高粱株高相关基因SbPH11分子标记的开发和应用

生物量是饲用高粱的重要性状,株高与生物量呈正相关性。本研究以237份高粱自交系关联群体为材料,筛选到株高关联基因SbPH11的两个功能性SNP位点,两个SNP位点组合的单倍型共3种：SbPH11-Hap1、SbPH11-Hap2和SbPH11-Hap3,SbPH11-Hap2所对应的高粱材料的株高极显著高于SbPH11-Hap1和SbPH11-Hap3所对应的高粱材料的株高,SbPH11-Hap1的高粱材料株高极显著高于SbPH11-Hap3的高粱材料株高。针对SbPH11的两个功能性SNP位点开发了KASP分子标记,利用该标记对30份高粱种质资源进行了基因分型和表型验证,结果证实开发的KASP分子标记可以准确地鉴定出SbPH11两个功能性SNP位点的基因型。该KASP分子标记可高效准确地预测不同高粱种质资源的株高类型,可应用于高粱株高的早期筛选和分子标记辅助选择育种。     

高通量基因型分型技术及其在水稻中的应用

作物种质资源遗传基础的深入认识与高效利用,对于品种改良和粮食安全具有重要意义。传统系谱考察的方法对指导育种实践发挥了重要作用,随着分子生物学的发展,基因组学和高通量SNP分子标记等基因型分型方法可以更便捷地对种质资源进行鉴定。就基因型分型的主要方法进行了总结,重点论述了以SNP为核心的下一代高通量测序(NGS)分型方法、竞争性等位基因特异性PCR(KASP)和SNP芯片系统,以及当前主流的SNP分析工具和数据库。同时,介绍了高通量SNP分型技术在水稻研究中的进展,并就分型技术在作物育种等领域的应用和发展趋势进行了展望。     

油棕种壳厚度控制基因SHELL的SNP分子标记开发

油棕属棕榈科多年生木本油料作物,果实含油量高达50%,且单位面积产油量高,享有"世界油王"美誉。油棕果实由外果皮、中果皮、内果皮(种壳)、种子四个部分组成,产油部分主要是中果皮和种子,其中种壳厚度是影响果实含油量的重要因素。SHELL基因控制种壳厚度,是一类MADS-box同源基因,SHELL基因在厚壳种和无壳种中的变异主要是第一个外显子上的两个SNP位点。该研究根据两个SNP位点进行特异标记开发,根据已知的油棕SHELL基因的序列,设计了4对SNP引物。4对SNP引物以2个SNP位点设计,每个SNP位点设计2对SNP标记,并均在引物3'端第二位引入强错配碱基。以2份薄壳种油棕材料和2份厚壳种油棕材料DNA为模板,扩增筛选油棕SHELL基因SNP引物。通过PCR扩增发现,设计的SHELL基因特异SNP标记EgSh(N)-f/EgSh(SNP)-2r能够鉴别油棕厚壳种和薄壳种。再用24株油棕树进行特异性验证,发现该标记能较准确地判断油棕的厚薄壳。该研究结果表明SNP标记EgSh(N)-f/EgSh(SNP)-2r可用来进行油棕种质资源早期分子鉴定,为高产油棕品种选育提供了技术支撑。     

基于PCR-LDR平台的近交系小鼠遗传质量快速检测方法

目的建立基于PCR-LDR平台的近交系小鼠SNP快速分型方法,用于检测实验小鼠的遗传质量与品系纯度。方法利用可移植性极高的PCR-LDR技术,以常见近交系小鼠为研究对象,选取了21条染色体上的45个SNP位点,分别设计引物和探针,经过筛选和验证,建立了多重PCR-LDR(polymerase chain reaction and ligase detection reaction,PCR-LDR)分型方案。结果四组多重PCR-LDR可实现45个SNP位点的基因分型,其中43个、44个与45个SNP在样本中的检出率分别为100%、90.9%与36.4%。所有样本经分型确定为纯合体,并得到了常见近交系小鼠SNP位点信息。结论实现了常见近交系小鼠快速、高通量的基因分型,可用于遗传质量检测和品系鉴定。     

基于地黄转录组数据的SNP标记开发与地黄指纹图谱构建

地黄(Rehmannia glutinosa)是一种具有较高药用价值和经济价值的植物。准确的品种鉴定对地黄种质管理和育种至关重要,使用SNP分子标记来鉴定地黄种质和构建指纹图谱对地黄分子标记育种提供了新方法。利用地黄转录组数据和SRA数据库中的3个地黄转录组数据比对,寻找候选SNP,用PCR技术扩增和序列分析研究28个地黄品种候选SNP变异。从地黄转录组数据中获得了102 075条Unigenes,其中共有SNP位点35 339个,发生频率为0.51/kb;从中随机选取40个候选SNP位点,设计引物39对,用PCR和序列分析从中筛选出7对好的SNP引物,包含8个多态性好的SNP位点;利用最终筛选出的8个SNP位点构建地黄指纹图谱,可以将17个不同地黄种质区分开,可用于地黄种间和种内品种的鉴定。     

基于珙桐SNP位点的dCAPS标记开发

本研究收集了珙桐、喜树等19份植物材料,运用分子生物学和生物信息学手段比对分析了rpoB,rpoC,matK等8个基因碱基序列上的单核苷酸多态性(SNP)位点,在atpF-atpH基因上找到了合适的SNP位点并设计了dCAPS引物,经PCR扩增和酶切验证后,将SNP转化为衍生型酶切扩增多态性序列(dCAPS)标记,可促进SNP标记在珙桐的遗传图谱构建、基因定位、种质资源鉴定、遗传多样性研究等领域的应用。     

高保真酶特异性检测大鼠SNP基因型新方法

目的应用高保真酶（Pfu）和3’末端修饰引物在单管双向等位基因特异性扩增（SB-ASA）中区分SNP基因型,建立高保真酶特异性检测SNP基因型的新方法。方法选取近交系大鼠SNP位点,以RS8149053为例,设计两个外部引物和两个等位基因特异性引物,四引物3’末端进行硫代磷酸化修饰,应用高保真聚合酶（Pfu）进行特异性扩增,扩增结果测序验证其可靠性。结果在RS8149053 SNP位点（C/T）上,等位基因型CC扩增出179 bp目的片段,基因型TT扩增出597 bp目的片段,基因型不同则扩增出分子量不同的片段,目的条带测序结果与Rat Genome Database数据库基因型结果一致,高保真酶扩增结果稳定且特异性强。结论高保真酶等位基因特异性扩增技术能有效降低假阳性率,是一种快速、特异的SNP基因分型新方法。     

胡麻亚麻酸亚油酸相关KASP标记的开发

胡麻是北方地区特有的、富含不饱和脂肪酸的油料作物。培育高亚麻酸品种、高亚油酸品种是胡麻品质育种的主要目标。分子标记辅助选择能提高胡麻育种效率,缩短育种年限。本研究进行了胡麻资源材料自然群体多年多点脂肪酸检测数据的统计分析和基因分型、群体构建、亚麻酸、亚油酸相关SNP位点的KASP基因分型及其验证等研究,取得了以下几个方面的结果：（1）检测246份胡麻种质资源材料多年多点5种脂肪酸成分,并对其进行了统计分析。相关性分析结果显示,亚麻酸与其他成分之间呈极显著负相关,尤其是亚麻酸和亚油酸之间负相关性最高;（2）对5种脂肪酸表型数据进行统计分析,确定了亚麻酸、亚油酸相关SNP标记分型群体：包括49份高亚麻酸（≥54%）材料、36份低亚油酸（≤13.5%）材料,及8号（CH-89）和254号（CI637PI91037）高亚油酸低亚麻酸材料;（3）验证并确定了7个SNP位点：g6-6229142、g10-19305239、g9-18961021与亚麻酸显著关联;g6-19208888、g9-14900088、g15-22369840和g2-7680441与亚油酸显著关联;（4）对确定的7个SNP位...     

基于基因组重测序的藏羚Y染色体多态性遗传位点筛选

藏羚Pantholops hodgsonii是藏羚属Pantholops现存的唯一物种,由于Y染色体基因较保守,基于近缘物种的Y染色体多态性遗传位点筛选受到了很大的限制。本研究对15份藏羚新鲜组织样品进行基因组重测序,生物信息分析筛选出Y染色体雄性特异区（MSY）对应的scaffolds,对部分SNP及SSR位点进行多态性验证。共比对出44个scaffolds,以其中序列最长、候选变异位点最多且最完整的KE113803.1为参考,对其中190个SNP变异位点设计引物进行验证,共获得45条MSY DNA序列,其中15对引物扩增到的11 898 bp DNA序列中检测到27个SNP位点;同时对KE113803.1中除单核苷酸重复以外的134个SSR位点设计引物并验证多态性,筛选出56个Y-SSR位点,其中5个具有多态性。本研究结果为后续分析藏羚Y染色体遗传多样性及父系遗传奠定了良好基础。     

基于引物扩增受阻突变技术开发水稻耐冷基因CTB4a特异性分子标记

水稻(Oryza sativa)作为热带与亚热带起源的作物对低温敏感.对水稻种质进行耐冷性鉴定,能筛选出耐冷性强的种质,发展耐冷基因分子标记,能够有效鉴别种质中耐冷基因的基因型.本研究使用芽期4℃低温处理10d对41份水稻材料进行芽期耐冷鉴定,对品种的芽期耐冷能力进行评价,获得了参试材料中除了'昆明小白谷'之外的芽期耐冷性最强的品种'南特号'.对已克隆的耐冷基因CTB4a开发分子标记,能够辅助选择水稻的耐冷育种.水稻孕穗期耐冷基因CTB4a来源于'昆明小白谷',能够影响水稻抵抗低温的能力.参照公布的CTB4a序列信息,从中挑选出序列中的作用位点SNP(单核苷酸多态性,single nucleotide polymorphism),结合引物扩增受阻突变技术(Penta-primer amplification refractory mutation system,PARMS),用Primer 6.0设计引物,建立CTB4a基因荧光分子标记GM-CTB4a,使用荧光分子标记GM-CTB4a对41份水稻品种进行鉴定,使用酶标仪在'昆明小白谷'中检测到利用标记扩增产物中包含'昆明小白谷'特异SNP、T碱基引物携带的FAM荧光信号,在另外40份品种的扩增产物中检测到包含作用位点的C碱基引物携带的HEX荧光信号.本研究利用设计的分子标记,鉴定了 41份水稻品种的耐冷性和基因型.比对分析耐冷性和基因型鉴定结果,说明我们开发的分子标记GM-CTB4a特异性较强,具有实际应用价值.研究结果为利用水稻孕穗期耐冷基因CTB4a培育强耐冷水稻品种奠定坚实基础.     

新疆维吾尔族人群过氧化物酶体增殖物激活受体基因相关SNP位点的多态性

对过氧化物酶体增殖物激活受体基因(PPARG)的31个SNP位点进行群体遗传学分析,利用质谱检测技术检测PPARG基因的31个SNPs位点多态性,并根据质谱峰图判读样本目标位点基因型,统计分析31个SNP位点的基因型和等位基因的分布频率,利用x2检验确定筛选的SNP位点是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。结果发现31个SNP位点中,23个位点的次等位基因分布频率MAF≥0.05,在新疆维吾尔族人群中具有多态性,其他8个SNP位点的MAF0.05,没显示多态性。基因型和等位基因频率在男女两组间均无统计学差异(P0.05),表明这些位点等位基因分布不存在性别差异。     

基于全基因组重测序技术的‘红叶’杜仲SNP位点开发

为了挖掘与‘红叶’杜仲（Eucommia ulmoides ‘Hongye’）红叶性状紧密联系的SNP位点,进一步揭示红叶性状的遗传基础和分子机理。以‘红叶’杜仲和普通绿叶杜仲‘小叶’杜仲（Eucommia ulmoides ‘Xiaoye’）为研究材料,进行覆盖深度约为10x的全基因组重测序。使用SnpEff软件预测变异位点对蛋白编码的影响,结合花色苷的代谢通路和关键酶基因,筛选与‘红叶’杜仲叶色形成相关的差异位点。利用Sanger测序二代测序筛选的SNP位点,分子标记验证群体是‘红叶’杜仲和‘小叶’杜仲。结果表明,‘红叶’杜仲测序产生Clean data为14.16 Gb,‘小叶’杜仲产生Clean data为14.29 Gb。在‘红叶’杜仲中注释到严重影响蛋白质功能的有1 516个SNP,中度影响的41 328个SNP,在‘小叶’杜仲中存在严重影响蛋白质功能的SNP为1 640个,中度影响功能的SNP为47 192个。测得26 722条基因中有228条基因是与花色苷或类黄酮合成相关的酶基因。经过筛选,确定了12个特异性的SNP位点,均属于外显子区域的错义突变。利用一代测序验证,根据SNP位置设计了7对引物,SNP准确率达到100%。     

等位基因特异PCR技术的研究与应用

生物的单核苷酸多态性(Single-nucleotide polymorphism,SNP)具有数量多、分布广、易于分型、稳定性强等优点,很适合于用做分子标记.等位基因特异PCR(Allele-specific PCR,AS-PCR)是根据SNP位点设计3'末端与SNP位点碱基互补或错配的特异PCR引物,通过凝胶电泳等方法检测PCR扩增产物的有或无,从而检测基因型中SNP的一种技术.经过不断地改进与完善,基于SNP的等位基因特异PCR标记已逐渐成为一种快速、简便、低成本、可靠、高通量的检测基因型SNP的方法.本文应用等位基因特异PCR技术,根据小麦TaDREB1基因在旱选10和鲁麦14的120(C→A)SNP成功地开发了一个SNP分子标记,证明了该方法的有效性和可行性.     

尼罗罗非鱼ghrelin基因的多态性及其与生长性状相关SNP位点的筛选

为了研究尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)生长激素促分泌素基因(ghrelin)的多态性及其与生长的相关性, 研究以两个尼罗罗非鱼群体(快长群体和基础群体)的DNA样本各40份为模板, 通过PCR扩增和测序获得ghrelin基因序列。通过Dnasp v5和MEGA 5.0分析序列多态性、筛选有效SNP 位点; 采用Snapshot法对两个群体子代ghrelin基因中SNP位点进行基因分型, 然后分析SNP位点基因型与生长性状的相关性。结果表明, 快长群体ghrelin基因中的单核苷酸变异位点数(S)比基础群体要少, 而核苷酸多态性(Pi)和平均核苷酸差异数(K)要略高于基础群体。共筛得3个有效SNP 位点(S1、S2和S3), 均分布于第1个内含子中。遗传结构分析表明, 3个SNP 位点在两个群体的子代中均为低度多态性位点(PIC0.25), 但处于Hardy-Weinberg平衡(P0.05);快长群体子代中3个SNP 位点的观测杂合度、期望杂合度和多态信息含量等遗传多样性参数均小于基础群体子代的相应值, 3个SNP 位点的遗传多样性参数、基因型和基因频率在同一群体中高度一致, SNP 位点之间完全连锁。两个群体子代中3个SNP 位点处的优势基因型相同, 但快长群体子代中优势基因型频率要明显大于基础群体子代中相应基因型频率。对两个群体子代的生长性状与SNP基因型进行关联性分析的结果表明,尼罗罗非鱼个体的多项生长指标(体重、体长、体高、头长和尾柄高等)在不同基因型中存在显著差异(S1:GG AG, S2:TT AT, S3:AA AT)(P0.05)。D1双倍型(S1:GG, S2:TT, S3:AA)所对应的尼罗罗非鱼个体的多项生长指标(体重、体长、体高、头长和尾柄高等)显著高于D2双倍型(S1:AG, S2:AT, S3:AT)。以上结果表明, 尼罗罗非鱼ghrelin基因3个SNP 位点完全连锁, D1双倍型与快长性状密切相关, 可作为尼罗罗非鱼分子标记辅助育种的候选标记。     

利用SSR标记研究茄子种质资源遗传多样性

本研究利用105个SSR分子标记分析了50份茄子种质资源遗传多样性。105对SSR引物中筛选出的20对多态性含量较高的引物,在50份茄子品种组成的群体中共检测出91个等位基因,平均每个基因位点检测到4.55个等位基因。PIC的变幅为0.202 1~0.735 6,平均为0.401 2。根据遗传距离并结合UPGMA聚类分析可将50份种质分为10个类群。SSR分子标记与品种资源性状聚类分析基本一致。     

基于重测序信息的金针菇菌株资源遗传多样性及群体结构分析

通过对来自国内外的28份金针菇菌株资源的重测序共计检测到SNP位点1 241 583个,InDel位点623 670个。通过筛选分型,1 474个高质量SNP标记（多态信息含量指数PIC介于0.101-0.966之间）被用于金针菇资源群体多样性和结构分析。经计算,菌株间遗传距离在0.057-0.631之间。UPGMA进化树拓扑结构显示栽培菌株是其与野生菌株混合分支的一个亚支,自然栽培和工厂化栽培菌株可各自聚成一支,符合金针菇育种历史。群体结构结果显示金针菇种质资源包含5个亚群。主成分分析显示菌株在二主分之间的位置及互相间距离基本符合进化树分类、群体结构和遗传距离。本研究为金针菇分子标记和基因型的确定提供序列基础,也为后续资源保护利用、重要农艺性状的基因定位和基于分子标记的聚合育种提供理论依据。     

应用SSR标记分析鹰嘴豆种质资源遗传多样性

种质资源的遗传多样性是育种工作的基础,本研究利用SSR标记对鹰嘴豆资源进行遗传多样性分析,旨在发掘鹰嘴豆资源中丰富的遗传变异。从48对鹰嘴豆SSR引物中筛选出18对核心多态性引物,对96份不同来源的鹰嘴豆种质资源进行SSR标记的遗传多样性分析。结果表明,18对SSR引物共检测到115个等位变异,占总检测位点的52.99%,每对SSR引物可检测出3~10个等位变异,平均6.39个;平均每个位点多态信息量(PIC)为0.8107,变化范围为0.6661~0.8984。Shannon's信息指数平均为1.4769,变化范围为0.0607~1.9584。PGMA聚类结果表明,在遗传相似系数0.59处,可将96份鹰嘴豆资源分为6个类群,类群Ⅰ包含9份资源,类群Ⅱ包含2份资源,类群Ⅲ包含28份资源,类群Ⅳ包含4份资源,类群Ⅴ包含40份资源,类群Ⅵ包含13份资源。本研究对我国鹰嘴豆种质资源的评价与利用、优异基因的挖掘、育种亲本材料的选择等提供科学依据。     

江西地区畲族人群pcsk9基因变异的SNaPshot分析

目的 研究江西地区畲族人群pcsk9基因SNP位点的变异,为开展冠心病风险研究提供可借鉴的资料.方法 通过SNaPshot法对84例畲族人外周血DNA pcsk9基因外显子7个SNP位点进行分型,ABI 3730XL扫描分型结果.结果 7个SNP位点中,仅rs505151A/G位点检测到基因变异,其G基因的频率为0.036.结论 江西地区畲族人群pcsk9基因7个SNP位点的基因型频率和等位基因频率与国内外其他民族间均存在一定差异,提示畲族人群可能具有独特的冠心病风险标记位点及变异特征.本研究为开展畲族人群pcsk9基因的冠心病风险关联性研究提供了参考依据.     

乌塌菜种质资源遗传多样性的ISSR分析

利用ISSR技术对48份乌塌菜种质资源进行遗传多样性分析。从60条随机引物中筛选出稳定性强、条带清晰且多态性丰富的9条引物进行PCR扩增,共扩增出103条谱带,平均每个引物扩增出11.4条带,其中多态性带85条,多态性位点百分率为82.68%。不同乌塌菜种质间遗传相似系数变幅为0.59~0.97,说明ISSR标记能够揭示材料间较高的遗传多样性。利用UPGMA聚类分析,ISSR标记能将48份乌塌菜品种完全区分开,48份乌塌菜种质被划分为4个类群,聚类结果与叶片颜色相关,为乌塌菜品种资源的研究利用提供参考。     

基于全基因组芯片开发水稻HRM特异分子标记

植物中广泛分布着单核苷酸多态性(SNP)位点。在此基础上发展而来的SNP标记因其具有高分辨率和共显性等优点,已成为当前作物遗传研究重要的分子工具。本研究拟建立基于高分辨率熔解曲线(HRM)技术的SNP分子标记,从而实现对栽培稻和野生稻的高效基因分型,为今后水稻的基因挖掘、品种鉴定以及分子育种等提供可靠、快捷的技术工具。利用水稻全基因组9 K SNP芯片对栽培稻品种黄华占和野生稻Y605进行扫描,寻找两者之间的SNP位点,并将其开发成基于HRM技术的特异分子标记。然后,利用这些分子标记对亲本黄华占、野生稻Y605以及两者的BC3回交群体进行分子检测,以验证其有效性。水稻9 K基因芯片在黄华占与野生稻Y605之间总共找到了4198个SNP位点,它们在12条染色体上较均匀分布。在水稻第1号染色体上随机挑选出5个SNP位点开发成基于HRM技术的特异分子标记。利用这些标记对黄华占与野生稻Y605的BC3F1和BC3F2群体进行检测分析,发现它们都能准确区分亲本的纯合与杂合基因型。并且,在回交后代的第1号染色体ZY1-1~ZY1-4标记区间检测到野生稻片段插入。水稻全基因组9 K SNP芯片可以很好地应用于水稻SNP标记的开发。开发的SNP特异标记能准确、高效地对栽培稻和野生稻进行基因分型。进一步完成基于HRM技术的水稻全基因组SNP标记的开发,可为今后野生稻的分子遗传研究、有利基因挖掘和育种应用提供高效的分子检测手段。