烟草NtCBT基因启动子酵母单杂诱饵载体构建及互作蛋白筛选

为了筛选烟草类西柏烷生物合成途径中西柏三烯一醇合酶基因(NtCBT)的上游调控转录因子,将NtCBT基因启动子截为6段(P1-P6区域),分别构建酵母单杂诱饵载体pAbAi-Px,将pAbAi-Px 转化Y1H酵母感受态细胞构建诱饵菌株并进行自激活检测,从烟草腺毛酵母cDNA文库中筛选与P5区域(-279--119 bp)互作的转录因子。结果表明,P1-P5区域所构建的诱饵菌株,在AbA浓度为200 ng/mL时转录自激活得到有效抑制;在以P5区域为诱饵菌株的筛库实验中,共获得49个阳性克隆,去除冗余序列后35个克隆为非重复序列,其中3个克隆注释为ANL2、ML1及NF-Y转录因子。以上结果为进一步研究NtCBT基因的表达调控机制奠定了基础。     

筛选G-box结合蛋白的酵母单杂交文库的构建

目的：筛选花青素合成中的关键基因查尔酮合成酶基因CHS启动子中G-box的结合蛋白,从而找到调节CHS表达的转录因子。方法：采用Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System,将CHS启动子G-box序列串联后整合入酵母染色体,构建诱饵菌株;采用SMART技术合成芜菁幼苗下胚轴cDNA,将该cDNA与pGADT7-Rec表达载体共同转化诱饵菌株,通过同源重组在酵母细胞内同步进行cDNA文库的构建和筛选;用酵母菌落PCR法获得阳性克隆中的cDNA插入片段,测序后在NCBI网站进行Blast分析。结果：共筛选了2.52×106个酵母克隆,得到94个阳性克隆,菌落PCR获得了长度为0.4~2.0 kb的cDNA插入片段,并通过Blast推测了其编码蛋白。结论：实验结果证明酵母单杂交文库构建成功,初步筛选获得了G-box结合蛋白的候选蛋白,为研究CHS的表达调控奠定了基础。     

番茄LeDREB1转录因子基因RNAi载体的构建和鉴定

利用rd29A基因启动子的DRE元件从番茄(丽春)cDNA文库中通过酵母单杂交技术筛选得到转录因子基因LeDREB1。核苷酸序列测定结果表明,该基因片段全长1 782 bp,具有900 bp的cDNA开放阅读框序列,编码300个氨基酸。该基因属于AP2/EREBP家族[1],可能调控许多逆境应答基因的表达。运用RNA干扰的思路,设计特异性引物,扩增正向和反向基因片段。将LeDREB1正向+反向基因片段插入到pCAMBIA2300-OCS的35s启动子下游,构建干扰载体pCAM-RNAi-LeDREB1,通过酶切和测序鉴定证明目的片段与载体片段连接正确。这一载体的成功构建为进一步研究LeDREB1的功能和调控作用机制提供有效的材料与技术支撑。     

碱茅(puccinellia tenuifolra)Put-Cu/Zn-SOD基因的克隆及在酵母中的表达

从碱茅根cDNA文库分离得到Put-Cu/Zn-SOD全长cDNA,其序列全长为2 700 bp,该基因的开放读码框为长615 bp,所编码的蛋白由204个氨基酸组成,其预测分子量约为20.6 kD、理论等电点约为5.63.Put-Cu/Zn-SOD氨基酸序列与水稻Cu/Zn-SOD序列有较高的同源性为87%.将Put-Cu/Zn-SOD基因构建到酵母表达载体pYES2,并转化至酵母(INVSc1).对pYES2-Put-Cu/Zn-SOD转化酵母进行盐碱、氧化胁迫实验.结果表明:重组酵母的抗盐碱、氧化能力明显高于对照(pYES2转化酵母),结果显示了碱茅的Cu/Zn-SOD基因在酵母表达中,具有提高酵母抗盐碱和耐氧化能力.     

水稻穗发育相关基因酵母双杂交cDNA文库的构建

利用cDNA文库筛选与已知功能蛋白质互作蛋白质,是研究蛋白质之间相互作用的重要途径之一。本试验利用水稻武运粳7号(95-22)穗为材料,构建了一个穗发育相关基因酵母双杂交cDNA文库,试验表明,本实验构建的cDNA初级文库容量和目的文库容量分别为1.44×107 CFU/mL和9.6×106 CFU/mL,重组率均为95%;初级文库插入片段长度介于500～2 000 bp之间,目的文库插入片段长度介于1 000～2 000 bp之间,两者平均插入片段长度均在1 000 bp以上;通过NCBI数据库、RicexPro数据库和Rice Genome Annotiation Project数据库对目的文库中的19个单克隆测序分析得知,19个克隆测序序列匹配17个相应的基因,文库重复率为10.5%,其中16个基因均在穗部有表达。以上试验表明,本实验构建的cDNA文库是一个质量较高的文库,可以直接用于穗发育相关基因筛选。     

野生大豆P5CS基因的克隆及对盐胁迫反应

逆境下植物大量积累脯氨酸是减轻胁迫伤害的一种自我保护机制。本研究应用同源克隆方法从NaCl处理的野生大豆中克隆获得一个脯氨酸合成酶(P5CS)基因,命名为GsP5CS。该基因核苷酸序列全长2.232 kb,含一个2148bp开放阅读框,编码715个氨基酸,包含有高等植物P5CS蛋白质的5个主要功能域,与菜豆PvP5CS1基因核苷酸序列相似性高达98.79%。Real Time PCR分析显示该基因受轻度盐胁迫诱导上调表达,根中表达高峰出现在200 mmol/L NaCl处理下,相对表达量为对照的5.83倍;叶片中表达高峰出现在300 mmol/L NaCl处理条件下,相对表达量为对照的12.78倍。并且该基因在根和叶片中的表达模式和脯氨酸含量的变化模式相同。上述结果说明,GsP5CS可能参与野生大豆脯氨酸合成。     

JAB1与糖皮质激素受体的相互作用及对其转录活性的影响

应用酵母双杂交方法筛选到与糖皮质激素受体(GR)结合的蛋白JAB1,进一步验证JAB1与GR的结合作用并证明其对GR的影响.构建与Gal4-BD融合表达的载体pGBKT7-GR LBD,与构建于pACT2载体上的人骨髓cDNA文库杂交,在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp选择培养板上培养,经X-α-gal检测,阳性克隆片段插入pGEM^®-T Vector 载体,测序,再经酵母双杂交和GST pull down蛋白质结合实验验证其结合作用,应用反映GR转录活性的CAT报告基因检测JAB1对GR的调节活性.结果在人骨髓cDNA文库中,筛选到42个X-α-gal检测变蓝且含有pACT2质粒序列的克隆,其中有5个克隆的序列皆为Jun活性区结合蛋白JAB1的一部分.酵母双杂交和蛋白质结合实验表明,JAB1与COS7真核表达的GR-LBD在体外有结合作用.JAB1加强GR转录激活的能力.     

小麦Na^＋／H^＋反转运蛋白基因的克隆和特性

以水稻 (OryzasativaL .)Na /H 反转运蛋白cDNA片段为探针 ,从小麦盐胁迫cDNA文库中筛选和克隆了 2个小麦Na /H 反转运蛋白基因 ,分别命名为TaNHX1和TaNHX2。序列分析表明TaNHX1为 2 0 2 9bp ,包含一个完整的 16 38bp的ORF ,编码 5 4 6个氨基酸 ,其中含有DIFFIYLLPPI跨膜区。TaNHX2为 16 93bp ,包含部分ORF及 80 8bp的 3′_UTR。这 2个基因与已知的水稻、拟南芥 (Arabidopsisthialiana)和滨藜 (Atriplexgmelini)中的同类基因NHX的相似性约为 70 %。RT_PCR分析表明小麦苗经 4 0 0mmol/LNaCl处理 1h后 ,TaNHX1的转录水平有所提高。     

灰飞虱高带毒（RSV）群体酵母双杂交cDNA文库的构建

为了研究灰飞虱Laodelphax striatellus Fallén与水稻条纹病毒（rice stripe virus, RSV）互作机制, 本研究构建了灰飞虱高带毒群体酵母双杂交cDNA文库。以实验室筛选的灰飞虱高带毒群体为材料, 分离纯化mRNA, 反转录合成双链cDNA, 并连接三框型接头, 层析柱分级纯化。采用同源重组反应制备三框型cDNA入门文库, 再通过同源重组将入门文库转移到Gateway兼容载体pGADT7-DEST上, 构建获得酵母双杂交cDNA文库。检测结果表明： 文库库容量为3.68×10⁷ cfu, 扩增文库滴度为2.62×10¹⁰ cfu/mL; 文库重组率大于95%, cDNA插入片段平均长度>1 kb, 达到了标准cDNA文库的要求。灰飞虱高带毒群体酵母双杂交cDNA文库的构建为开展昆虫介体与水稻条纹病毒互作机制的研究奠定了基础。     

小黑杨转录因子PsnbZIP1应答盐胁迫功能分析

为揭示小黑杨(Populus simonii×P. nigra)在面对非生物胁迫时,转录因子PsnbZIP1在植物体内发挥的功能,以小黑杨为试验材料,克隆得到PsnbZIP1的ORF区序列长为432 bp,并初步分析PsnbZIP1盐胁迫下的分子机制。采用q-PCR分析PsnbZIP1在150 mmol·L^-1 NaCl处理小黑杨组培苗时的表达模式,发现该基因的表达量快速上升;通过生物信息学分析预测PsnbZIP1转录因子为无跨膜结构且具有信号肽的亲水性不稳定蛋白;用农杆菌(Agrobacterium)介导的烟草(Nicotiana)瞬时表达观察该基因的亚细胞定位情况,结果表明该基因为核定位蛋白;用酵母单杂交实验证明该基因编码的蛋白在酵母体内不具有转录激活功能。对PsnbZIP1基因的启动子序列进行分析,结果表明该启动子包含了生长素应答、脱落酸应答元件、光应答元件以及种子特异性调控的顺式作用调控元件,该基因可能在植物的生长发育与响应胁迫过程中发挥了重要作用;启动子还包括参与干旱诱导的MYB结合位点和MYBHv1结合位点,表明该基因有可能与一些干旱诱导相关MYB基因...     

巴西橡胶树HbICE1基因酵母双杂交诱饵载体的构建及互作蛋白的筛选

寒害是我国植胶区的主要自然灾害之一,不仅影响橡胶产量还威胁到橡胶树的生存。拟南芥中,ICE1是低温胁迫信号通路中的重要转录激活因子,但橡胶树冷胁迫信号途径中包括Hb ICE1在内的大部分关键基因尚未被克隆与鉴定,与Hb ICE1蛋白发生互作的蛋白也不清楚,成为严重阻碍橡胶树抗寒分子机理研究的瓶颈。为了筛选和鉴定与巴西橡胶树Hb ICE1蛋白发生互作的蛋白,阐明橡胶树抵御寒害胁迫的分子机理,本文首先通过PCR扩增出Hb ICE1基因的编码序列(约1400 bp),然后将目标序列插入p GBKT-7载体,构建酵母双杂交诱饵载体;将该载体转入酵母Y2H菌株感受态细胞中,并在缺陷型培养基上检测其自激活活性,发现Hb ICE1基因的自转录激活在含有30 mmol/L和更高浓度3-AT(3-氨基-1,2,4-三氮唑)的培养基上能得到有效抑制;进一步通过与橡胶树c DNA文库进行酵母双杂交,筛选出一些可能与Hb ICE1发生互作的蛋白,包括DNA结合蛋白、核糖体蛋白和功能未知蛋白。本研究结果为橡胶树抗寒机理研究提供了重要理论依据。     

悦目金蛛丝腺SMART RACE cDNA文库的构建与鉴定

运用SMART 技术构建了悦目金蛛丝腺SMART RACE cDNA文库.经检测,文库所含全长cDNA的长度主要集中在500 bp～2000 bp 之间;把双链cDNA通过T/A克隆、随机挑选阳性克隆并测序后,得到1条752 bp的全长cDNA序列.以该文库为模板,用依据这条全长cDNA序列设计的基因特异性引物与接头引物进行RACE, 3'RACE 和5'RACE的产物拼接后的全长序列与上述全长cDNA序列一致.结果表明,该文库适于用RACE方法从中分离在悦目金蛛丝腺中表达基因的全长cDNA.本文还对SMART 技术的特点和局限性进行了讨论.     

拟南芥CKI1基因上游转录调控因子筛选及鉴定

拟南芥CKI1(cytokininindependent 1)是双组分信号系统中一个组氨酸激酶蛋白,通过作用于下游组氨酸磷酸转移蛋白激活双组分信号通路,在调控胚囊中央细胞命运分化和发育过程中具有重要作用。然而目前对于CKI1基因上游转录调控因子还知之甚少。本研究分析了不同长度的CKI1启动子在拟南芥胚囊中的活性,并利用酵母单杂交技术对CKI1上游转录调控因子进行了筛选和鉴定。结果表明,位于内含子区域中的F5/R2片段表现出与CKI1启动子全长相一致的表达活性。进一步选取3个串联重复的F5/R2片段用于构建诱饵表达载体,同时,选取拟南芥雌蕊构建cDNA文库,通过酵母单杂交筛选获得226个阳性克隆。去除低质量及冗余重复的序列后共获得66条可读序列,其中8条序列对应的基因编码具有DNA结合功能的蛋白。研究结果为进一步揭示CKI1基因的转录调控机制提供了重要参考信息。     

一个新的家蚕转录相关锌带蛋白基因的克隆及序列分析

锌带蛋白(zinc ribbon protein )是锌指类蛋白的一种,它的Cys4 Zn(2+)结合位点由3个β₂片层折叠而成,而不是α螺旋结构。锌带结构与锌指结构同为转录因子结合核酸的结构域,锌带蛋白作为转录相关因子在调节基因表达活性等方面具有重要作用。在对家蚕 Bombyx mori蛹cDNA文库测序中,发现一个新的编码家蚕锌带蛋白基因的EST序列（GenBank 登录号DY230964）,以此序列为信息探针检索家蚕EST数据库,通过同源筛选,获得一个新的家蚕锌带蛋白基因cDNA全序列并经RT-PCR检测和克隆、测序验证,结果表明与电子克隆序列完全一致。我们将其命名为 BmZNRD1 (Zinc Ribbon Domain Containing 1)（GenBank登录号DQ432055）。该基因全长为675 bp,由363 bp的开放阅读框序列(ORF)、10 bp的5′端非翻译区序列(5′UTR)和302 bp 的3′端非编码区序列(3′ UTR)组成,其编码的120个氨基酸序列与其他真核生物间具有较高的同源性（达60%左右）,预测分子量为13.54 kD, 等电点为6.8。BmZNRD1编码的氨基酸序列是一种锌带蛋白,推测有2个功能结构域,分别是位于N-端的Cx₂Cx₁₄Cx₂C和C-端的Cx₂Cx₂₄Cx₂C,其中C-端保守氨基酸序列Cx₂Cx₆Yx₃QxRSADEx₂TxFx₂Cx₂C在生物进化中保守性很高,从酵母、果蝇、线虫到两栖类、哺乳类都有发现该结构域的存在,与酵母RNA聚合酶A亚单位9和转录相关蛋白有很高的相似性,推测其具有相同的功能。将BmZNRD1基因cDNA序列与家蚕基因组序列进行比对,结果表明该基因具有3个外显子,2个内含子,外显子/内含子边界符合经典的GT-AG规则。 关键词： 家蚕; 锌带蛋白基因; 电子克隆; 基因克隆; 序列分析     

萘胁迫下水稻幼苗抑制差减杂交cDNA文库构建

从200mg/Kg萘胁迫水稻幼苗根系中成功分离和纯化了高纯度的总RNA和mRNA,并以无萘处理为Driver,以200mg/Kg的幼苗为Tester,通过cDNA双链的合成及两次PCR扩增,富集到两组处理中差异表达的大小在200～800bp的cDNA序列,pGEMT的连接和蓝白斑筛选表明杂交文库滴度和重组率分别达到1.5×106 pfu/mL和96%,共收集阳性克隆8000个,形成了抑制消减杂交的质粒cDNA文库.随机挑取酶切质粒的电泳分析表明,载体中均有插入片段.高效抑制消减杂交文库的建立为进一步分析基因的差异表达及分离萘胁迫下抗性基因奠定了基础.     

利用酵母双杂交系统筛选水稻中与OsCRK5互作蛋白

水稻是重要的粮食作物,研究水稻生长发育调控机制可为水稻品种改良奠定理论基础。钙依赖蛋白激酶（calcium dependent protein kinases, CDPKs）是植物中重要的蛋白激酶,参与植物生长发育以及对环境反应的应答。水稻中的CRK5(CDPKrelated kinase 5)在蛋白序列和结构上与CDPK高度同源。为进一步研究OsCRK5在水稻干旱反应中的功能,本研究利用酵母双杂交筛库技术筛选了OsCRK5的互作蛋白。首先将OsCRK5的1-1 332 bp片段克隆至pGBKT7载体中,获得诱饵载体pGBKT7-OsCRK5,经测序无误后,转化至酵母菌株Y2H Gold中。在营养缺陷培养基中观察到重组蛋白不具有毒性作用及自激活活性,同时利用Western blot分析重组蛋白的表达。进一步利用水稻cDNA文库筛选OsCRK5的互作蛋白,共得到77个阳性克隆。功能预测结果显示,互作蛋白涉及蛋白质合成、贮存和降解过程、转录调控、植物细胞生长和分裂过程、能量代谢和细胞代谢等方面的功能。最后,从阳性克隆中选取参与植物干旱胁迫应答的两个蛋白OsWR1和OsDi19-1,利用酵母...     

枸杞LmP5CS基因的克隆及表达分析

目的:为进一步研究枸杞抗逆境胁迫的机制,并为转基因育种,提供理论依据。提高农作物的抗逆性提供优质的基因资源。方法:提选取盐胁迫后脯氨酸含量变化较大的耐盐植物枸杞为材料,用1.5%NaCl处理后,提取枸杞叶片总RNA,利用 RT-PCR 及3' RACE方法克隆获得吡咯啉-5-羧酸合成酶(delta 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase,P5CS)基因的全长cDNA,命名为LmP5CS,构建pH7m24GW,3rc-LmP5CS植物表达载体。结果:LmP5CS基因的ORF长2 154 bp,编码1个等电点为6.07、分子量为 77.5kDa、由717个氨基酸组成的蛋白。枸杞在200 mmol/L NaCl 盐胁迫下, LmP5CS基因表达量随处理时间,有先升高后降低的趋势,9h基因表达量最高,脯氨酸含量变化与之一致。结论:LmP5CS基因在盐胁迫下脯氨酸含量的变化中起关键作用。     

小麦Na+/H+反转运蛋白基因的克隆和特性

以水稻(Oryza sativa L.) Na+/H+反转运蛋白cDNA片段为探针,从小麦盐胁迫cDNA文库中筛选和克隆了2个小麦Na+/H+反转运蛋白基因,分别命名为TaNHX1 和 TaNHX2.序列分析表明TaNHX1为2 029 bp,包含一个完整的1 638 bp的ORF,编码546个氨基酸,其中含有DIFFIYLLPPI跨膜区.TaNHX2为1 693 bp,包含部分ORF及808 bp的3′-UTR.这2个基因与已知的水稻、拟南芥(Arabidopsis thialiana)和滨藜(Atriplex gmelini)中的同类基因NHX的相似性约为70%.RT-PCR分析表明小麦苗经400 mmol/L NaCl处理1 h后,TaNHX1的转录水平有所提高.