (5-Br-3-Indolyl--d-N-acetylglucosaminid; 1 mg gelöst in 0,05 ml Dimethylformamid) in 1 ml 0,1 M Citronensäure-Phosphat-Puffer, pH 4,5 oder 5. Als Simultankuppler werden 0,02 ml Hexazonium-p-rosanilin oder-neufuchsin oder tetrazotiertes BAXD/ml oder 0,5 mg Fast Blue B oder Fast Garnet GBC/ml erprobt. Die besten Resultate liefert unabhängig von Gewebevorbehandlung und Organ hexazotiertes Neufuchsin.Im Vergleich zur Azofarbstoffreaktion mit Naphthol-AS-BI--d-N-acetylglucosaminid und hexazotiertem p-Rosanilin oder Neufuchsin oder tetrazotiertem BAXD liefert speziell die Azoindoxylmethode mit hexazotiertem Neufuchsin bessere oder identische Resultate. Die Indigogen-, Metallsalzund Tetrazoliumreaktion sind dem Azoindoxylverfahren meistens unterlegen; eine Ausnahme macht die Tetrazoliummethode mit BSPT.Beim Azoindoxylverfahren mit Hexazonium-p-rosanilin ist vorteilhaft, daß der Azoindoxylfarbstoff osmiert werden kann, in organischen Solventien und Kunstharzen weitgehend unlöslich ist und deshalb für die ultracytochemische Darstellung der -N-Acetylglucosaminidase in Frage kommt. Unter den übrigen Methoden ist dies nur noch mit der Tetrazoliumreaktion und BSPT der Fall; sein Formazan läßt sich ebenfalls osmieren.Mit hexazotiertem Neufuchsin zur Simultankupplung und 5-Br-3-Indolyl--d-glucosaminid als Substrat kann die -N-Acetylglucosaminidase nach Blockfixation in Form- oder Glutaraldehyd in den Lysosomen zahlreicher Rattenorgane und-gewebe einwandfrei nachgewiesen werden.

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Azoindoxyl methods for the investigation of hydrolasesIII. Histochemical studies of -d-N-acetylglucosaminidase

Summary The suitability of various azoindoxyl procedures for the light microscopical demonstration of -N-acetylglucosaminidase is described. The incubation media tried consist of 0.5 mg N-Acetyl-(5-bromindol-3-yl)--d-glucosaminide (5-Br-3-indolyl--d-N-acetylglucosaminide; 1 mg dissolved in 0.05 ml N,N-dimethylformamide) in 1 ml 0.1 M citric acid phosphate buffer, pH 4.5 or 5. 0.02 ml hexazotized p-rosaniline or new fuchsine/ml or tetrazotized BAXD or 0.5 mg Fast Blue B or Garnet GBC/ml were employed as a coupling reagent. Hexazotized new fuchsine yields the best results independent on the pretreatment of the tissue and the organ investigated followed by hexazonium-p-rosaniline.Compared with the azo dye method using naphthol AS-BI -d-N-acetyl-glucosaminide as a substrate and hexazotized p-rosaniline or new fuchsine or tetrazotized BAXD for simultaneous coupling especially the azoindoxyl technique with the new fuchsine is equivalent or superior. When the indolyl glucosaminide is used in the indigogenic, tetrazolium or metal precipitation method the results are mostly inferior with the exception of the tetrazolium reaction using BSPT.However, the main advantage of the azoindoxyl procedure is that at least the azoindoxyl dye deriving from hexazotized p-rosaniline can be osmificated and withstands treatment with organic solvents and resins. Therefore, the reaction product seems to be suitable for the electron microscopic demonstration of glucosaminidase. Among the other reaction principles this can reliably be achieved only with BSPT as a tetrazolium salt followed by osmification of its formazan.After fixation of blocks of tissue in form- or glutaraldehyde -d-N-acetylglucosaminidase can be localized with 5-Br-3-indoxyl--d-N-acetylglucosaminide as a substrate and hexazotized new fuchsine for simultaneous coupling in the lysosomes of many rat organs.

     

Zur Charakterisierung der Gasvacuolen der Blaualge Oscillatoria rubescens

Zusammenfassung Die Hohlspindeln aus Oscillatoria rubescens enthalten in ihrem Innern ein Gas und sind die Elemente der lichtmikroskopisch beobachtbaren Gas- oder Pseudovacuolen. Sie können mit Hilfe der Dichtegradienten-zentrifugation von den Thylakoiden, die den photosynthetischen Apparat enthalten, und den anderen Strukturen abgetrennt werden. Zwar verlieren sie bei der Isolation ihre Spindelform, doch besitzen die entstandenen Blasen eine mit Osmium stabilisierbare Membran, an deren Aufbau die zwei Polyene -Carotin und 4-Keto--Carotin und vermutlich Fettsäuren beteiligt sind.Im Text verwendete Abkürzung RNS Ribonucleinsäure     

Beobachtungen zum Antagonismus zwischen Asparagin und β-Alanin

Zusammenfassung Hefezellen können aus dem Nährmedium soviel -Alanin aufnehmen, daß sie damit auch nach Übertragung in ein davon freies Substrat beträchtlich wachsen können. Diese Aufnahme von -Alanin ist auch in Abwesenheit einer Stickstoffquelle und nach Verarmung an Stickstoff möglich. Asparagin hemmt als Antagonist des -Alanins dessen Verwertung nur dann, wenn beide Verbindungen gleichzeitig geboten werden. Es kann, wenn es vor der Inkubation mit -Alanin geboten wird, dessen spätere Aufnahme nicht behindern, und es kann, nachträglich geboten, die Exosmose nicht steigern. Aus diesen Beobachtungen wird geschlossen, daß -Alanin nicht nur bis zum Konzentrationsausgleich in die Zelle eindringt, sondern teilweise in höhermolekulare Verbindungen (Pantothensäure, Coenzym A) eingebaut und damit festgelegt wird. Der Vermutung anderer Autoren, wonach antagonistisch wirkende Aminosäuren lediglich den Aufnahmevorgang behindern sollen, wird entgegengehalten, daß im Falle des Antagonismus zwischen -Alanin und Asparagin viel eher mit einer Behinderung der Weiterverarbeitung zu rechnen ist.     

The effects of silt and sand on the invertebrate fauna of streams and rivers

Summary Most of the literature concerned with the effects of silt and sand on the invertebrate fauna of streams and rivers has described changes taking place when biotopes are completely smothered by silt and sand. In few of these studies were the kinds of animals found recorded. There have been few studies of the effect of silt and sand on individual species. The invertebrate fauna of two biotopes in the streams and rivers of the Vaal River system, South Africa, changed with the amount of silt and sand in the watercourses. Where there were large amounts of silt and sand the variety of animals recorded from the stones in current biotopes was reduced, but the density of the fauna as a who did not change (Tables I and II, Unstable Depositing Zones, summer). However the density of many groups of animals was affected (Table III). Some of the animals adversely affected by silt and sand appeared in larger numbers below impoundments in which silt and sand would settle. In the sediment biotopes the summer density of the fauna was lowest where there was a lot of silt and sand (Table IV, the two Unstable Depositing Zones). Large amounts of silt and sand were associated with large summer declines in the surface dwelling animals as a proportion of the whole sediment fauna (Table IV). Differences between the summer proportions of surface dwelling forms in fine and coarse sediments were due to faunal differences. Sediments were not studied below impoundments.It is concluded that there may be considerable changes in the composition of the stones in current fauna due to silt and sand without the biotope being smothered, and that increases in the amount of silt and sand in river beds lead to increased instability of the sediments, which adversely affects their fauna.

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Zusammenfassung Die Abhandlungen, die sich mit dem Einflu von Schlamm und Sand auf die Invertebratenfauna von Bächen und Flüssen befassen, haben meistens die Veränderungen beschrieben, die sich ergeben, wenn Biotope ganz von Schlamm und Sand erstickt werden. In wenigen dieser Forschungen werden die Arten der gefundenen Tiere eingetragen. Es gibt wenige Arbeiten über den Einflu von Schlamm und Sand auf einzelne Arten.Die Invertebraten-Fauna zweier Biotope in Bächen und Flüssen des Vaalsystems, Süd-Afrika, hat sich mit der Menge von Schlamm und Sand in den Flüssen geändert. Wo es groe Mengen von Sand und Schlamm gab, ist die Verschiedenartigkeit der Tiere von Steinen in flüssigem Biotop vermindert worden, aber die Dichte der ganzen Fauna ist dieselbe (Tabellen I und II, Unstable Depositing Zones, Summer). Jedoch die Dichte vieler Tiergruppen ist beeinträchtigt worden (Tabelle III). Einige von Schlamm und Sand ungünstig beeinflute Tiere erscheinen in gröerer Anzahl unter Einsperrungen, wo Schlamm und Sand sich niederschlagen können. In Niederschlagbiotopen ist die Sommerdichte der Fauna am niedrigsten, wo es viel Schlamm und Sand gibt (Tabelle IV, Die zwei Unstable Depositing Zones). Groe Mengen von Schlamm und Sand gehen mit groen Sommerabnahmen der oberflächlich lebenden Tiere im Verhältnis zu der ganzen Niederschlagfauna zusammen (Tabelle IV). Unterschiede zwischen den Verhältnissen oberflächlich lebender Formen in feinen und groben Niederschlägen im Sommer sind die Folge faunaler Unterschiede. Niederschläge unterhalb von Einsperrungen sind nicht untersucht worden.Es wird geschlossen, da es beträchtliche Änderungen in der Zusammenstellung der Fauna der Steine in Flüssen wegen Schlammes und Sandes geben kann, ohne da der Biotop erstickt wird, und da Steigerungen der Menge von Schlamm und Sand in Flubetten zu vermehrter Instabilität der Sedimente führt, welche ungünstig auf die Fauna einwirkt.

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This work forms part of a dissertation submitted to Rhodes University Grahamstown, in fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy.     

Fermenttopochemische Untersuchungen an der Nebennierenrinde des Meerschweinchens nach Abschluss einer langfristigen Cortisonvorbehandlung

Zusammenfassung Das histotopochemische Verhalten verschiedener Fermente wurde an der Nebenniere von 28 Tage lang mit Cortison vorbehandelten Meerschweinchen untersucht.Es findet sich bei allen beobachteten Fermenten mit Ausnahme der DPN-Diaphorase zum Zeitpunkt des Absetzens der Vorbehandlung ein Aktivitätsabfall in der Zona Fasciculata. In der Zona Glomerulosa war nur bei den sauren Phosphatasen, der Glucose-6-phosphatdehydrogenase und der 3-ol-Steroiddehydrogenase eine Verminderung der Aktivität festzustellen.Die Normalaktivität wurde von den einzelnen Fermenten nach verschieden langen Zeiträumen wieder erreicht. Bei 3-ol-Steroiddehydrogenase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase und den alkalischen Phosphatasen tritt dabei ein rebound auf.Zwischen den gefundenen Fermentveränderungen und dem Verhalten der Kernvolumina und der 17-OHCS-Ausscheidungskurve in der Restitutionsphase bestehen Zusammenhänge, die diskutiert werden.

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Summary The histotopochemical distribution of various enzymes is studied in the adrenal cortex of Guinea-pigs after a 28 days administration of cortisone.All the enzymes investigated show a decrease of enzymatic activity in the zona fasciculata directly after the administration of cortisone has ceased. In the zona glomerulosa only acid phosphatases, glucose-6-phosphatedehydrogenase and 3-ol-steroiddehydrogenase show a decrease of activity. The enzymes concerned reached normal activity after different periods. A rebound was noted with 3-ol-steroiddehydrogenase, glucose-6-phosphatedehydrogenase and alkaline phosphatases.The relations between the changes in the enzymatic activity, the reaction of the nuclear volumes and the 17-OHCS-excretion curve in the restoration period are discussed.

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Mit Unterstützung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft.

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Ausgeführt unter Leitung von Priv.-Doz. Dr. M. Herrmann.     

Über die Verteilung einiger Hydrolasen in der Rattenniere

Zusammenfassung Die Verteilung der sauren Phosphatase (SPB=nach Barka und Anderson; SPG=nach Gomori), -Glucuronidase (-Glu), Arylsulfatase (AS), -N-Acetylglucosaminidase (NAG), saure 5-Nucleotidase (s5-Nucl), unspezifische Esterase (UE) und der alkalischen Phosphatase (AP) wurden in den Nieren männlicher und weiblicher Ratten mit Hilfe unterschiedlicher Methoden (freischwimmende Gefiermikrotomschnitte, Kryostatschnitte, gefriergetrocknete Schnitte, Azofarbstoffmethode, Metallsalzmethode, Indigogenmethode) und nach verschiedenen Modifikationen (u.a. der Substratkonzentration, des pH, der Temperatur und Inkubationsdauer) untersucht. Ein optimaler Nachweis dieser Enzyme gelingt mit der Inkubation freischwimmender Schnitte nach Standard-Fixierung (2 Std. in Formol-Calcium und anschließend für 18–22 Std. in Formol-Calcium mit 0,88 M Saccharose bei 4°C) von Nierenscheiben (für die SPB und UE jedoch nach Holtscher Fixierung). Ferner sind bei einigen Enzymen für ihre bestmögliche Darstellung folgende Bedingungen einzuhalten: AP und UE Inkubation bei 4° C, End-pH für SPB 5,5, SPG 5,0, UE 6,5, UE als Kuppler Fast Garnet GBC Salt. Für alle Hydrolasen bestehen in der Niere Geschlechtsunterschiede. Bei Weibchen kommt außerdem eine erhöhte Aktivität im Östrus vor. In den S1-Segmenten der juxtamedullären Nephrone reagieren die SPB, s5-Nucl und AP bei Männchen und die SPG bei Weibchen kräftiger als in den S1-Segmenten der übrigen Rinde. In den Markstrahlen sind in den S2-Segmenten weiblicher Ratten die Aktivitäten der UE und s5-Nucl stärker als bei Männchen. Höhere Enzymaktivität weisen die in den Markstrahlen gelegenen S3-Abschnitte für SPG und AP bei Männchen und für NAG und UE bei Weibchen auf. In der Markinnenzone haben die Sammelrohre bei Männchen eine starke -Glu und bei Weibchen eine stärkere NAG-Aktivität. In den cortical gelegenen distalen Tubuli ist die SPB-Reaktion bei Männchen intensiver.

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Distribution of some hydrolases in the rat kidney

Summary Most of the available histochemical methods and techniques (azodye, metal salt and indigogenic methods, cryostat, free-floating and lyophilized section techniques) and different modifications of these methods (different substrate concentrations, pH, temperature, incubation time e.g.) were applied to study the distribution of acid phosphatase (AcPB=after Barka and Anderson; AcPG=after Gomori), -glucuronidase (-Glu), aryl sulfatase (AS), -N-acetylglucosaminidase (NAG), acid 5-nucleotidase (a5-Nucl), non-specific esterase (NE) and alkaline phosphatase (AlP) in the kidneys of rats of both sexes. The optimal conditions for the demonstration of these enzymes were established. As most important proved: the incubation of free-floating sections cut from standard-fixed (2 h in formol-calcium continued for another 18–22 h in the same fixative plus 0.88 M sucrose at 4° C) kidney slices — only for AcPB and NE material fixed after Holt had to be used; the incubation for AlP and NE at 4° C; final pH of the incubation medium for AcPB 5.5, AcPG 5.0 and NE 6.5; the use of Fast Garnet GBC Salt as coupler in the NE azo-dye reaction. Sex differences and for the female rats an increased activity during oestrus were established for all hydrolases studied. In particular the following results were obtained: AcPB, a5-Nucl and AlP are more intensive in male and AcPG in female S1 segments of the juxtamedullary nephrons in relation to the nephrons of the other parts of the cortex. In the medullary rays the NE and the a5-Nucl show a higher activity in the S2 segments of the female rats than in the male ones. The S3 segments of the medullary rays of female rats demonstrate a more intensive activity for NAG and NE. This is true for AcPG and AlP in male rats. In the inner medulla a stronger -Glu activity in male rats and a stronger NAG activity in female rats is observed. The AcPB activity of the cortical distal tubules is higher in male rats.

     

Enzym-Topochemie von Frühentwicklung und Implantation des Kaninchens

Zusammenfassung Untersucht werden Frühstadien der Entwicklung des Kaninchens von der Ovulation bis zur Implantation, einschließlich Tube und Uterus. Registriert wird die Verteilung von Glykosidasen (-Galaktosidase, Neuraminidase, Glukosaminidase, -Glukuronidase, -Glukosidase), vor allem im Hinblick auf den Stoffwechsel von Mukosubstanzen. Die verwendete Methode zum Neuraminidasenachweis ist ein erster Versuch zur histochemischen Lokalisation dieses Enzyms.Ergebnisse. In Furchungsstadien sind -Glukuronidase und Glukosaminidase auffällig aktiv. Eine Funktion bei den wichtigen morphogenetischen Prozessen dieser Phase wird vermutet. Das Epithel der Tube zeigt vor allem eine Aktivität von Glukosaminidase und -Galaktosidase, die möglicherweise eine Beziehung zur Bildung der Mukoproteidschicht haben. Im Uterusepithel sind in allen Stadien -Galaktosidase und Glukosaminidase aktiv; -Glukuronidase tritt vor allem vor dem Eintritt des Keims in den Uterus und bei der Implantation hervor. Für die Auflösung der Blastozystenhüllen und für die Implantation ist wahrscheinlich die -Galaktosidase-, -Glukuronidase-und Glukosaminidaseaktivität der Trophoblastsprosse von Bedeutung. Neuraminidase ist dagegen vor allem im Uterusepithel lokalisiert.

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Enzyme topochemistry of the early development and implantation in the rabbitII. Glycosidases

Summary Early stages of development and the surrounding tissues of the Fallopian tube and the uterus are studied in the rabbit from ovulation to implantation. The topochemistry of the following glycosidases is demonstrated: -galactosidase, neuraminidase, glucosaminidase, -glucuronidase, -glucosidase. The distribution given for neuraminidase is the result of preliminary attempts to develop histochemical procedures for this enzyme.Results. In cleaving eggs, the activities of -glucuronidase and glucosaminidase are dominant. The epithelium of the Fallopian tube shows an activity of glucosaminidase and -galactosidase possibly correlated to the formation of the mucoproteid layer. These enzymes are also demonstrated in the epithelium of the uterus in all stages, whereas -glucuronidase has its maximum activity before eggs enter the uterus and at implantation. In the trophoblastic knobs, these three enzymes could have a physiological role in the processes of dissolution of blastocyst coverings and implantation. Neuraminidase activity is found in the epithelium of the uterus.

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Abkürzungen EDTA Äthylendiamintetraazetat - FBB Fast Blue B Salt (Echtblausalz B) - MS Mukosubstanz, -en - NA Neuraminsäure, Salinsäuren - NAase Neuraminidase - Nitro-BT Nitro Blue Tetrazolium Chloride - nMS neutrale Mukosubstanz, -en - p.c. post coitum - h.p.c., d p.c. Studen p.c., Tage p.c. - PMS Phenazinmethosulfat - PVP Polyvinylpyrrolidon - sMS saure Mukosubstanz, -en - v/v Mischungsverhältnis zweier Volumina - w/v Gewicht pro Endvolumen     

Tetrazoliummethoden zum histochemischen Hydrolasennachweis

Zusammenfassung An gefriergetrockneten und Schnitten von nativem oder aldehyd-fixiertem Material wird die Eignung von Nitro BT (NBT), Tetranitro BT (TNBT), Distyryl Nitro BT (DS-NBT), Thiocarbamyl Nitro BT (TC-NBT) und Benzothiazolylstyrylphthalhydrazidyltetrazoliumcholorid (BSPT) als Hilfsreagentien zur Lokalisation von Glykosidasen, Phosphatasen und unspezifischen Esterasen mit Indoxylsubstraten an Rattenorganen geprüft.Mit NBT und TNBT lassen sich die saure -d-Galactosidase, -d-N-Acetylglucosaminidase, saure Phosphatase, Neuraminidase und unspezifische Esterase höchstens auf Zellebene nachweisen; präziser kann die Lactase--d-glucosidase im intestinalen Bürstensaum dargestellt werden. Die besten Resultate liefert die Untersuchung der alkalischen Phosphatase; mit TNBT ist das Tetrazoliumverfahren unter allen bisher beschriebenen Reaktionen die Methode der Wahl für die lichtmikroskopische Darstellung dieses Enzyms.Mit BSPT als Tetrazoliumsalz und anschließender Osmierung seines Formazans lassen sich alle sauren und neutralen Hydrolasen exakt in Lysosomen, Sekretgranula, Cytoplasma und/oder Mikrovilli fassen; gleichzeitig sind damit ultracytochemische Studien möglich. Die alkalische Phosphatase reagiert mit BSPT nur an hochaktiven Stellen positiv.-DS- und TC-NBT sind NBT, TNBT und BSPT unterlegen.

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Tetrazolium methods for the histochemical investigation of hydrolases

Summary Using freeze-dried or sections from fresh-frozen or aldehyde-fixed material nitro BT (NBT), tetranitro BT (TNBT), distyryl nitro BT (DS-NBT), thiocarbamyl nitro BT (TC-NBT) or benzothiazolylstyrylphthalhydrazidyl tetrazolium chloride (BSPT) were tested as auxiliary reagents for the localization of glycosidases, phosphatases and non-specific esterases with indoxyl substrates in rat tissues.By means of NBT or TNBT as a tetrazolium salt acid -d-galactosidase, -d-N-acetylglucosaminidase, acid phosphatase, neuraminidase and non-specific esterase can only be localized at the cellular level; a more precise localization is possible for lactase--d-glucosidase in the intestinal brush border, and the best results are obtained in the demonstration of alkaline phosphatase; among all methods described previously the tetrazolium procedure with TNBT is the method of choice for the light microscopic localization of this enzyme.Reverse data are observed with BSPT as a tetrazolium salt; then, all acid and neutral hydrolases can be exactly localized in lysosomes, secretion granules, cytoplasm and/or microvilli of many cells and tissues provided BSPT-formazan is stabilized by osmification. Furthermore, this procedure enables the reliable ultracytochemical demonstration of these enzymes. However, in the case of alkaline phosphatase only sites with high enzyme activity reveal a positive reaction.-DS- and TC-NBT are inferior to NBT, TNBT or BSPT.

     

Cytochemische Lokalisation einiger Hydrolasen in drei Orbitaldrüsen des Kaninchens

Zusammenfassung Ausgehend von der Frage nach dem Ort der Substratspaltung der hydrolytischen Enzyme in drei Orbitaldrüsen des Kaninchens wurden die Glykosidasen - Glucosaminidase, -Glucuronidase, -d-Glucosidase und -Galactosidase sowie die die Hydrolasen unspezifische saure und alkalische Phosphatase, unspezifische Esterase, ATP'ase und Leucinaminopeptidase mit enzymhistochemischen Methoden untersucht. Die Reaktionsprodukte dieser Enzymaktivitäten ließen sich mit Ausnahme der unspezifischen Esterase und Galactosidase in definierbaren Cytoplasmabezirken lokalisieren. Die Disaccharidase -Glucosidase war in allen Drüsen nicht nachweisbar. Ferner konnte in den Myoepithelzellen eine hohe Aktivität auf alkalische Phosphatase festgestellt werden. Sie ließen sich mit dieser Reaktion selektiv darstellen. Die Bedeutung der Befunde in bezug auf die Funktion der drei Orbitaldrüsen wird diskutiert.

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Cytochemical localization of some h ydrolases in three glands of the orbit in the rabbitLacrimal gland, infraorbital gland and harderian gland

Summary Studying the site of hydrolytic enzymes in rabbit orbital glands the glycosidases -glucosaminidase, -glucuronidase, -glucosidase and -galactosidase as well as the hydrolases non-specific acid and alkaline phosphatase, ATP'ase, esterase and leucinaminopeptidase have been investigated using histochemical techniques. Reaction product of the above acid activities is confined to a number of granules except for esterase, -galactosidase and leucinaminopeptidase which are not demonstrable on a cytochemical level. Furthermore we noticed a strong phosphatase activity in the myoepithelial cells. The meaning of these findings in relation to the function of the orbital glands is discussed.

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Mit dankenswerter Unterstützung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (Ku-210/2).     

Enzymhistotopochemische Studien an inaktiven Salzdrüsen von Hausenten (Anas platyrhynchus)

Zusammenfassung In der sog. inaktiven Salzdrüse von Hausenten wurden die Glykosidasen -d-Glucuronidase, -d-Glucosaminidase, -Glucosidase und -d-Galaktosidase sowie die Hydrolasen unspezifische saure Phosphatase, unspezifische alkalische Phosphatase, Esterase, ATPase und Leucinaminopeptidase mit enzymhistochemischen Methoden untersucht. Die Drüsenzellen zeigen deutliche, wenn auch quantitativ unterschiedliche Esteraseaktivitäten. Besonders auffallend ist die hohe Aktivität der lysosomal lokalisierten sauren Phosphatase in den Epithelzellen der Zentralkanäle und Ausführungsgänge. Die Bedeutung der Befunde in bezug auf sekretorische und resorptive Leistungen der Salzdrüse wird diskutiert.

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Enzyme histochemical studies on the salt gland of ducks (Anas platyrhynchus)II. Cytochemical localization of some hydrolases

Summary Studying the site of hydrolytic enzymes in the salt gland of domestic ducks the glycosidases -d-glucuronidase, -d-glucosammidase, -glucosidase and -d-galactosidase as well as the hydrolases non-specific phosphatases, esterases, ATPase and leucinaminopeptidase have been investigated with histochemical techniques. The epithelia of the salt gland show distinct activities of non-specific esterases, that differ quantitatively. Furthermore we noticed a strong granular activity of non-specific acid phosphatase in the central canal and in the glandular duct system. The meaning of these findings in relation to secretion and absorption is discussed.

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Mit dankenswerter Unterstützung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (Ku-210/2).     

Die sauren Hydrolasen des Nebenhodenepithels von Ratten nach Kastration und Kryptorchismus

Zusammenfassung Auf Grund von Verteilungsdifferenzen verschiedener Epithelzelltypen (Hauptzellen, helle Zellen vom Typ I–IV, Flaschenzellen, Basalzellen) und intraepithelialer Lymphocyten im Verlauf des Nebenhodenganges sowie von Zell-, Lokalisations- und Aktivitätsdifferenzen der sauren Hydrolasen Phosphatase, -d-N-Acetylglucosaminidase (NAG), -d-Glucuronidase, -d-Galactosidase (-Gal), -d-Galactosidase, -d-Mannosidase (-Man), unspezifische Esterasen und Dipeptidylpeptidase (DPP) I und II im Epithel kann der Nebenhoden in 10 Zonen untergliedert werden. Meist kommen die Hydrolasen in Lysosomen, möglicherweise aber auch im endoplasmatischen Reticulum und Golgi-Apparat sowie in Sekretgranula der Epithelzellen vor. Daher laufen offenbar außer intraepithelialen Verdauungsprozessen, deren Intensität von der betreffenden Zone und vom jeweiligen Zelltyp abhängt, auch Sekretionsvorgänge saurer Hydrolasen (NAG, -Gal, -Man, DPP II) ins Lumen ab. — Experimente (bilaterale und unilaterale operative und chemische Kastration mit und ohne Androgensubstitution, Kryptorchismus) zeigen, daß der Nebenhoden danach in proximodistaler Richtung reagiert; etwas schematisch läuft die Reaktion in 3 Phasen ab; außerdem entwikkeln sich vermutlich aus Hauptzellen sog. neue basale Zellen mit speziellem Lysosomenapparat, und ohne Substitution sinkt die Hydrolasenaktivität; die Abnahme selbst kann sich enzym-, zonen- und zellspezifisch verhalten. Nach bilateraler Kastration stirbt initial innerhalb oder außerhalb des Epithels bevorzugt in Zone 1 und 2 ein bestimmter Hauptzelltyp; nach Kryptorchismus erscheinen Spermatiden im Nebenhodengang, wandern ihn hinunter und inkorporieren die Lumenhydrolasen. — Diese und weitere Daten deuten darauf hin, daß vor allem die Serumandrogene, aber auch die Lumenandrogene durch lokal unterschiedliche sowie zell- und hydrolasenspezifische Effekte das Nebenhodenepithel regulieren. Vielleicht sind darüber hinaus nur bestimmte Hauptzellen androgensensitiv und werden durch Androgene beeinflußt; die restlichen könnten hingegen androgeninsensitiv sein und über andere, noch unbekannte Mechanismen gesteuert werden. Die Ganglumenhydrolasen werden selektiv von Nebenhodenepithelzellen sezerniert; eventuell sind dafür die hellen Zellen vom Typ I und II in Zone 5 und 6 verantwortlich.

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Acid hydrolases in the epididymal epithelium of rats after castration and cryptorchidism

Summary On the basis of distribution differences of various types of epithelial cells (principal cells, clear cells of type I–IV, flask cells, basal cells) and intraepithelial lymphocytes in the course of the epididymal duct as well as cell, localization and activity differences of the acid hydrolases phosphatase, -d-N-acetylglucosaminidase (NAG), -d-glucuronidase, -d-galactosidase (-Gal), -d-galactosidase, -d-manosidase (-Man), non-specific esterases and dipeptidylpeptidase (DPP) I and II in the epithelium the epididymis of mature rats can be subdivided into 10 zones. Mostly, these hydrolases are localized in lysosomes but may also be linked to the endoplasmic reticulum, Golgi apparatus and secretion granules of the epithelial cells. Therefore, beside intraepithelial digestive processes, the intensity of which varies in dependency on the zone and cell type, secretion of some acid hydrolases (NAG, -Gal, -Man, DPP II) into the lumen seems to be possible. —In a series of experiments (bilateral and unilateral surgical and chemical castration with and without androgen substitution, cryptorchidism) it can be shown that the epididymis reacts in a proximodistal direction; 3 phases of epithelial response may be distinguished; furthermore, so-called new basal cells with a special lysosomal apparatus develop presumably from principal cells, and without substitution the hydrolase activity decreases; the decrease itself depends on the investigated enzyme, cell type and zone. After bilateral castration the initial event is the death of one special type of principal cell inside or outside the epithelium preferentially in zone 1 and 2; after cryptorchidism spermatides enter the lumen, move the duct downwards and incorporate the luminal hydrolases. — These and additional data suggest a regulation of the epididymal epithelium by serum androgens but also luminal androgens via locally different as well as cell and hydrolase specific effects. Possibly, only one type of principal cell is androgen-sensitive and is influenced by androgens respectively; the others may be insensitive to androgens and are regulated by mechanisms presently not yet known. The luminal hydrolases are actually secreted by epithelial cells of the epididymis; presumably, the clear cells of type I and II in zone 5 and 6 are responsible for their secretion.

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Mit Unterstützung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 105)     

Immunological investigations on the evolution of β2 II and III,IgD and inter-α-trypsininhibitor

Summary In continuation of earlier experiments on a group of 20 human plasma proteins the immunological cross-reactions between human and animal ₂-glycoprotein II, ₂ III, IgD and inter--trypsininhibitor have been investigated in an attempt to elucidate the evolution of these proteins, for which only few chemical data are available. Human ₂-glycoproteins II and III cross-react with their counterparts in the sera of gorilla gorilla, pongo pygmaeus, macaca nemestrina (group II of our nomenclature), human inter--trypsininhibitor with gorilla gorilla, pongo pygmaeus and IgD (-chain) only with gorilla gorilla sera (group I). No reaction was observed with sera of papio anubis, cebus albifrons and galago crassicaudatus as well as with sera of several non-primate mammals. No antigenic heterogeneity was demonstrable by comparative analysis in any of these 4 proteins. The results are discussed briefly in comparison with findings reported on other plasma proteins.

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Zusammentassung In Fortführung früherer Versuche über eine Gruppe von 20 menschlichen Plasmaproteinen wurden die immunologischen Kreuzreaktionen zwischen menschlichem und tierischem ₂-Glycoprotein II, ₂-Glycoprotein III, IgD und Inter--Trypsininhibitor untersucht. Damit wurde versucht, Informationen über die Evolution dieser Eiweiße zu gewinnen, von denen bisher erst wenige chemische Daten vorliegen.Die menschlichen ₂-Glycoprotein II und III zeigen Kreuzreaktionen mit ihren Homologen in den Seren von Gorilla gorilla, Pongo pygmaeus und Macaca nemestrina (Gruppe II unserer Nomenklatur), der Inter--Trypsininhibitor des Menschen mit denjenigen von Gorilla gorilla und Pongo pygmaeus und IgD (-Kette) nur mit denjenigen von Gorillaserum (Gruppe I). Mit den Seren von Papio anubis, Cebus albifrons und Galago crassicaudatus sowie von einigen Mammalia außerhalb der Primaten wurden keine Kreuzreaktionen gefunden. Bei allen vier Eiweißen war durch vergleichende Analyse kein Nachweis einer antigenen Heterogenität möglich. Die Ergebnisse werden kurz im Zusammenhang mit Befunden bei anderen Plasmaproteinen diskutiert.

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(Chief: Prof. Dr. E. Krah)     

Die Verwertung phenolischer Verbindungen durch Weißfäulepilze

Zusammenfassung Phenolcarbonsäuren, weniger Phenolaldehyde, wie sie als Spaltstücke des Lignins auftreten können, werden durch Weißfäulepilze entweder zusammen mit Glucose oder als alleinige Kohlenstoff-und Energiequelle verwertet. Eine zentrale Stellung beim Metabolismus dieser Verbindungen nimmt die Protocatechusäure ein, da die verschiedenen Verbindungen wahrscheinlich in diese überführt werden. Bei der Einwirkung von Polystictus versicolor auf Protocatechusäure entsteht als intermediäres Abbauprodukt. -Ketoadipinsäure. Es lassen sich aus den bebrüteten Lösungen dieses Pilzes Enzymsysteme isolieren, die nicht mit der Laccase identisch sind und die Spaltung von Protocatechusäure unter Aufnahme von Sauerstoff und Bildung von -Ketoadipinsäure katalysieren. Der Weg der Spaltung ist ähnlich den bisher für andere Mikroorganismen formulierten Abbauschritten der Protocatechusäure.     

Methylobacterium rhodesianum MB 126 possesses two acetoacetyl-CoA reductases

Two constitutive acetoacetyl-CoA (AcAc-CoA) reductases were purified from Methylobacterium rhodesianum MB 126, an NADPH-linked d(-)--hydroxybutyryl-CoA forming reductase (enzyme A) and an NADH-and NADPH-linked l(+)--hydroxybutyryl-CoA forming reductase (enzyme B). Enzyme A and B give apparent K _m values of 15 M and 30 M for AcAc-CoA, 18 M for NADPH and 30 M for NADH, respectively. They are inhibited by AcAc-CoA at concentrations higher than 25 M and 50 M, respectively. The contribution of the two reductases to poly--hydroxybutyrate synthesis is discussed.     

Die Zellkernveränderungen unter der Einwirkung von Ribonuklease und β-Merkaptoäthanol in der Zellkultur

Zusammenfassung Nach der Einwirkung von RNase und -Merkaptoäthanol auf Zellkulturen treten außer unspezifischen Veränderungen des Cytoplasmas charakteristische Kernumwandlungen auf. Diese ähneln bei der RNase den Kernveränderungen bei mit Herpes-Virus inokulierten Kulturen und den bei Herpes-Infektionen auftretenden Kerneinschlußkörpern. — Das -Merkaptoäthanol führt zu Chromatinverklumpung, die aus dem Kerninnenraum ausgestoßen werden. Es wird auf den verschiedenen Angriffsort dieser beiden Substanzen im Zellstoffwechsel hingewiesen.     

Electrophoretic variation between class II molecules expressed on HLA-DRw8 homozygous typing cells reveals multiple distinct haplotypes

Two-dimensional (2D) gel electrophoresis of immunoprecipitated HLA-DR antigens from eight homozygous typing cells (HTC) expressing the HLA-DRw8 specificity revealed a clustering of polymorphic chain patterns into distinct electrophoretic variants. The variant patterns correlate with three discrete HLA-D clusters that are defined in the mixed leukocyte culture reaction (MLR) using DRw8-positive HTC. These HLA-D clusters have been provisionally designated Dw8.1, detected primarily in Caucasoids, Dw8.2, detected primarily in American Indians, and Dw8.3, detected predominantly in Orientals. All three HLA-Dw8.1 cell lines express a single DR-locus product as defined by immunoprecipitation with a DR-specific monoclonal antibody, P4.1. This DR chain is identical among the Dw8.1 cell lines and different from the DR chains of the Dw8.2 and Dw8.3 cell lines. Two separate Dw8.2 HTC express a shared DR chain that is slightly more basic than the 8.1 DR molecule; interestingly, one of these lines also expresses an additional DR-like chain not found in the other cells. Thus, the two lines defining the Dw8.2 cluster share one distinct class 11 molecule, but differ in another and therefore are not biochemically HLA-identical. Cells from the Dw8.3 cluster are likewise distinct from all other Dw8 clusters. One additional DRw8-positive HTC has been analyzed and found to be distinct from the Dw8.1, 8.2 and 8.3 clusters by both MLR and 2D gels. lmmunoprecipitates using monoclonal antibody 1B5 [anti-DR and anti-DQ(DS)] identify additional polymorphic class II variants among the cell lines tested. These data indicate that HLA-DRw8 is a public serologic specificity present on class II molecules expressed on multiple distinct haplotypes. These haplotypes differ from each other in expression of polymorphic class II molecules encoded by at least two HLA loci. They also differ in HLA-D, even though they all type as HLA-DRw8 homozygous. In Dw8.2, variation in expressed chains is not reflected in variation in HLA-D, indicating that MLR, as well as serologic typing, does not detect the full degree of allelic polymorphism within HLA.