小鼠淋巴结及胸腺T、B淋巴细胞的鉴别

本文用细胞化学ACP偶氮染色法和5′N“Gomori”染色法鉴别小鼠淋巴结及胸腺T、B淋巴细胞。测定小鼠上述淋巴组织细胞悬液样品中ACP及5′N活力所得的结果,淋巴结的ACP阳性细胞为67％左右,5′N阳性细胞为31％左右,胸腺的ACP阳性细胞为97％,5′N阳性细胞为10％。上述结果是相互符合的,也与目前已报导的小鼠及人的淋巴结和胸腺T、B淋巴细胞百分数基本符合。 文中就ACP偶氮染色法与非特异性酯酶染色法进行了比较,证明在小鼠上述淋巴组织细胞悬液中ACP阳性淋巴细胞基本上代表T淋巴细胞。 还就5′N“Gomori”法染色过程中,基质液中铅离子浓度对5′N活力的影响,ACP活力抑制剂的使用和机理以及所得出的小鼠淋巴结及胸腺中T,B淋巴细胞百分数的可靠性进行了初步讨论。 在深入研究机体细胞免疫和体液免疫以及二者的相互关系所进行免疫功能的测定方面,应用免疫学方法的报导较多,而有关细胞化学的应用则甚少,如非特异性酯酶染色法鉴别T淋巴细胞的资料(Mueller,1975;1976;Ranki,1976),以及鉴别B淋巴细胞的零星记载。M(?)ller等(1974)在人的脾(白髓)切片细胞中曾发现5′核苷酸酶(5′N)反应与EAC玫瑰花试验花瓣形成的阳性关系较好。此外在人的淋巴结切片观察中也证实了在EAC阳性区只出现5′N阳性反应(M(?)ller,1974)Uusit     

免疫磁珠法分离鼻咽癌基质的T淋巴细胞

肿瘤内环境与肿瘤的发生密切相关.肿瘤细胞周围的组织在癌变发生时不会是一个沉默的旁观者,可能在肿瘤的发生和发展中扮演十分重要的角色.本研究分别采用不同的磁珠分选技术分离T淋巴细胞.采用CK LMP1,CD105和成纤维细胞表面蛋白,结合全血总T细胞试剂盒,间接法分离鼻咽癌基质的T淋巴细胞;采用CD3直接磁分选法分离鼻咽癌基质的T淋巴细胞,然后用免疫组化法鉴定分选的效果和细胞的质量.结果表明,免疫组化显示间接磁分选法分离出来的T淋巴细胞不能完全去除肿瘤细胞,RNA的质量不佳;而直接磁分选分离出来的T淋巴细胞为纯净的T淋巴细胞,而且RNA的质量良好.提示直接磁分选技术是分离鼻咽癌基质T淋巴细胞的首选方法.     

外周血T淋巴细胞亚群流式检测方法的优化及验证

为优化外周血T淋巴细胞亚群流式检测方法,采集小鼠肝素钠抗凝血,用FITC rat anti-mouse CD3、APC rat antimouse CD4和PE rat anti-mouse CD8a荧光抗体进行染色,裂解红细胞,通过流式细胞仪检测各亚类细胞占淋巴细胞百分比。从样本体积(50μL和100μL)、FITC rat anti-mouse CD3抗体的工作浓度(1.25～40.00μg·mL^-1)、APC rat anti-mouse CD4抗体的工作浓度(0.625～20.000μg·mL^-1)、PE rat anti-mouse CD8a抗体的工作浓度(1.25～40.00μg·mL^-1)及红细胞裂解条件(时间和裂解次数)等方面对检测方法进行了优化,并验证方法的精密度(批内差异和批间差异);同时对样品4℃放置24 h、室温放置24 h、染色处理后4℃放置24 h的稳定性进行验证。结果表明,50μL抗凝血中加入终浓度1.25μg·mL^-1FITC rat anti-mouse CD3、1...     

免疫磁珠分离淋巴细胞在流式交叉配型试验中的应用及研究

目的探讨免疫磁珠快速分离法及密度梯度离心(Ficoll)分离法分离外周血单个核细胞(PBMC)在流式细胞交叉配型中的应用比较。方法取10例交叉配型供体外周抗凝血各10 ml,受体非抗凝血5 ml,分别采用密度梯度离心与免疫磁珠阴性选择试剂盒从相同体积的抗凝血中分离PBMC。用血细胞计数比较两种方法分离的WBC、PLT、RBC粒度分布和PBMC中淋巴细胞的纯度;用细胞流式和淋巴细胞表面标记荧光抗体检测两种方法分离得到的PBMC中T、B和NK细胞的数量质量;将免疫磁珠阴性分离和密度梯度离心法分离的供者PBMC与受者血清共孵育,加入羊抗人IgG-FITC,洗涤后加入抗人CD3-PE、抗人CD19-APC单克隆抗体,再用流式细胞仪检测细胞表面荧光强度。采用方差分析和t检验进行统计学分析。结果免疫磁珠阴性分离的PBMC数量是Ficoll分离PBMC的0.42倍,但淋巴细胞的比例[(99.2±0.08)﹪]高于PBMC分离的淋巴细胞比例[(82.5±5.27)﹪(t=9.91,P0.01)],且两种方法分离的PBMC中RBC分别为(0.001±0.001)×10~6/μl和(0.02±0.009)×10~6/μl(t=6.64,P0.001);血小板的数量分别为(1.00±0.05)×10~3/μl和(196.00±4.21)×10~3/μl差异均有统计学意义(t=146.46,P0.01)。流式细胞检测免疫磁珠分离的PBMC中CD3~+T细胞为(81.33±4.60)﹪,CD19~+B细胞为(8.41±0.87)﹪,CD3-CD56~+NK细胞为(9.35±0.67)﹪和CD3~+CD56~+NKT细胞为(2.47±0.07)﹪。而Ficoll分离的PBMC中CD3~+T细胞为(37.36±3.27)﹪,CD19~+B细胞为(5.79±0.94)﹪,CD56~+NK细胞为(6.60±0.91)﹪,且差异均有统计学意义(t=24.64、6.470、7.70、51.31,P均0.01)。T和B淋巴细胞流式交叉配型试验中,设门定量读取T和B淋巴细胞与受者血清中抗体结合情况,密度梯度离心获得的淋巴细胞中混有血小板等,使流式检测结果中会混有假阴性,而免疫磁珠分离法没有出现假阴性结果。证明免疫磁珠分离的PBMC可应用于临床交叉配型试验。结论免疫磁珠阴性选择分离全血PBMC,用时短,纯度高,去除了99﹪的血小板,不混有红细胞、血小板,是一种优于Ficoll分离PBMC的新方法。     

T、B淋巴细胞的凋亡及其与疾病的关系

细胞凋亡是免疫系统的一个重要的事件,它凋控着淋巴细胞的成熟、受体组分的选择及内环境的稳定。其中T、B淋巴细胞在各自的发育过程中都发生大量的细胞凋亡。Fas/FasL信号途径、NoTCH信号途径是免疫系统细胞凋亡的两条最主要的途径。此外,一些共刺激分子（如CD40）在T、B淋巴细胞存活及凋亡的选择上也发挥着重要作用。凋亡同细胞的生长、分化一样,对免疫细胞发挥正常功能是必不可少的。因此,免疫系统细胞凋亡的脱轨势必会给机体带来严重的影响,导致一系列相关疾病的发生。     

半滑舌鳎外周血T淋巴细胞的分离、鉴定及TCRβ基因免疫应答分析

为开展半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)免疫学研究提供细胞平台, 利用密度梯度离心法分离半滑舌鳎外周血淋巴细胞, 采用短期细胞培养法分离悬浮淋巴细胞, 悬浮淋巴细胞在含有0.3 μg/mL的PHA的DMEM完全培养基, 于24℃条件下可连续培养3—4d左右, 采用自制的尼龙毛柱可将悬浮淋巴细胞中的非黏附淋巴细胞和黏附淋巴细胞成功分离; 利用流式细胞仪结合特异抗体检测对非黏附淋巴细胞和黏附淋巴细胞进行鉴定, 结果表明, 非黏附细胞与鼠抗人FTIC-CD3单克隆抗体特异结合, 为T样淋巴细胞; 黏附细胞和鼠抗人FTIC-CD19单抗特异结合, 为B样淋巴细胞。T细胞表面抗原受体TCRβ基因可特异性的在非黏膜细胞中表达, 而在黏附细胞中不表达, 证明分离获得的非黏膜细胞为T淋巴细胞, 采用qRT-PCR (Quantitative Real-Time PCR)方法检测TCRβ基因表达, 结果表明, TCRβ基因在半滑舌鳎肝、脾、头肾、后肾、小肠、胃、血液、鳃、皮肤、肌肉、心脏、脑、卵巢组织中均有表达, 其中在肠、胃、脾、头肾中表达量较高; 鳗弧菌感染后TCRβ基因在肝、脾、鳃中呈现明显的上调表达, 且表达峰值出现在感染后72—96h, 表明TCRβ基因在获得性免疫应答中起重要作用。     

人体正常扁桃体和淋巴结T、B淋巴细胞亚群的研究

本文用了一系列T、B淋巴细胞单抗,用免疫细胞化学技术观察了人淋巴结和扁桃体内T,B淋巴细胞及其亚群。T细胞及其亚群主要位于滤泡间的副皮质。此外在淋巴结髓质也有一定数量的T细胞亚群的分布;次级滤泡生发中心也常出现辅助T或Leu 4阳性T细胞。B淋巴细胞及其亚群多集中在初级和次级滤泡,如OKB_2和BA 1阳性细胞多集中于次级滤泡的帽状区,而IgM主要位于次级滤泡的生发中心。LN-2抗体选择性地与生发中心??和帽状区的B细胞的核膜起反应,是研究B细胞表型的一种重要试剂。     

重组人可溶性B淋巴细胞刺激因子及其突变体的克隆、表达及活性测定

采用RT PCR方法从人外周血白细胞总RNA中钓取人可溶性B淋巴细胞刺激因子 (humansolubleBlym phocytestimulator,hsBLyS)的cDNA片段 ,再运用基因重组手段 ,利用通用型质粒pBV2 2 0构建表达载体pBV2 2 0 /hsBLyS。经测序鉴定后 ,以之为模板使用重叠PCR法扩增得到hsBLyS的两个点突变体hsBY A(Cys14 6→Ala14 6)和hsBY V (Cys14 6→Val14 6)的基因片段 ,构建表达载体 pBV2 2 0 /hsBY A及 pBV2 2 0 /hsBY V。经测序无误后 ,将上述 3种载体分别转化大肠杆菌DH5α并诱导重组蛋白质表达 ,薄层扫描结果显示 3种蛋白质在DH5α中表达量都在 2 0 %～ 30 %之间。再分别运用变性、凝胶过滤层析及复性等手段纯化目的蛋白质 ,最后通过B淋巴细胞增殖实验检测纯化产物促人B细胞增殖的活性。实验结果表明 ,3种重组蛋白质都能明显刺激人B细胞增殖 ;统计学检验显示 ,突变体rhsBY V较野生型rhsBLyS的促人B淋巴细胞增殖活性显著增强。     

关于法氏囊内T细胞及腔淋巴细胞的研究

本实验表明,法氏囊内存在一个T淋巴细胞弥散渗透区(DIA),在初生雏鸡中开始形成,一月半发育完善,同样在ISE(滤泡间上皮)上皮层内亦存在少量的弥散T淋巴细胞,上述淋巴细胞与腔淋巴细胞,形态结构极为相似。酯酶活性反应均显示T细胞型。 另外初生雏鸡切除胸腺,不仅影响DIA的发育而且影响滤泡的发育。     

一株白芍内生放线菌的分离、活性及系统发育分析

目的:分离白芍中拮抗农作物致病菌和人类常见病原菌的内生放线菌,并进行系统发育分析。方法:采用3种分离培养基,从白芍根部分离内生放线菌;通过滤纸片法筛选具有拮抗活性的菌株,观察菌丝形态,并进行16S rDNA序列系统发育分析。结果:从白芍中分离得到16株内生放线菌,其中从FYSCA培养基中分离到9株;16株内生放线菌中有6株具有拮抗作用,菌株S-BS033004对5种病原菌有拮抗活性,尤其是对棉花黄萎病菌和小孢拟盘多毛孢菌和耐青霉素类金黄色葡萄球菌的拮抗作用显著,抑菌圈≥20mm。经16S rDNA系统发育分析表明该菌株与Streptomyces anulatus NBRC13369T等6株链霉菌模式菌株亲缘关系较近,相似性均为99.7%。结论:白芍内生放线菌S-BS033004是一株杀菌谱较广的链霉菌,具有很好的开发潜力。     

海底沉积物中几丁质酶的筛选、分离及活性分析

目的:从海底沉积物中筛选得到一株几丁质酶活性较高的菌株,分离纯化菌株分泌的几丁质酶,并对其活性进行酶学分析。方法:以中国南海北部湾的沉积物为样本,结合透明圈法及DNS法筛选菌株。采用几丁质结合能力分析及多种层析方法分离纯化菌株分泌的几丁质酶,对其中一种几丁质酶进行酶学性质分析。结果:共筛选获得21株几丁质酶产生菌,其中分泌的几丁质酶活性最高的为蜡样芽孢杆菌B04(Bacillus cereus strain B04)。发现该菌共分泌6种含有几丁质结合域的蛋白。从蜡样芽孢杆菌B04发酵液中,分离纯化得到分子量为36 k Da的几丁质酶。研究发现,该酶是蜡样芽孢杆菌B04的一种主要的几丁质酶,其最适p H为4.0,最适反应温度为60℃,在p H 3.0~10.0范围内活性稳定,Co2+对其活力有明显促进作用,Ag+有显著的抑制作用。结论:为几丁质酶的工业化应用提供了基础。     

海洋生物共附生真菌的分离、鉴定及抗菌活性分析

对海南文昌海域采集的海草、海绵和石珊瑚的共附生真菌进行分离、鉴定及抗菌活性分析。采用3种分离培养基分离海草、海绵和石珊瑚的共附生真菌,利用ITS序列分析对分离的真菌进行鉴定,采用滤纸片扩散法对分离真菌的发酵产物进行抗菌活性分析。结果从10种海草、9种海绵和11种石珊瑚中共获得113株真菌。ITS序列分析初步确定了32株独立菌株的分类地位,归属于3个门(子囊菌门、担子菌门和半知菌门),8个目和10个属,其中子囊菌门所占比例最高为58.82%,半知菌门次之为32.35%,担子菌门最少为8.83%;抗菌活性测试显示12株真菌的发酵产物对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌具有较强的抗菌活性。初步揭示了海南文昌海域海草、海绵和石珊瑚的共附生真菌的多样性以及其发酵产物的抗菌活性。     

羊肚菌多糖提取、分离纯化及免疫调节活性

对羊肚菌多糖的结构和免疫调节活性进行初步探究,采用热水浸提法提取羊肚菌粗多糖,DEAE纤维素柱层析法对粗多糖进行分离纯化,CCK-8法检测羊肚菌多糖免疫调节能力。结果显示:分离纯化后的羊肚菌多糖(ME-X)重均分子量为1. 635×10~4。ME-X能显著提高免疫细胞增殖能力,当其质量浓度为10μg/mL时,淋巴细胞T、B的增殖效果最佳,增殖率分别达到31. 18%、63. 02%;质量浓度为20μg/mL时,巨噬细胞增殖效果最好,增殖率高达63. 12%,同时该浓度值的ME-X刺激巨噬细胞吞噬中性红能力也最强,吞噬率为22. 49%。ME-X的活性探究实验表明,ME-X能有效促进免疫细胞增殖,同时能显著促进巨噬细胞的吞噬作用。     

中国三黄鸡可溶性B淋巴细胞刺激因子基因的克隆、表达和活性研究

通过逆转录-聚合酶链式反应,从中国三黄鸡脾组织细胞中扩增得到459bp的鸡可溶性B淋巴细胞刺激因子(CycsBAFF)基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3)后高效表达了带有His6标签的包涵体形式重组蛋白,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫转印检测鉴定。表达产物经Ni2 -NTA纯化后,经透析复性得到活性目的蛋白,通过单独刺激以及与PMA共刺激体外培养的鸡法氏囊B细胞,均有明显的促法氏囊B细胞存活的效应。     

不同失水状态发菜类囊体膜蛋白的分离及鉴定

采用液氮研磨与超声波破碎相结合的方法,破碎不同失水状态的发菜藻体和细胞,用差速离心法制备发菜类囊体膜粗制品,蔗糖密度梯度高速离心纯化类囊体膜,SDS-PAGE电泳分离类囊体膜蛋白,并对膜蛋白进行了MALDI-TOF-TOF/MS质谱分析和鉴定。结果表明:(1)充分吸胀4h后失水6h的发菜(含水量51.2%)和失水24h的发菜(含水量14.9%),经过多步差速离心后再进行蔗糖密度梯度高速离心,可得到纯化的类囊体膜。(2)发菜类囊体膜蛋白SDS-PAGE电泳分离到14个条带,共鉴定出8种蛋白,根据其功能可分为4类——光合作用相关蛋白(光系统Ⅱ锰稳定蛋白PsbO,F1F0 ATP合成酶α亚基和β亚基)、结构域蛋白、选择性通道蛋白OprB、未知蛋白(hypothetical protein Npun_R1321、Npun_R3785、N9414_02186),它们在发菜的光合作用中具有重要作用。     

骆驼刺内生菌分离及代谢物活性成分分析

采用研磨法首次从新疆药用植物骆驼刺茎和叶等组织中分离得到20株内生菌并从中筛选出一株对作物致病菌的拮抗活性最强的内生菌XJAS-AB-11。通过形态学观察,生理生化特征以及16SrDNA序列分析最终将菌株XJAS-AB-11初步鉴定为枯草芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。进一步对该拮抗菌株进行扩大培养,对其代谢产物进行初步研究,经硅胶柱色谱及TLC从具有抑菌作用的活性部位分离出活性单体C2和H2-2。紫外光谱、核磁共振氢谱及质谱分析证明化合物C2和H2-2均属于黄酮类化合物。研究表明,骆驼刺植物内生菌中蕴藏着较丰富的抗菌活性物质,是开发天然抗菌药物的潜在资源。     

用Epstein-Barr病毒转化法获得分泌肾综合征出血热病毒抗体的B淋巴细胞系

人B淋巴细胞膜上带有Epstein-Barr(EB)病毒受体,用EB病毒转化人B淋巴细胞是获得人源性单克隆抗体的重要方法之一。最近David等报道,先用EB病毒转化感染巨细胞病毒(CMV)患者的脾脏B淋巴细胞,再将转化了的B淋巴细胞和人骨髓瘤细胞WL-L_2-727融合,获得迄今为止分泌抗体滴度最高的人—人杂交瘤312A和914,能稳定分泌抗体达12     

异型流感病毒感染相关T淋巴细胞增殖活性及IFN-γ阳性Ｔ淋巴细胞水平研究

为探讨机体异型流感病毒间交叉保护作用机制,将实验动物随机分成实验组和对照组,测定异型流感病毒感染后病毒载量,T淋巴细胞增殖活性和IFN-γ阳性CD3＋CD8＋及CD3＋CD4＋淋巴细胞水平的变化。结果显示,异型流感病毒感染后产生的交叉免疫应答反应可能与T淋巴细胞增殖有关;与CTL及Th1类淋巴细胞水平相关,并有时间限制性;IL-2可以加强异型流感病毒感染后IFN-γ阳性CD3＋CD8＋淋巴细胞水平。本研究为制备能够抵御变异流感病毒感染的疫苗提供了理论基础。     

野葛内生真菌的分离、鉴定及体外细胞毒活性

目的:药用植物内生真菌是一类重要的微生物资源,其代谢产物有着广泛的生物学活性。该研究拟从野葛(Pueraria lobata(Willd.)Ohwi)中分离有细胞毒活性的内生真菌。方法:组织块改良法分离内生真菌;细胞毒活性测定采用Alamar blue法;结合形态学和分子生物学方法进行菌种鉴定。结果:获得的34株内生真菌中菌株KLBMP f0027对HepG2、HO-8910、NCI-H460、SGC-7901等细胞株均有显著活性,ID50分别为437.4、460.0、542.5、771.2。而且活性产物相对稳定,对温度、pH变化及蛋白酶不敏感。代谢过程研究显示菌株KLBMP f0027的活性产物合成与细胞生长属于部分耦联关系类型。形态学和ITS-rDNA序列分析鉴定菌株为Aspergillus ostianus strain KLBMP f0027。结论:野葛内生真菌A.ostianus strain KLBMP f0027可作为细胞毒活性候选菌株进行深入研究。     

皱皮木瓜多糖的分离、纯化及抗氧化活性研究

为了研究木瓜多糖的提取、分离、纯化与抗氧化活性,采用水提醇沉法提取皱皮木瓜中的多糖,得多糖Ⅰ;利用Sevag法除去多糖中的蛋白质后得多糖Ⅱ;以30%H_2O_2脱除色素后再次醇沉得到精制多糖Ⅲ;透析除去小分子后利用AB-8大孔树脂进行分离以水、30%、50%、70%和95%乙醇洗脱,其中水洗脱部分多糖为Ⅳ。用苯酚-硫酸法测定多糖含量。多糖Ⅰ得率为9.83%,多糖含量(纯度,下同)为64.45%;脱蛋白后多糖Ⅱ中多糖含量为78.23%;经脱色后多糖Ⅲ含量达88.39%;大孔树脂水洗脱部分多糖Ⅳ含量为89.74%。以DPPH(2,2-二苯基-1-苦肼基)清除率和Fe~(3+)还原力方法测定木瓜多糖的抗氧化活性,木瓜多糖均体现出一定的抗氧化作用,呈浓度依赖性增强,其中多糖Ⅰ、Ⅱ表现出更好的作用。