肺炎链球菌假想的溶菌酶样蛋白的活性分析和鉴定

目的 探索肺炎链球菌中一种假想的溶菌酶样蛋白的活性.方法 生物信息学分析该基因的功能结构域;利用长臂同源PCR对该基因进行敲除,观察D39野生菌和缺陷菌在生物学性状的改变;利用底物PNP-（GIcNAc）和溶壁微球菌,构建过表达载体,绘制生长曲线,对截断和全长蛋白的溶菌酶活性进行鉴定.结果 生物信息学分析结果显示该基因的编码产物为β-1,4-N-乙酰胞壁酸糖苷酶,属于糖基水解酶25家族;野生菌为长链生长,缺陷菌呈短链状;溶菌酶和假想的溶菌酶样蛋白均可使底物释放出游离的对硝基苯酚,A405nm吸光度值分别为1.166和0.792;同时也可使得溶壁微球菌发生溶解;含过表达质粒的肺炎链球菌较之野生菌,溶解较快.结论 假想的溶菌酶样蛋白具有溶菌酶活性,是一种新的溶菌酶.     

假想的脂蛋白连接酶对肺炎链球菌毒力的影响

【目的】探索假想脂蛋白连接酶(putative lipoate-protein ligase,LPL)对肺炎链球菌毒力的影响。【方法】采用长臂同源多聚酶链式反应(LFH-PCR)的方法失活lpl基因,通过PCR、测序鉴定缺陷菌株,采用细胞实验比较缺陷菌和野生菌对宿主细胞的粘附能力,并通过动物实验观察lpl基因缺陷后菌株毒力的变化。【结果】小鼠毒力实验表明野生菌株和缺陷株半数致死时间均为12h,两者比较无统计学差异;缺陷菌在对宿主细胞的粘附能力明显高于野生菌株(P0.01);体外荚膜染色实验表明,野生菌和缺陷菌均有荚膜。【结论】实验结果提示lpl基因对细菌粘附宿主细胞有抑制作用,但不影响其腹腔感染小鼠的能力。     

透明质酸生产菌溶血素S基因缺失突变菌株的构建及其特性北大核心CSCD

【目的】马链球菌兽疫亚种是工业上生产透明质酸的主要菌种,该菌能产生引起宿主细胞溶血的链球菌溶血素S(streptolysin S,SLS)毒素,因而其产品的安全性一直是人们所担心的问题。本实验的目的就是通过基因敲除的方法构建不产SLS的透明质酸生产工程菌,同时探讨溶血素sag A基因缺失对菌株透明质酸合成和其他毒力因子的影响。【方法】利用温度敏感/自杀性质粒p JR700载体系统,构建马链球菌兽疫亚种sag A基因缺失突变株;通过PCR扩增,溶血平板和SLS含量测定等方法确定sag A基因缺失;采用分光光度、SDS-PAGE和细胞毒性试验等分析方法,对野生菌株和sag A基因缺失突变菌株透明质酸含量、透明质酸分子量、溶血素Hylc、透明质酸分解酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和菌体表面蛋白等相关毒力因子进行对比研究。【结果】获得了透明质酸产量提高30%而溶血活性极低的马链球菌兽疫亚种sag A基因缺失突变株。该突变株与野生菌株相比较,透明质酸分解酶活性增加而透明质酸相对分子量降低,此外,与毒力相关的表面蛋白含量、溶血素Hylc和甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性也显著降低。细胞毒性实验结果表明,野生菌株与sag A基因缺失突变菌株的培养物上清液,对细胞活性的影响存在显著差异。【结论】在马链球菌兽疫亚种中sag A不仅是表达溶血素SLS的基因,同时sag A基因对菌株透明质酸合成、透明质酸分解酶、菌体表面蛋白、溶血素Hylc和甘油醛-3-磷酸脱氢酶等都具有调节作用。     

沙门菌噬菌体抗性菌的筛选鉴定及致病力研究

【目的】筛选鉴定沙门菌噬菌体侵染裂解过程中的抗性菌株,研究抗性菌株的生物学特性及致病力的差异,为解决噬菌体治疗应用中的抗性菌问题提供理论依据。【方法】本研究通过次级感染法和双层平板法筛选沙门菌噬菌体抗性菌,通过生物学特性和毒力基因检测比较宿主菌ATCC 13076及其噬菌体抗性菌株R3之间的差异,并通过小鼠攻毒实验和细胞粘附实验比较致病力强弱。【结果】噬菌体抗性菌株R3的生长速度较宿主菌略慢;生化及毒力基因检测均表明抗性菌株与宿主菌无差异;与宿主菌相比,抗性菌R3的LD50增加了74.8%(P0.05);对MODE-K细胞粘附能力稍弱,但是差异不显著。【结论】该研究表明,与噬菌体宿主菌相比,噬菌体抗性菌株的生物学特性和毒力基因并没有改变,对小鼠致病力减弱,但是对MODE-K细胞粘附能力差异不显著。     

猪链球菌2型Dbp缺失株的构建及特性分析

【目的】通过构建DNA结合膜蛋白(DNA-binding membrance protein,Dbp)基因的缺失株,探究Dbp基因对猪链球菌2型强毒株毒力的影响。【方法】通过PCR检测Dbp基因的分布。利用同源重组原理构建Dbp基因上下游片段的重组质粒,将构建好的质粒电转入ZY05719感受态细胞中,筛选Dbp缺失突变株,通过PCR及测序分析对其进行验证。生物学特性分析比较缺失株?Dbp和野毒株ZY05719在生长速率、形态特征、毒力等方面的差异。【结果】Dbp基因为猪链球菌2型强毒株中相对保守基因,构建了Dbp基因缺失株?Dbp。体外实验结果显示Dbp基因缺失株的生长速率在对数期减慢,并且缺失株?Dbp的荚膜同野毒株存在显著差异,斑马鱼实验结果表明缺失株?Dbp毒力下降。【结论】Dbp与猪链球菌2型的毒力相关,在猪链球菌2型的致病过程中起一定的作用,这丰富了对该菌致病机理的认识。     

wzzE不影响禽致病性大肠杆菌雏鸭分离株LPS的表型北大核心CSCD

【目的】wzz参与很多革兰氏阴性菌O抗原的合成,并对细菌的致病性具有调控作用。在禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli,APEC）中,存在Wzz蛋白超家族基因wzz E,目前尚未开展该基因对APEC脂多糖（LPS）的合成及致病作用研究,因此本研究开展了wzz E对APEC LPS合成以及生物学特性影响的研究。【方法】通过构建APEC DE17株的wzz E缺失株,开展对野生型和缺失株的LD50、黏附与入侵DF-1细胞、脂多糖表型及内毒素毒价等相关生物学特性的影响研究。【结果】结果表明,缺失wzz E的APEC,不影响细菌的生长特性。野生型、缺失株及回复株的LPS表型无明显差异。DE17Δwzz E与DE17的黏附与入侵结果无显著差异。血清型鉴定结果表明,缺失wzz E,不影响细菌的血清型。内毒素毒力检测结果DE17、DE17Δwzz E及CΔwzz E内毒素的毒价一致,为4×10~5 EU/mg。对7日龄樱桃谷鸭进行攻毒,测定各菌株的LD50,结果表明,与野生型相比,DE17Δwzz E缺失株毒力下降了10倍。【结论】wzz E缺失对LPS的表型无显著影响,但wzz E参与APEC的致病过程,然而wzz E对APEC毒力的调控机制仍有待进一步研究。     

肺炎链球菌pcsB组成型表达的yycF缺陷菌株的构建及其致病能力

【背景】YycFG双组分系统是肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S. pn)应对外界环境的重要信息传递系统,其中表达反应调节子YycF的编码基因是肺炎链球菌生长的必需基因,但其是否调控细菌毒力尚不清楚。【目的】构建肺炎链球菌pcsB组成型表达及yycF缺陷菌,分析YycF对肺炎链球菌生物学特征和毒力的影响。【方法】采用Janus cassette (JC)反选的方法构建pcsB组成型表达菌株(Pc-PcsB~+),从该菌株出发用替代失活的方法构建yycF缺陷菌株(Pc-PcsB~+DyycF),比较野生株D39rpsl41、pcsB组成型表达株及yycF缺陷株的生长特性、荚膜多糖(capsular polysaccharide,CPS)含量、粘附侵袭能力和致病性的差异。【结果】成功构建pcsB组成型表达的yycF缺陷菌株(Pc-PcsB+DyycF);yycF缺陷导致细菌生长缓慢、分裂异常、胞内荚膜多糖和小分子荚膜多糖增多;体外实验结果显示,yycF缺陷菌株粘附能力较Pc-PcsB~+菌株减弱(P=0.006)。体内毒力实验显示,感染野生菌的小鼠全部死亡,感染Pc-PcsB+和Pc-PcsB~+DyycF菌株的小鼠死亡率分别为91.7%、75%,二者没有统计学差异(P=0.183),但Pc-PcsB~+DyycF菌株感染组有降低趋势;定殖结果显示,yycF缺陷菌株感染组的肺匀浆菌载量显著低于对照组(P=0.033)。【结论】成功构建yycF缺陷菌株,并初步证明yycF基因会影响肺炎链球菌的生物性状和致病能力,为后续探讨YycFG双组分系统对肺炎链球菌致病能力调控机制的研究奠定了基础。     

猪链球菌2型Orf207基因缺失菌株的构建及其生物学特性检测

【背景】猪链球菌2型(streptococcus suis type 2, SS2)可引起人、猪的脑膜炎、关节炎及败血症等,不仅给养猪业带来巨大的经济损失,同时严重威胁公共卫生安全。本团队前期通过噬菌体展示文库技术发现Orf207编码蛋白可能参与SS2诱导的脑膜炎发生,然而其在SS2致病过程中的具体作用尚不清楚。【目的】探究Orf207基因对SS2致病性的影响。【方法】采用温敏性自杀质粒介导的同源重组系统,构建SC19 Orf207基因缺失菌株ΔOrf207及其回补菌株CΔOrf207,系统比较缺失菌株与野生株间在生长特性、形态、组织定殖能力、毒力情况、细胞黏附与侵袭及抗巨噬细胞吞噬能力等生物学特性方面的差异。【结果】与野生株相比,缺失菌株链长变短,生长速度略慢;而且Orf207缺失显著增加了小鼠的存活率,降低了细菌在血液、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑组织的定殖能力和对肺组织的病理损伤并显著减弱SS2对HeLa细胞的黏附与侵袭能力及抗巨噬细胞吞噬能力。【结论】Orf207基因可以显著降低SS2对宿主的致病能力,本研究结果不仅丰富了SS2的致病机制,也为SS2疫苗等研发提供了新靶点。     

猪链球菌2型分选酶srtBCD 基因敲除株的构建及其生物学特性分析

【目的】阐明分选酶srtBCD基因在猪链球菌2型致病过程中的作用。【方法】利用同源重组原理构建中间为壮观霉素、两侧为srtBCD基因上下游片段的重组质粒,将构建好的质粒电转化入猪链球菌感受态,筛选srtBCD缺失的突变株,并通过组合PCR和逆转录PCR对其进行验证。生物学功能实验研究srtBCD突变株和野毒株05Z33在生长速率、粘附、毒力等方面的差异。【结果】组合PCR和逆转录PCR结果均证实srtBCD突变株构建成功,体外实验结果显示srtBCD缺失后细菌的生长速率减慢,与Hep-2上皮细胞的粘附率明显降低,小鼠毒力实验数据表明突变株毒力无明显变化。【结论】猪链球菌2型srtBCD基因与细菌的粘附能力有关,为进一步研究猪链球菌2型的致病机理奠定基础。     

clpE基因缺失对肺炎链球菌毒力的影响

【目的】 探索clpE基因缺失对肺炎链球菌毒力的影响。【方法】 用长臂同源多聚酶链式反应(LFH-PCR)方法失活clpE基因,用PCR、测序鉴定缺失菌株,通过动物实验观察clpE基因缺失株毒力改变情况, 同时用细胞实验比较clpE基因缺失株和野生菌对宿主细胞的粘附和侵袭能力,最后用实时荧光定量PCR分析自溶素(major autolysin A,lytA)、表面黏附素A(pneumococcal surface adhesion A,psaA)、溶血素(pneumolysin,ply)、肺炎球菌表面蛋白A（pneumococcal surface protein A, pspA)和神经氨酸酶（neuraminidase, nanA）的表达。 【结果】小鼠毒力实验表明野生菌株半数致死时间54h,而缺失株半数致死时间为21d,两者比较有统计学差异（P<0 .0l）;缺失菌在对宿主细胞的粘附能力明显低于野生菌株（P<0.05）。实时荧光定量PCR显示clpE缺失株的五个毒力因子mRNA表达水平均低于野生菌,两者比较有统计学差异（P<0. 05）;【结论】ClpE通过调控肺炎链球菌多种毒力因子表达,而影响其毒力。     

柑橘溃疡病菌II型分泌通道基因xpsD突变体的鉴定及功能分析

【目的】鉴定柑橘溃疡病菌胞外水解酶减弱突变体Mxac56-20的Tn5插入位点,及其在柑橘上的致病力。【方法】采用质粒拯救方法获得Tn5旁侧序列,与基因组信息比对后明确突变体的插入位点;构建功能互补载体对突变体进行功能互补,检测互补菌株胞外蛋白水解酶、纤维素酶和淀粉酶的恢复情况;在寄主植物柑橘上观察致病力变化。【结果】Mxac56-20的Tn5插入位点是II型分泌系统xpsD基因,所构建的互补载体使突变体的胞外水解酶活性和致病力得到恢复。【结论】柑橘溃疡病菌xpsD基因的突变,导致胞外水解酶活性降低,在寄主上的致病力减弱,说明柑橘溃疡病菌的II型分泌系统在与寄主互作过程中起到致病因子的作用。     

Definition of the first mannosylation step in phosphatidylinositol mannoside synthesis. PimA is essential for growth of mycobacteria

We examined the function of the pimA (Rv2610c) gene, located in the vicinity of the phosphatidylinositol synthase gene in the genomes of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium smegmatis, which encodes a putative mannosyltransferase involved in the early steps of phosphatidylinositol mannoside synthesis. A cell-free assay was developed in which membranes from M. smegmatis overexpressing the pimA gene incorporate mannose from GDP-[(14)C]Man into di- and tri-acylated phosphatidylinositol mono-mannosides. Moreover, crude extracts from Escherichia coli producing a recombinant PimA protein synthesized diacylated phosphatidylinositol mono-mannoside from GDP-[(14)C]Man and bovine phosphatidylinositol. To determine whether PimA is an essential enzyme of mycobacteria, we constructed a pimA conditional mutant of M. smegmatis. The ability of this mutant to synthesize the PimA mannosyltransferase was dependent on the presence of a functional copy of the pimA gene carried on a temperature-sensitive rescue plasmid. We demonstrate here that the pimA mutant is unable to grow at the higher temperature at which the rescue plasmid is lost. Thus, the synthesis of phosphatidylinositol mono-mannosides and derived higher phosphatidylinositol mannosides in M. smegmatis appears to be dependent on PimA and essential for growth. This work provides the first direct evidence of the essentiality of phosphatidylinositol mannosides for the growth of mycobacteria.     

高致病性2型猪链球菌截短型类枯草杆菌丝氨酸蛋白酶基因的鉴定和功能研究

【目的】克隆表达高致病性2型猪链球菌05ZYH33株的SspA截短型基因,验证其是否具有酶学活性,并构建该基因的缺失突变株细菌,探讨其在2型猪链球菌致病过程中所起的作用【。方法】构建SS2的SspA截短型基因05SSU0811原核表达质粒,表达并纯化05SSU0811蛋白,运用丝氨酸蛋白酶底物Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide(pNa),通过显色反应检测表达产物的酶学活性;运用同源重组技术敲除05SSU0811基因,多重交叉PCR筛选敲除株并测序鉴定,动物试验分析05SSU0811基因缺失对细菌毒力的影响。【结果】成功表达并纯化05SSU0811蛋白,浓度约为3.5 g/L。丝氨酸蛋白酶活性测定试验证实其具有酶学活性;获得05SSU0811基因缺失突变株,小鼠攻毒试验表明,野生株攻毒的20只小鼠全部死亡,基因缺失突变株攻毒组死亡9只,死亡率45%,两组间死亡率有显著性差异。表明05SSU0811基因缺失的菌株毒力较野生株明显下降。【结论】05SSU0811基因编码的截短型丝氨酸蛋白酶仍然具有酶学活性,SS2的截短型基因SspA在高致病性2型猪链球菌的致病性方面具有一定作用。     

苏云金素合成基因簇中非核糖体肽合成酶基因thu2功能的初步分析

对苏云金素生物合成基因簇中编码非核糖体肽合成酶基因thu2进行基因缺失插入失活的研究。用温敏型质粒pHT304-TS构建基因thu2的插入缺失质粒pEMB1434,电转化苏云金芽胞杆菌菌株CT-43后,通过抗性筛选和PCR验证得到thu2基因同源双交换基因敲除突变株CT-43-22。HPLC(高效液相色谱,High Performance Liquid Chromatography)检测发现CT-43-22没有苏云金素特征吸收峰;用pHT304构建得到含有完整thu2基因的回补质粒pEMB1435,电转化CT-43-22后得到互补重组菌CT-43-22b,发现其恢复了苏云金素的产生。显微镜观察突变株和互补重组菌均能产生正常的晶体和芽胞。thu2的基因敲除和基因互补实验证明,thu2基因为CT-43苏云金素生物合成的必需基因,但对晶体和芽胞的形成没有影响。     

卡介苗阿拉伯糖苷转移酶embC基因敲除株的构建和初步鉴定

目的采用基因敲除技术构建了卡介苗embC基因缺失株。方法从卡介苗基因组中扩增出embC基因,定向插入自杀质粒p2NIL中,切除embC基因中约1000bp片段使其失活,再定向插入标记片段,筛选鉴定阳性克隆,电穿孔转入卡介苗,筛选重组菌株。结果PCR和酶切鉴定证明构建成功用于基因打靶的置换型自杀质粒,并筛选成功获得重组卡介苗。结论获得了卡介苗embC基因敲除株,为进一步研究对卡介苗免疫活性的影响奠定了基础。     

Expression of baculovirus late and very late genes depends on LEF-4, a component of the viral RNA polymerase whose guanyltransferase function is essential

Baculovirus lef-4 encodes one subunit of the viral RNA polymerase. Here, we demonstrate the essential nature of LEF-4 by RNA interference and bacmid knockout technology. Silencing of LEF-4 in wild-type virus-infected cells suppressed expression of structural genes, while early expression was unaffected, demonstrating its essential role in late gene expression. After transfection of insect cells with lef-4 mutant bacmid, no viral progeny was produced, further defining its central role in infection. Cotransfection with wild-type lef-4 plasmid restored normal replication, but plasmid encoding a guanyltransferase-deficient version failed to rescue. These results emphasize the importance of the mRNA capping function of LEF-4.     

Development of a gene knockout system for the halophilic archaeon Haloferax volcanii by use of the pyrE gene

So far, the extremely halophilic archaeon Haloferax volcanii has the best genetic tools among the archaea. However, the lack of an efficient gene knockout system for this organism has hampered further genetic studies. In this paper we describe the development of pyrE-based positive selection and counterselection systems to generate an efficient gene knockout system. The H. volacanii pyrE1 and pyrE2 genes were isolated, and the pyrE2 gene was shown to code for the physiological enzyme orotate phosphoribosyl transferase. A DeltapyrE2 strain was constructed and used to isolate deletion mutants by the following two steps: (i) integration of a nonreplicative plasmid carrying both the pyrE2 wild-type gene, as a selectable marker, and a cloned chromosomal DNA fragment containing a deletion in the desired gene; and (ii) excision of the integrated plasmid after selection with 5-fluoroorotic acid. Application of this gene knockout system is described.     

The nucleotide sequence of the Escherichia coli rts gene

The nucleotide sequence of rts, an essential Escherichia coli gene, has been determined. Transformation of an rts mutant with the plasmid, pJAF1, containing the rts gene resulted in rescue of the defect. The transformation experiments indicate that the rts gene is distinct from the flanking birA, tRNA and tufB genes.     

炭疽芽孢杆菌A16R株eag基因缺失突变株构建

【目的】构建炭疽芽孢杆菌A16R株eag基因缺失突变株, 为研究eag基因的功能奠定了基础。【方法】本研究以我国人用炭疽杆菌活疫苗A16R株中eag基因为目的缺失基因,根据炭疽芽孢杆菌Ames株基因组序列,利用软件设计了扩增上下游同源臂以及抗性基因引物,构建了重组质粒,将该重组质粒电击转入炭疽杆菌A16R感受态细胞中,利用同源重组原理筛选到炭疽杆菌A16R株eag基因缺失突变株。在分子水平及蛋白质组学方面对基因缺失突变株进行验证。【结果】成功构建了重组质粒,经同源重组后获得eag基因缺失突变株。PCR鉴定表明目的基因已经丢失;SDS PAGE表明野生株与突变株在93 KDa处有差异蛋白条带,经质谱鉴定分析该条带为目的基因所表达的EA1蛋白;双向电泳结果显示突变株与野生株比较明显缺失3个蛋白点,经质谱分析后确定这3个点都是EA1蛋白。【结论】成功获得炭疽芽孢杆菌A16R株eag基因缺失突变株,为深入研究eag基因的功能奠定了基础,同时也为炭疽芽孢杆菌重要基因功能的研究建立了一个良好的技术平台。