菊叶薯蓣DcPMK基因克隆及互作蛋白筛选

以菊叶薯蓣为研究材料,采用RT-PCR技术克隆获得DcPMK基因,进行生物信息学、组织特异性和诱导表达分析,并构建DcPMK的诱饵载体以筛选拟南芥酵母文库中互作蛋白,为深入研究菊叶薯蓣萜类物质的合成积累提供一定理论基础。结果表明：DcPMK基因开放阅读框大小为1 536 bp(GenBank登录号MZ171241),编码511个氨基酸。蛋白质序列比对分析发现DcPMK与近源种基因序列一致性达88.85%,具有1个保守的ATP结合位点Gly-X-Gly-XX-Ala。N-J进化树显示DcPMK与海枣（Phoenix dactylifera）等单子叶植物的遗传距离较近。HPLC结果显示菊叶薯蓣皂素主要在根茎中积累,qRT-PCR结果表明DcPMK基因在各组织中均有表达,在老茎中表达量最高,根茎中表达量最低;水杨酸诱导后皂素含量的变化与DcPMK表达量的变化趋势吻合：随着叶片中皂素含量提高,DcPMK上调表达。与阴性对照相比,DcPMK基因没有自激活性和细胞毒性,并筛选到27个互作明显的拟南芥基因,如生长发育相关基因AtKCR1(AT1G67730)、AtRPS9M(AT3G49080)、A...     

绿竹SEP3-like蛋白表达纯化以及不同结构域互作研究

在双子叶植物中,SEPALLATA3(SEP3)参与生殖生长的很多方面,包括花分生组织和花器官的形成。但是在单子叶植物中,花器官形成的分子机制还不清楚。为了揭示单子叶植物中SEP3蛋白的结构以及聚合体的形成与生物学功能的关系,以单子叶植物绿竹Bambusa oldhami为材料,构建绿竹SEP3(BoSEP3)蛋白不同结构域原核表达载体,在大肠杆菌中进行重组蛋白诱导表达,获得不同结构域的可溶蛋白,通过镍柱及分子筛分离纯化表明,BoSEP3蛋白K结构域以四聚体形式存在;同时构建BoSEP3蛋白不同结构域的酵母表达载体,通过酵母双杂交系统检验BoSEP3蛋白同源互作表明,K结构域有参与形成多聚体的功能。实验提供了一套表达纯化BoSEP3蛋白以及检验蛋白质互作的有效方案,为开展BoSEP3蛋白功能和结构生物学研究奠定了基础。     

茶树硝酸盐转运蛋白基因的克隆和表达分析

硝酸盐转运蛋白（NRT）是植物吸收和利用硝态氮的一种关键蛋白。运用RACE技术从茶树中扩增出NRT基因的cDNA,并利用实时荧光定量PCR检测了CsNRT基因在不同茶树器官与品种之间的差异表达。结果表明：CsNRT基因的cDNA全长2 061 bp,开放阅读框为1 818 bp,编码含由605个氨基酸组成的蛋白质,GenBank登录号为KJ160503,属于NRT2基因家族。CsNRT为组成型基因,对不同处理的水培茶苗进行定量表达分析显示,该基因在根、茎、叶中都有表达,其中在根部的表达水平最高,1.0 mmol·L-1的NO3-可诱导其表达量上升7.53倍。不同茶树品种中CsNRT基因的表达也有较大差异,‘龙井长叶’和‘凫早2号’的表达量较高,前者强烈响应0.5和1.0 mmol·L-1 NO3-的诱导,后者的响应浓度为1.0和2.0mmol·L-1,而‘舒茶早’在各浓度下的表达差异不明显。     

茶树花发育MADS-box转录因子CsGLO1、CsGLO2与CsAG之间的互作关系研究

利用酵母双杂交方法和双分子荧光互补技术（BiFC）研究了茶树（Camellia sinensis（L.）O.Kuntze）花发育MADS-box的B类转录因子CsGLO1、CsGLO2与C类转录因子CsAG间的互作关系及其可能发生互作的亚细胞定位。通过构建5个酵母表达载体,利用酵母单杂交实验检测了3个蛋白的转录激活活性,并通过酵母双杂交实验分析了蛋白间的互作关系。结果显示,3个蛋白均无转录激活活性,且两两之间可发生相互作用。进一步构建6个BiFC表达载体,采用压力注射法瞬时浸染烟草（Nicotiana benthamiana L.）叶表皮细胞,并利用激光共聚焦显微镜观察荧光信号,结果表明茶树B类CsGLO与C类CsAG蛋白可在植物活细胞内形成同源和异源二聚体,并具有在细胞质中发生互作的特定模式。本研究可为利用分子生物学技术抑制茶树“花果同现”现象提供理论依据。     

霍乱弧菌ToxS蛋白间的互作增强ToxR蛋白诱导毒力基因的表达

【目的】阐明霍乱弧菌ToxR蛋白功能调控的分子机制。【方法】利用巯基捕获(thiol-trapping)的方法分析DsbA蛋白对ToxR周质空间结构域半胱氨酸残基的氧化作用;采用定点突变的方法构建ToxR半胱氨酸突变株(ToxR_(C236/293S));利用荧光素酶基因作为报告基因分析ToxR野生型(ToxR_(wt))和半胱氨酸突变体(ToxR_(C236/293S))诱导下游基因表达的活性;通过细菌双杂交系统分析ToxR_(wt)和ToxR_(C236/293S)蛋白之间、ToxR与ToxS之间以及ToxS之间的相互作用。【结果】ToxR周质空间结构域半胱氨酸残基确实可以被DsbA蛋白氧化,且当ToxR与ToxS共表达时,ToxR诱导ctxAB转录表达的活性显著增强,且在dsbA基因缺失突变株中ToxR诱导ctxAB转录表达的活性更高;成功构建株霍乱弧菌ToxR半胱氨酸突变株(ToxR_(C236/293S)),在没有ToxS存在的条件下,ToxR_(C236/293S)诱导毒力基因表达的活性与ToxRwt相当;细菌双杂交系统分析发现当ToxR与ToxS共转录表达时,ToxS极大增强ToxR蛋白之间的互作;在dsbA基因缺失突变株中,ToxS之间的相互作用显著增强。【结论】ToxR蛋白本身的氧还状态对其诱导毒力基因表达的活性没有影响;ToxS通过增强ToxR形成二聚体的能力从而增强其诱导毒力基因的表达,而DsbA对ToxS蛋白之间的相互作用具有抑制作用,DsbA通过影响ToxS的蛋白互作从而影响ToxR蛋白的功能。本文为进一步阐明霍乱弧菌毒力基因表达调控的分子机制提供重要的理论依据。     

生物信息学分析人类病毒互作广谱蛋白的特征

了解病毒与人类蛋白的相互作用对于理解病毒感染宿主机制非常重要,已有研究主要集中在病毒如何进入宿主细胞、复制、扩散和致病等方向上,对病毒与人类蛋白的相互作用模式缺乏系统研究。本研究中我们构建了迄今为止最全面的病毒与人类之间的蛋白相互作用网络,涵盖来自218种病毒的1 674种蛋白与来自人类的13 724种蛋白的108 832对蛋白相互作用;在此基础上鉴定出109个至少与12种病毒家族存在蛋白相互作用的人类蛋白,定义为人类的病毒互作广谱蛋白（简称广谱蛋白）;从结构、功能、蛋白互作网络以及组织表达量等四个方面系统地分析了广谱蛋白的特征,发现广谱蛋白相较于非广谱蛋白以及其它人类蛋白具有更密集的转角结构、更多的结构域、更高的网络中心度和组织表达量,表明它们可能在病毒感染宿主过程中起着重要作用。本研究有助于加深我们对于病毒感染人类模式的理解,同时也对进一步探究病毒与疾病之间的关联有一定的帮助。     

水稻锌指蛋白ZFP36互作蛋白的筛选及互作蛋白基因表达

C₂H₂类型的锌指蛋白转录因子在植物生长发育和应对逆境胁迫中发挥重要作用。水稻(Oryza sativa L.)中,一种C₂H₂类型的锌指蛋白ZFP36(zinc finger protein 36)是脱落酸(abscisic acid, ABA)介导的细胞信号转导中的重要组分。为了研究水稻ZFP36在ABA介导的细胞信号转导中作用机制,本研究采用酵母双杂交系统,将ZFP36作为诱饵蛋白,通过筛选经ABA诱导的水稻叶片获得的酵母文库,筛选出59个阳性克隆。进一步通过酵母双杂交(yeast two-hybrid system, Y2H)和萤火虫荧光素酶互补成像(firefly luciferase complementary imaging, LCI)系统,最终获得4个与ZFP36互作的蛋白,包括OsAE7(asymmetric leaves1/2 enhancer 7)、OsDjC46(heat shock protein)、OsDIP1(R3H domain containing protein)...     

猪δ冠状病毒核衣壳蛋白互作的蛋白鉴定及分析

初步筛选与鉴定PDCoV N蛋白的宿主互作蛋白.利用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,CO-IP)和LC-MS/MS质谱技术筛选出PDCoVN蛋白的宿主互作蛋白,并进行生物信息学分析,再利用免疫共沉淀进行鉴定.通过免疫共沉淀产物的SDS-PAGE分析发现在40 kD和100 kD左右有明显的差异蛋白条带,通过质谱筛选到了68个与PDCoVN蛋白互作的宿主蛋白,并做了GO、COG和KEGG注释,挑选出2个候选互作蛋白,经过免疫共沉淀验证,PDCoVN蛋白与TUBB2B存在互作关系.该研究为进一步探索PDCoV N蛋白在病毒感染细胞时的作用提供了新方向.     

茶树水通道蛋白基因的克隆与表达分析

从茶树中克隆了6个水通道蛋白(aquaporin,AQP)基因的cDNA全长序列,根据序列相似性和系统进化分析结果,分别命名为CsNIP1;1、CsNIP5;1、CsPIP2;1、CsPIP2;2、CsTIP1;1和CsTIP2;2。氨基酸序列特征分析表明,6个基因的编码氨基酸序列长度在250~301个氨基酸残基,分子量在25.186~30.728kD之间;均为疏水性蛋白,并都含有6个跨膜螺旋;6个基因均含有MIP蛋白家族的特征序列HF/I/VNPA/SI/L/VTI/FA/G和NPA(Asn-Pro-Ala)基序,以及类似沙漏状的跨膜三级结构。荧光定量PCR分析显示:这6个基因在根、茎、叶和花中均表达,且在根中的表达水平最高,表明它们与茶树根系的物质转运密切相关;CsAQPs基因的表达受ABA、高盐、干旱和低温胁迫的调控,表明它们可能参与茶树抗逆响应。     

基于蛋白互作网络识别非小细胞肺癌相关基因功能模块

本研究对非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)基因表达数据进行差异表达分析,并与蛋白质相互作用网络(PPIN)数据进行整合,进一步利用Heinz搜索算法识别NSCLC相关的基因功能模块,并对模块中的基因进行功能(GO term)和通路(KEGG)富集分析,旨在探究肺癌发病分子机制。蛋白互作网络分析得到一个包含96个基因和117个相互作用的功能模块,以及8个对NSCLC的发生和发展起到关键作用候选基因标志物。富集分析结果表明,这些基因主要富集于基因转录催化及染色质调控等生物学过程,并在基础转录因子、黏着连接、细胞周期、Wnt信号通路及HTLV-Ⅰ感染等生物学通路中发挥重要作用。本研究对非小细胞肺癌相关的基因和生物学通路进行预测,可用于肺癌的早期诊断和早期治疗,以降低肺癌死亡率。     

茶树DELLA基因家族的鉴定及表达分析

利用生物信息学方法,从茶树（Camellia sinensis（L.）O.Ktze.）全基因组数据库中分析获得DELLA蛋白的家族成员,并对它们的系统进化关系、蛋白序列特征、基因表达特异性及其与茶树次生代谢物的相关性进行分析。结果显示：茶树基因组中共有5个DELLA基因,分别为：TEA009882（CsGAI）、TEA022818（CsRGA1）、TEA010112（CsRGL1）、TEA008736（CsRGL2）和TEA020933（CsRGL3）;其编码的氨基酸数量在525~594之间,均定位于细胞核。该蛋白的二级和三级结构分析结果表明,茶树DELLA蛋白结构中含有大量的α螺旋及少量β转角结构。蛋白保守结构域分析结果显示该蛋白与拟南芥（Arabidopsis thaliana（L.）Heynh.）具有高度的同源性,均具有GRAS、DELLA等保守结构域。基因的表达特异性分析结果表明,在茶树不同组织部位中,TEA009882、TEA022818和TEA010112基因的表达量均较高,而TEA020933和TEA008736的表达量在各组织中均较低;茶树DELLA基因的表达受到干旱、NaCl、低温及茉莉酸甲酯等非生物逆境胁迫的调控,且其表达量与茶树次生代谢物的积累间存在相关性。推测茶树DELLA基因广泛参与了茶树生长发育及非生物逆境胁迫的响应,以及对次生代谢物生物合成过程的调控。     

白桦开花抑制因子BpFLC与BpSVP蛋白互作的结构域筛选与互作验证

为深入研究白桦开花抑制因子FLC与SVP的相互作用的分子机理。从重组质粒pGBKT7-BpFLC、pGBKT7-BpSVP分别克隆出6个BpFLC截短体（BpFLC1~6）和6个BpSVP截短体（BpSVP1~6）,分别编码MI、MIK、K、IKC、KC和C域。在酵母Y2HGold菌中,分别共转诱饵质粒pGBKT7-BpFLC1~6×pGADT7-BpSVP及pGBKT7-BpFLC×pGADT7-BpSVP1~6。酵母转化子Y2HGold［pGBKT7-BpFLC2~5×pGADT7-BpSVP］,可在选择性固体培养基TDO、QTO/A上生长,并在QDO/A/X上长出蓝色菌落,表明BpSVP能与截短体蛋白BpFLC2~5异源结合。此外酵母Y2HGold［pGBKT7-BpFLC×pGADT7-BpSVP2~5］也能同时激活报告基因AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1。进一步研究发现：Y2HGold［pGBKT7-BpFLC3×pGADT7-BpSVP3］存在相互作用,表明BpFLC的K域与BpSVP的K域能够异源结合,是介导BpFLC与BpVP蛋白互作的关键结构域。     

基于共表达网络和蛋白互作分析挖掘小麦赤霉病抗性相关核心蛋白

高通量蛋白组学技术能够鉴定小麦特定组织的蛋白表达水平,对小麦穗轴混池蛋白组学分析得到的632个差异表达蛋白数据进行共表达网络分析,同时筛选显著表达模块进行蛋白质互作分析,以期挖掘出与小麦赤霉病抗性相关的蛋白。WGCNA分析结果共构建了12个表达模块,其中模块6与赤霉病抗病呈极显著相关,模块8显著相关。蛋白互作网络分析筛选到7个候选蛋白,分别为参与毒素降解的GST （glutathione S?transferase）和AdoMet?MTase（S?adenosylmethionine?dependent methyltransferase）,参与光合作用的IM30（membrane?associated 30 Da, chloroplastic）、PnsL2（photosynthetic NDH subcomplex L 2）和PPL1（PsbP?like protein 1）,以及抗逆相关的UCHL（ubiquitin carboxyl?terminal hydrolase）和MetAP2（methionine aminopeptidase 2）。这些蛋白可能在赤霉病抗、感病响应中具有重要作用,值得进一步研究。     

白化和黄化茶树品种绿茶游离氨基酸、儿茶素类及咖啡碱差异分析

为探究以白化和黄化茶树品种鲜叶为原料制成的绿茶滋味品质和代谢物差异,对广德市6个白化品种绿茶(奶白茶)和14个黄化品种绿茶(黄金芽茶)进行感官审评和代谢物分析。结果表明,奶白茶滋味鲜爽而收敛性略弱;黄金芽茶滋味收敛性强而鲜度低于奶白茶。游离氨基酸总量以及呈现鲜味、甜味的游离氨基酸在奶白茶中的含量显著高于黄金芽茶,而贡献收敛性的儿茶素类化合物和没食子酸含量以及呈现苦味的咖啡碱含量在奶白茶中显著低于黄金芽茶。偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)表明导致两种绿茶滋味差异的标志性化合物有7种,分别是茶氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯和咖啡碱。味觉活性值(Dot)最高的EGCG在黄金芽茶中的呈味贡献显著高于奶白茶。因此,游离氨基酸、儿茶素类化合物、没食子酸和咖啡碱含量差异导致白化和黄化茶树品种绿茶滋味不同。     

茶树CsCML24的克隆及表达分析

类钙调素(calmodulin-like protein,CML)是植物体内一类钙受体蛋白,介导Ca²⁺与下游靶蛋白的相互作用,在植物抗逆反应中发挥重要作用。探究茶树中CML蛋白在逆境胁迫中的功能,为进一步研究茶树CsCML24对逆境胁迫的响应机理提供理论依据。以龙井43一年生茶树扦插苗为材料,克隆得到类钙调蛋白基因CsCML24(GenBank登录号为MZ325391),并进行了生物信息学分析。同时,利用实时荧光定量PCR技术分析茶树CsCML24组织表达特异性以及不同非生物胁迫处理下的表达模式。结果显示,CsCML24的CDS长为480 bp,编码159个氨基酸。CsCML24为无信号肽及跨膜结构的稳定性亲水蛋白,含有EF-hand保守结构域,能与Ca²⁺结合。qRT-PCR表明,CsCML24在茶树各组织中均表达,在成熟叶的表达量显著高于其他组织,茎中表达量较低;该基因在低温(10℃)、干旱(20% PEG 6000)、高盐胁迫(200 mmol/L NaCl)和ABA(100 μmol/L)处理均能诱导表达,且在不同胁迫下表达差异显著...     

茶树脯氨酸转运蛋白基因鉴定及表达分析

脯氨酸转运蛋白在植物体内脯氨酸的分配及响应多种非生物逆境胁迫过程中发挥着重要作用。为明确茶树体内脯氨酸转运蛋白家族情况,该研究从全基因组水平鉴定获得茶树脯氨酸转运蛋白家族成员,进行了系统进化关系、蛋白结构、基因表达特异性等分析。结果表明:(1)茶树中有6个脯氨酸转运蛋白基因,长度为1 326～1 725 bp之间,编码氨基酸数目在441～574 aa之间,蛋白质分子质量在48.5～63.0 kD之间,等电点为8.51～9.41,大部分为碱性蛋白,其结构中含有大量的α-螺旋和自由卷曲,少量的延长链和β-转角结构。(2)亚细胞定位分析结果显示,茶树CsProT1、CsProT2、CsProT4、CsProT5和CsProT6蛋白定位于细胞膜,CsProT3蛋白则定位于高尔基体。(3)CsProTs蛋白中含9～11个典型的跨膜结构域,其三级结构与保守基序特征均与拟南芥高度相似,具有高度的保守性,不同成员间氨基酸序列相似性达40.14%。(4)基因表达特异性分析显示,CsProT1,CsProT2和CsProT3基因在各个组织部位的表达量均较高,CsProT4、CsProT5和CsProT6表达量均较低,且CsProT1基因的表达量最高;除CsProT5基因外,CsProTs蛋白家族的基因均受到NaCl、干旱及冷胁迫的诱导表达。(5)蛋白相互作用分析结果显示,CsProTs蛋白可与脯氨酸氧化酶ERD5,脯氨酸生物合成限速酶P5CS1、P5CS2和δ-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶ALDH12A1等脯氨酸合成,转运及降解有关的蛋白相互作用,共同调控茶树体内脯氨酸的含量。研究认为,茶树6个CsProTs蛋白可共同参与茶树体内脯氨酸的转运平衡及对多种非生物逆境胁迫响应的过程。     

蛋白磷酸化修饰在植物-病原微生物互作中的作用研究进展

蛋白磷酸化修饰是植物细胞信号调控的普遍机制。植物-病原微生物互作过程中, 关键调控蛋白的磷酸化状态影响免疫信号的激活。多种病原微生物通过干扰宿主蛋白的磷酸化状态攻击免疫系统, 以提高致病性。该文对植物免疫调控过程中关键元件的磷酸化修饰及其在免疫信号中的调控作用进行了综述。研究植物-病原菌互作过程中关键蛋白的磷酸化修饰, 有助于深入探讨植物-病原微生物互作的分子机理。该文将为寻找广谱抗病的新途径提供理论依据。     

高羊茅FaFT基因表达、蛋白互作及生物学功能分析

FLOWERING LOCUS T(FT)对植物开花有重要的调控作用.为探索高羊茅FaFT基因的生物学功能,从前期高羊茅转录组中克隆得到FaFT基因.qRT-PCR分析表明FaFT基因在长日照、短日照、连续光照、连续黑暗、昼夜颠倒和长日照下不同发育阶段都保持一定的昼夜节律并受光周期的调控.亚细胞定位显示FaFT基因编码...     

拟态弧菌OmpU蛋白在草鱼肠组织中互作蛋白的筛选鉴定

【目的】为了确定草鱼肠组织蛋白中能与拟态弧菌OmpU黏附素蛋白发生互作的蛋白。【方法】在前期构建重组表达质粒pET-32a-OmpU基础上,通过IPTG诱导表达及亲和层析纯化获得可溶性His-OmpU融合蛋白,经Western blot分析显示该重组融合蛋白与OmpU多克隆抗体具有良好的反应原性。以His-OmpU融合蛋白为诱饵蛋白,利用His-tag pull down试验筛选草鱼肠组织蛋白中与OmpU黏附素蛋白结合的蛋白,并经SDS-PAGE分离、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)鉴定以及Mascot与蛋白数据库检索。【结果】共鉴定出5个体外互作蛋白,分别为α-肌动蛋白2(α-Actin 2)、细丝蛋白A(Filamin A)、α-辅肌动蛋白4(α-Actinin 4)、转胶蛋白2(又称肌动蛋白结合蛋白2,Transgelin-2)和调宁蛋白2(Calponin-2)。【结论】GO功能注释分析显示,这些互作蛋白属于细胞骨架蛋白和细胞骨架调节蛋白,在病原菌的黏附、内化和致病中起着重要作用。研究结果为后期研制黏附拮抗剂和探究拟态弧菌分子致病机理奠定了基础。