新城疫壳聚糖微球疫苗免疫效果的研究

鸡新城疫是由新城疫病毒引起的鸡的一种急性、烈性、高度接触性传染病,是危害养禽业的最严重疫病之一。控制新城疫最根本的措施是进行有效的疫苗接种,目前常用的疫苗是弱毒活疫苗和灭活疫苗,但二者在实际应用中均存在一定的局限性。口服微球疫苗可以诱导较强的粘膜免疫;同时还能够诱导产生系统的体液免疫和细胞免疫,已成为ND疫苗研究的热点。以壳聚糖为囊材,新城疫La Sota抗原液为芯材,戊二醛为交联剂,制备出新城疫壳聚糖微球疫苗,通过了实验室安全检验和效力检验。将新城疫壳聚糖微球疫苗与LaSota活疫苗和新城疫油乳剂灭活苗分别免疫SPF鸡,利用MTT、血凝抑制法(HI)和ELISA等分别检测不同疫苗免疫后的细胞免疫、体液免疫和粘膜免疫抗体IgA,并在当免疫鸡HI抗体降到23的情况下进行了攻毒试验。结果表明,新城疫壳聚糖微球疫苗安全性好,免疫后可刺激机体产生较强的细胞免疫、体液免疫和局粘膜免疫,具有较好的保护作用。     

弱毒疫苗中鸡传染性贫血病毒低剂量污染对SPF鸡体重和疫苗免疫抗体的影响

为了观察使用污染有低剂量鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)弱毒疫苗后对鸡免疫和体重的影响,本研究通过人工模拟试验观察了CIAV低剂量污染对SPF鸡体重以及对NDV疫苗抗体产生的影响。结果显示使用每羽份污染10个EID50CIAV和5个EID50CIAV两种剂量的NDV疫苗后均造成了SPF鸡体重的下降,与使用未污染疫苗组相比差异显著;并且使用污染两种剂量CIAV的疫苗后NDV抗体水平与使用无污染组相比也降低了,差异显著。使用污染两种剂量CIAV的NDV疫苗后第2周开始均检测到一定比例的CIAV抗体阳性,而通过核酸检测在使用污染疫苗后第1周就检测到很高比例的CIAV核酸阳性。研究结果不仅展示了弱毒疫苗中CIAV污染对SPF鸡生产性能和免疫机能的影响,也提示我们在通过SPF鸡检查法检测外源病毒污染时增加对病毒核酸检测有助于节省检测时间和提高检出率。     

禽呼肠孤病毒感染对鸡法氏囊及免疫应答的影响

研究LY株禽呼肠孤病毒(ARV)感染1日龄SPF鸡后对法氏囊发育影响,对传染性法氏囊病毒(IBDV)、禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)疫苗免疫诱发的抗体的影响,及对强毒株IBDV致病作用的影响。结果表明,LY株ARV感染1日龄SPF鸡可引起法氏囊萎缩和部分淋巴细胞减少,但对增重及AIV和NDV疫苗免疫后抗体滴度却没有显著影响。ARV感染可降低弱毒IBDV疫苗免疫后的抗体反应,但对随后IBDV强毒株攻毒的抵抗力却与对照鸡无显著差异。经IBDV弱毒疫苗免疫后,再接种强毒株IBDV,不会引起死亡,但却仍能显著抑制对AIV、NDV疫苗免疫后的抗体滴度。然而,对于1~7日龄经ARV感染的鸡,IBDV强毒的这种免疫抑制作用又显著低于未经ARV感染的对照鸡。     

稳定携带新城疫病毒DNA疫苗减毒沙门氏菌的构建及其免疫原性

采用PCR技术从重组质粒pVAX1-F中扩增出新城疫病毒JS5株的融合蛋白(F)基因,将其克隆入真核表达质粒pmcDNA3.1 中,获得重组表达质粒pmcDNA3.1-F.通过电穿孔转化法将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建成功携带DNA疫苗的重组沙门氏菌SL7207(pmcDNA3.1-F).体内、体外试验结果表明,重组质粒pmcDNA3.1-F在沙门氏菌中的稳定性显著高于pcDNA3.1-F.将重组菌SL7207(pmcDNA3.1-F)和SL7207(pcDNA3.1-F)分别以1×109 CFU剂量两次口服免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠可产生针对新城疫病毒F蛋白的血清抗体和黏膜抗体.重组菌以5×109 CFU剂量两次口服免疫4日龄SPF鸡,免疫鸡产生的针对新城疫病毒F蛋白的血清抗体和小肠黏膜抗体效价水平与空载体组之间存在显著性差异(P＜0.05).免疫保护试验结果显示,SL7207(pmcDNA3.1-F)和SL7207(pcDNA3.1-F)免疫组的免疫保护率均与空载体组之间存在显著性差异(P＜0.05),且SL7207(pmcDNA3.1-F)免疫组的保护率较SL7207(pcDNA3.1-F)免疫组提高了20.0%,说明稳定携带新城疫病毒DNA疫苗的减毒沙门氏菌具有良好的免疫原性和免疫保护性.     

粘膜免疫系统与粘膜免疫应答的诱导

粘膜免疫系统是机体抵抗病原体入健的第一道免疫屏蔽,同机体的系统免疫相比,粘膜免疫系统的淋巴细胞总数远远超过存在于骨髓,胸,腺,脾脏以及淋巴结中的淋巴细胞数量,粘膜表面分泌性免疫球蛋白A（sIgA)的量显高于循环IgG的总量,而且粘膜分泌物中的抗体以IgA抗体为主,由于粘膜免疫系统的区域性分布,诱导系统免疫的免疫途径和免疫佐剂不能诱导粘膜免疫应答,经消化道,呼吸道和生殖道免疫可有效地诱导粘膜免疫应答,霍乱毒素是良好的粘膜免疫,佐剂,能有效地诱导粘膜免疫应答,粘膜免疫的上述特点可能是某些疫苗经系统免疫后,尽管能诱导血液中产生高滴度的IgG抗体,但不能预防疾病的原因。     

马传染性贫血病毒弱毒疫苗株与亲本强毒株的体内病毒载量与诱导保护性免疫关系的研究

慢病毒免疫应答的载量阈值学说认为病毒载量决定了机体对病毒反应的类型。为了探讨马传染性贫血病毒(EIAV)血浆病毒载量与马体免疫保护的相关性,本研究利用Real-time RT-PCR方法对EIAV弱毒疫苗株(EIA-VDLV125)免疫马和EIAV强毒株(EIAVLN40)非致死剂量接种马血浆中病毒载量进行了动态比较。结果显示两组马在监测过程中皆可检测到相似水平的病毒载量(103～105copies/mL),且两者之间差异不显著(P0.05)。以上毒株接种23周后,对马匹进行了强毒株(EIAVLN40)的致死剂量攻毒,根据攻毒后典型马传贫急性发病与否确定接种保护率。结果显示,疫苗组的保护率为67%而非致死剂量强毒组的保护率为0。以上结果提示,病毒血浆载量不是决定EIAV弱毒疫苗诱导免疫保护能力的主要或单一因素。     

敲除Meq基因的重组鸡马立克氏病毒与CVI988/Rispens疫苗株免疫保护效力的比较

【目的】比较敲除meq基因的马立克氏病毒(MDV)与标准疫苗株CVI988/Rispens对MDV超强毒GX0101攻毒的免疫保护作用。【方法】本实验将1日龄SPF鸡120只随机分成4组,每组30只,分别饲养在正压过滤空气的SPF动物饲养隔离罩内。1日龄时,第1组鸡以2000PFU/只的剂量颈部皮下接种SC9-1;第2组鸡以2000PFU/只的剂量颈部皮下接种CVI988/Rispens;第3、4组为不免疫攻毒对照组。免疫接种后5 d后,第1、2、3组分别以2000PFU/只的剂量腹腔接种MDV GX0101。饲养至90日龄,记录死亡情况,对死亡鸡只剖检,并取疑似马立克特有病变脏器做病理切片。期间,检测不同免疫状态下病毒GX0101的增殖动态以及禽流感、新城疫灭活苗在鸡体诱导产生抗体的水平。对含有MDV母源抗体的海蓝褐鸡的试验方案与SPF鸡一致。【结果】SC9-1株免疫对感染MDV GX0101攻击SPF鸡、海兰褐鸡均提供100%的免疫保护作用;CVI988/Rispens对SPF鸡、海兰褐鸡分别提供86.7%、93%的免疫保护作用。未免疫SPF鸡攻毒组死亡率为53.3%,肿瘤率为16.7%;未免疫海兰褐鸡攻毒组死亡率为36.7%,肿瘤率为6.67%;相比,空白对照组鸡只没有任何病变及死亡。荧光定量结果显示,淋巴细胞和羽毛囊DNA中,SC9-1免疫组鸡体内GX0101的病毒拷贝数显著低于CVI988/Rispens免疫组。血凝抑制试验结果显示,SC9-1免疫攻毒组鸡的产生的AIV、NDV抗体水平高于CVI988/Rispens免疫攻毒组。【结论】SC9-1株免疫无论在SPF鸡还是含有MDV母源抗体的海兰褐鸡均能提供比CVI988/Rispens更好的免疫保护效果。     

鸡新城疫病毒HeB02分离株F基因的克隆及其DNA疫苗的研究

根据GenBank报道的鸡新城疫病毒F基因序列设计了一对引物,以鸡新城疫病毒HeB02分离株基因组为模板,通过RT-PCR扩增出了1·66kb左右的F基因片段,序列分析表明HeB02株F基因与国内标准强毒株F48E9及弱毒疫苗La Sota和Clone30的F基因核苷酸序列的同源性分别为88·1%、84·9%和83·8%。将HeB02株F基因插入真核表达载体pVAX1中,构建了真核表达质粒pSV-F,通过脂质体转染COS-7细胞,SDS-PAGE分析可见表达的特异蛋白条带;Western blot、ELISA和中和试验检测结果表明:真核表达的蛋白与抗新城疫病毒的抗体发生特异性反应,说明F蛋白具有很好的免疫原性。采用活体电击法以真核表达质粒pSV-F免疫3周龄SPF鸡,剂量为50μg/只,3周后加强免疫1次,5周后以100倍鸡胚感染剂量(EID)的F基因同源病毒对所有鸡进行攻毒,攻毒前后每周分别以喉拭子进行病毒分离和HI效价测定。结果显示对照组在攻毒前一直没有检测到抗体效价,攻毒后检测效价为3·0log2±1·40,并且于攻毒后第9天全部死亡;活疫苗组和实验组免疫后第2周检测到抗体效价,第5周最高,HI效价分别为8·3log2±1·30和7·2log2±1·23,攻毒1周后HI效价分别达9·8log2±1·55和8·9log2±1·77,极显著高于对照组(P<0·01)。免疫组未分离到新城疫病毒,对照组全部分离到新城疫病毒。表明所构建的F基因真核表达质粒可作为候选基因疫苗诱导鸡产生免疫保护反应。     

实验性雏鸡马立克病外周血淋巴细胞GRmRNA表达

目的探讨马立克病对鸡外周血淋巴细胞GRmRNA表达的影响,为马立克病的发病机理提供重要依据.方法采用3H-Dex和32P-GRcDNA两种分子探针,对7日龄接种MDV京-1株和1日龄免疫接种MD疫苗雏鸡的外周血淋巴细胞进行了GR和GRmRNA检测.结果攻毒组鸡淋巴细胞GR和GRmRNA含量逐渐下降,至攻毒2周后,显著低于免疫组和健康对照组(P<0.05),而免疫组和健康对照组之间差异无显著性(P>0.05).实验鸡经25mg/kg剂量的皮质酮缓释剂隔夜处理,外周血淋巴细胞GRmRNA水平略下降,为健康对照鸡下降幅度的一半.结论鸡血液中糖皮质激素活性增高和淋巴细胞GRmRNA表达水平低下介导MD鸡细胞免疫抑制,同时诱导广泛的淋巴组织增生性病变.     

轮状病毒灭活疫苗和减毒活疫苗序贯免疫的体液免疫应答效果

目的:评价采用轮状病毒灭活疫苗进行初始免疫,减毒活疫苗进行加强免疫的序贯免疫方案的体液免疫应答效果。方法:将实验小鼠随机分为4组(口服疫苗组、序贯疫苗组、口服对照组及序贯对照组),按相应方案免疫后,ELISA检测血清轮状病毒特异性IgG和IgA、肠道轮状病毒特异性IgA;微量中和实验检测血清病毒特异性中和抗体;同时采用ELISA分析口服活疫苗后病毒排出情况。结果:与对照组相比,序贯疫苗组小鼠产生的轮状病毒特异性血清IgG、IgA、中和抗体及肠道IgA水平显著升高。与口服疫苗组相比,序贯疫苗组的免疫方案诱发的轮状病毒特异性血清IgG、IgA、中和抗体水平显著升高,肠道IgA水平两组间没有显著差异。同时,与口服疫苗组相比,序贯疫苗组中轮状病毒灭活疫苗进行的初始免疫未影响第一次口服活疫苗后病毒的排出量和排出时间,但序贯疫苗组第二次口服活疫苗后病毒的排出量迅速减少,排毒时间快速缩短,与口服疫苗组第三次服苗后病毒的排出量和排出时间相似。结论: 轮状病毒灭活疫苗和减毒活疫苗序贯免疫可有效诱发小鼠全身和黏膜局部的体液免疫应答,该方案将有可能成为轮状病毒疫苗临床应用的候选方案。