犬2型腺病毒E3区表达载体的构建

利用构建的犬2型腺病毒E3区缺失质粒pBE3L分别构建了含有和不含外源性启动子的绿色荧光蛋白（GFP）基因和在犬病病毒糖蛋白（Rgp）基因的重组表达质粒pBE3LGFP、pBE3LCGFP、pBE3LRgp和pBE3LCPgp,并分别对DK细胞进行了转染实验,以检测其表达,结果显示,pBE3LCGFP质粒在转染DK细胞后,于36h即可观察到荧光,72～96h无明显差别,传3代后仍可见表达荧光的细胞,pBE3LCRgp质粒转染DK细胞后,于48～96h用间接免疫荧光染色可检测到糖蛋白的表达,而pBE3LGFP和pBE3Rgp质粒转染DK细胞后经检测均无表达,表明构建的E3区缺失性载体不能利用E3区自身的启动子进行目的基因的表达,但利用外源性的启动子可使外源基因获得良好表达。     

人腺病毒E4转录区ORF4蛋白与细胞凋亡

人腺病毒基因早期转录区4的第4开放阅读框架编码的E4ORF4蛋白是一种多功能病毒调节蛋白,能够特异地引起转化细胞的凋亡,而对正常细胞没有影响,并且这种凋亡机制不依赖于经典的p53途径,E4ORF4蛋白功能的发挥需要与细胞内蛋白磷酸酶2A的相互作用,而且它还能改变Src激酶的活性,E4ORF4蛋白的多种功能协调合作,最终导致了转化细胞的凋亡。     

犬2型腺病毒通用载体的构建及鉴定

为了获得能够携带较大外源基因的犬2型腺病毒E3区缺失性载体,以犬2型腺病毒全基因组质粒pPolyⅡ-CAV-2及E3区重组质粒pVAX-E3为基础,缺失1381bp的E3区片段(92.6%的E3区全序列),插入Linker-NF(内含NotⅠ、ClaⅠ、FseⅠ多克隆位点),获得重组载体质粒pPolyⅡ-CAV-2-ΔE3（NF）(31.9kb)。以AscⅠ和PmeⅠ双酶切,游离重组基因组,在脂质体Lipofectamine^TM 2000介导下,转染MDCK细胞系,获得了E3区缺失的重组病毒CAV-2-ΔE3（NF）。通过病毒的形态学观察,血凝性、生长特性、感染性实验证明,该重组病毒与母源病毒没有差异。重组病毒CAV-2-ΔE3（NF）可以作为载体表达外源基因,其外源基因插入片段不小于3.3kb。     

犬2型腺病毒通用载体的构建及鉴定

为了获得能够携带较大外源基因的犬2型腺病毒E3区缺失性载体,以犬2型腺病毒全基因组质粒pPolyⅡ-CAV-2及E3区重组质粒pVAX-E3为基础,缺失1381bp的E3区片段(92.6%的E3区全序列),插入Linker-NF(内含NotⅠ、ClaⅠ、FseⅠ多克隆位点),获得重组载体质粒pPolyⅡ-CAV-2-ΔE3(NF)(31.9kb)。以AscⅠ和PmeⅠ双酶切,游离重组基因组,在脂质体LipofectamineTM2000介导下,转染MDCK细胞系,获得了E3区缺失的重组病毒CAV-2-ΔE3(NF)。通过病毒的形态学观察,血凝性、生长特性、感染性实验证明,该重组病毒与母源病毒没有差异。重组病毒CAV-2-ΔE3(NF)可以作为载体表达外源基因,其外源基因插入片段不小于3.3kb。     

人血小板因子4基因cDNA的克隆与序列测定

为研究人血小板因子4（hPF4)的生物学性能和用于肿瘤生物治疗的可能性,运用反转录聚合酶链反应（RT－PCR）从人工白血病细胞系HEL细胞总RNA中扩增出hPF4基因cDNA序列,将其克隆至pUC18载体中。序列分析证实克隆片段与献报道的hPF4基因cDNA序列完全一致,说明已成为克隆到hPF4基因cDNA。     

拟南芥中RING型E3泛素连接酶基因AtGW2的克隆和功能分析

水稻RING型E3泛素连接酶基因OsGW2在调控水稻产量性状方面起着十分重要的作用.根据OsGW2的cDNA序列,通过RT-PCR方法从拟南芥中克隆了一个与OsGW2同源的基因,命名为AtGW2.序列分析表明,该基因编码一个RING-C2型E3泛素连接酶蛋白,含有401个氨基酸.通过构建AtGW2 RNA干扰植物表达栽体并转化拟南芥,结果表明,获得的转基因后代植株的子粒较野生型大,并且转基因拟南芥子粒千粒重高于野生型,这表明AtGW2负调控拟南芥子粒大小及粒重.     

南方菜豆花叶病毒外壳蛋白基因序列的分析

用重组DNA技术及序列分析法测定了南方菜豆花叶病毒RNA基因组3′端1,000个碱基的序列,以及由此序列推导出的整个外壳蛋白的氨基酸顺序,它与巳报导的基本上一致。介绍了用DNA的寡核苷酸水解混合物作为起始引物,以3′端不含PolyA尾巴且不能加上PolyA的病毒RNA作为模板合成互补DNA,及进一步无性繁殖此cDNA的方法。     

长春和北京地区引起婴幼儿肺炎的3型与7型腺病毒的分子流行病学研究

对长春和北京地区连续12年(1976年冬至1988年春)引起小儿肺炎的3、7型腺病毒102株标本,进行了限制性内切酶核酸电泳图谱分析。56株7型腺病毒经BamHⅠ、BclⅠ、BglⅠ、XbaⅠ、SmaⅠ、HindⅢ分析后,表现为两个基因组型——Ad7 b和Ad7 d。46株3型腺病毒被Bg1 Ⅱ、BamHⅠ酶解后,表现为 3个基因组型——Ad 3Ⅰ、Ad 3Ⅱ、Ad 3Ⅲ。各基因组型的分布情况是:56株7型腺病毒中,43株为Ad 7 b(76.8％),流行于1976年冬至1986年春;13株是Ad 7 d(23.2％),出现于1982年,与Ad 7 b共同流行;1986年～1988年分析的5株病毒都是Ad 7d。43株3型腺病毒中,Ad3Ⅰ42株(91.0％),分布于12年中;Ad 3Ⅱ、Ad 3Ⅲ各2株,散在分布。此结果表明,国内这12年中引起小儿肺炎的3型腺病毒至少有3个基因组型,7型腺病毒至少有两个基因组型。Ad3Ⅰ和Ad7 b是流行优势基因组型。但自80年代初开始出现Ad7 d以来,有逐年增多的趋势,最近两年的标本又都是Ad7 d,很可能它将取代Ad7 b而成为流行的优势基因组型.     

大肠杆菌青霉素G酰化酶基因及其邻近区域的核苷酸全序列

我们由E.coli AS1.76克隆了青霉素G酰化酶的基因,并且测定了其全部核苷酸序列。青霉素G酰化酶结构基因是由下述功能片段组成的:(1)编码信号肽(26个氨基酸残基)的78个碱基对;(2)编码α-亚基(209个氨基酸残基)的627个碱基对;(3)编码间隔肽(54个氨基酸残基)的162个碱基对;(4)编码β亚基(557个氨基酸残基)的1671个碱基对。此外,我们还发现起始密码子(ATG)前有个核糖体结合位点和启动子序列以及在终止密码子(TAA)之后有个转录终止信号。与最近发表的青霉素G酰化酶基因的DNA序列比较,同源性达99.7%。     

我国分离的甲病毒YN87448毒株全部结构区基因核苷酸的序列测定及分析

ＹＮ８７４４８毒株１９８６年分离自云南傣族５２岁女发热病人的血液标本,曾用血清学方法鉴定为披膜病毒科甲病毒属。用我们创立的单引物差异ＲＴ－ＰＣＲ方法及简并引物ＴＲＴ－ＰＣＲ法均已证明：该病毒甲病毒属的辛德毕斯样病毒。本研究从甲病毒属的病毒基因序列的共同保守区,设计４对引物。     

黄瓜花叶病毒山东株(CMV-SD)RNA2全长cDNA克隆的构建及全序列分析

分别利用５’ＲＡＣＥ和３’ＲＡＣＥ确定了ＣＭＶＳＤＲＮＡ２的５’和３’末端序列,在此基础上,利用ＲＴＰＣＲ得到了ＲＮＡ２的５’端一半的ｃＤＮＡ克隆ｐＣ２５和３’端一半的ｃＤＮＡ克隆ｐＣ２３,并通过拼接构建了ＲＮＡ２全长ｃＤＮＡ克隆ｐＣ２Ｆ。通过对ｐＣ２５和ｐＣ２３进行序列测定,得到了ＲＮＡ２的全序列。序列分析结果表明ＣＭＶＳＤＲＮＡ２由３０４８ｎｔ组成,其中存在２个部分重叠的阅读框ＯＲＦ１（７９～２６５２ｎｔ）和ＯＲＦ２（２４１４～２７４６ｎｔ）,分别编码８５８ａａ的２ａ蛋白和１１１ａａ的２ｂ蛋白,并在２ａ蛋白的序列中发现了动植物病毒复制酶所特有的两个保守序列。该株系ＲＮＡ２核苷酸序列与分属ＣＭＶＩ亚组的Ｆｎｙ株系和ＩＩ亚组的Ｑ株系ＲＮＡ２的核苷酸序列同源性分别为９１７％和７５６％;２ａ蛋白的氨基酸序列同源性分别为９３８％和６７７％,２ｂ蛋白的氨基酸序列同源性分别为８３０％和５１３％。同源性比较的结果表明ＳＤ株系属于ＣＭＶＩ亚组。     

流行性出血热家鼠型病毒R22株基因组M片段3''''端核苷酸序列分析

流行于世界各地的汉坦属病毒,在抗原性、临床及流行病学特点上存在着差异。从我国家鼠型出血热流行区褐家鼠分离的R1、R22及R27株病毒,可能代表一种新的血清类型。但迄今国内外尚未见有关汉坦病毒属株间核苷酸水平比较的报道。近来我们分析了流行性出血热家鼠型病毒R22株基因组M片段的核苷酸序列。现将其部分核苷酸序列的分析结果及其     

麦穗鱼线粒体基因组序列测定及分析

利用麦穗鱼Pseudorasbora parva和相关鱼类的部分线粒体基因序列,设计出2对长批引物和30对短批引物,采用基于长PCR的2次PCR扩增法测定并注释麦穗鱼线粒体基因组全序列。结果表明,麦穗鱼线粒体基因组长16600bp,A+T含量为58.9%,37个基因位置及组成与其它硬骨鱼一致,均由13个蛋白编码基因、22个tRNA、2个rRNA基因和1个控制区(D-loop)组成。其中L链仅含8个tRNA(Pro、T yr、Ser、Ala、Asn、Cys、Glu、Gln)及ND6基因,其余基因皆由H链编码。基因排列紧密,间隔序列共计13处64bp,长度从1～32bp不等;基因重叠区7处23bp,重叠碱基数在1～7bp之间。13个蛋白编码基因中,除COI起始密码子为GTG外,其余均以ATG为起始密码子;有8个基因(ND1、ND2、COI、ATP6、ATP8、ND4L、ND5、ND6)3’端有完全的TAA或TAG终止密码子,其它5个基因终止密码子为不完整的TA(ND3和ND4)或T(COⅡ,COⅢ,Cyt b)。除tRNASer(AGY)外,其余21个tRNA基因的二级结构均为典型的三叶草结构。预测的lrRNA二级结构共有6个结构域,53个茎环结构,srRNA二级结构包含43个茎环结构。控制区(D-loop)存在3个结构区:终止序列区(TAS)、中央保守区(CSB-F、CSB-D)和保守序列区(CSB-1、CSB-2、CSB-3),其中TAS与DNA复制终止相关,出现茎环结构。     

12株猪瘟病毒E2基因主要抗原区域的序列差异分析

用RTPCR扩增了12个不同时期分离的HCV毒株E2基因主要抗原区域的cDNA片段并对其进行了序列测定。应用DNAstar序列分析软件对所测的12个HCV毒株与国内外已知的6个毒株Alfort株、Ald株、Brescia株、Gpe株、C株、CW株及早期已测定的HCLV株、HCVSM株和北京顺义株(BJSY2/96)3个毒株的相应片段进行了同源性比较分析。E2基因主要区域长度均为224 bp,包括从HCV 2485到2708位的E2基因B、C区域。所测的疫苗株HCLV与国外测得的疫苗株C株核苷酸及氨基酸同源性分别为991%和100%,表明目前应用的疫苗株是稳定的;用目前我国流行的部分野毒株对HCLV株免疫猪的攻击试验表明,HCLV对野毒株均具有很好的免疫力,这与序列分析结果相吻合。根据系统树分析,可将HCV分为两大群,5株90年代的野毒株及1株80年代的野毒株(其中北京3株、河南2株、广东1株)均与国内外C株、标准株属同一群(即第一群),其核苷酸及氨基酸的同源性分别为857%～100%和838%～100%;与Alfort株同属第二群的有6个野毒株(广西北海、辽宁、河北黄骅、吉林、深圳光明、四川成都),其中80年代与90年代的野毒株各有三株,核苷酸及氨基酸的同源性分别为843%～100%和851%～100%;21株HCV的核苷酸及氨基酸的同源性分别为781%～100%和784%～100%。两群之间的特征性差异表现在713和729位氨基酸位点的不同,经分析发现猪瘟野毒株具有复杂性与多样性。