不同修饰对壳聚糖转基因效果的影响

目的:探讨不同修饰的壳聚糖包裹的质粒(Chi-DNA)纳米复合物在口服发送中外源 基因在消化道中的表达差异.方法:分别使用明胶、海藻酸钠、PEG及乙酰化修饰包裹含Lac Z的质粒pCMVa的壳聚糖纳米颗粒,通过口服发送后经X-gal染色检测目的基因在小鼠体内的 表达.结果:修饰后的Chi-DNA纳米复合物都能抵抗胃酸的降解0.5h以上 ,其中PEG及乙酰化 修饰的Chi-DNA纳米复合物在胃酸处理1h时仍有部分残留.X-gal染色显示,修饰后的Chi-DN A纳米复合物都有a半乳糖苷酶的表达,其中PEG、海藻酸钠修饰的Chi-DNA纳米复合物在鼠 胃和小肠中表达量最高.结论:PEG、海藻酸钠修饰的Chi-DNA纳米复合物有望成为高效的基因治疗用非病毒口服发送系统.     

聚乙烯亚胺包裹小环DNA形成的纳米颗粒传输外源基因的性质表征

聚乙烯亚胺(PEI)是一种具有良好生物安全性和生物相容性的非病毒载体,能高效转染肿瘤细胞。小环DNA是一种去除质粒细菌骨架,只含有目的基因表达框的环状DNA分子。与普通质粒相比,小环DNA具有表达效率高、持续时间长的优势。使用PEI包裹携带报告基因gfp和抑癌基因pten小环DNA载体,并利用各种技术手段分析了该传输系统的理化性质和生物学效应。凝胶阻滞实验、电镜实验及MTT实验分析结果表明利用PEI包裹小环DNA和质粒DNA体系性质无显著的差别,并且2种复合物对细胞毒性亦无明显差别;但是动态光散射实验结果显示由于PEI可以包裹更多数量的小环DNA,所以PEI包裹小环DNA形成的复合物粒径要略大于包裹质粒DNA形成的复合物粒径。荧光显微镜实验、real-time PCR分析和Western blotting分析结果表明,PEI包裹小环DNA形成的复合物对细胞的转染效率要远远高于PEI包裹质粒DNA所形成的复合物,并且小环所携带的外源基因的表达效率要远远高于质粒DNA所携带的外源基因的表达效率。实验结果表明,PEI包裹小环DNA形成的纳米颗粒在细胞转染过程中具有很高的表达效率,这一研究结果为PEI包裹小环DNA的非病毒载体系统在传输外源基因过程中的应用提供理论基础和技术支持。     

口服草原兔尾鼠卵透明带3纳米乳剂DNA疫苗免疫效果研究

用免疫不育疫苗控制有害动物的数量成为动物种群数量控制的一个有效措施,对于大多数动物来说．口服饵料发送系统是最好的选择。但是口服疫苗容易产生耐受,且生物利用度低,利用多聚物包裹口服疫苗是一种打破口服耐受．提高其生物利用度的新途径。本文以纳米乳剂作为草原兔尾鼠卵透明带3（Lugurus zone pellucida 3,LZP3）DNA疫苗的发送载体,探讨通过口服途径增强小鼠的免疫效果和抗生育率。用纳米乳剂包裹lzp3 DNA疫苗后,采用强阴离子交换色谱法测定纳米乳剂的包封率．将制备好的质粒纳米乳剂lzp3 DNA疫苗通过口服饵料免疫小鼠,检测到免疫后小鼠的体内产生了特异性的抗LZP3的IgG和IgA。对免疫后小鼠进行抗生育实验,分析生育后免疫小鼠的卵巢病理切片。研究结果表明,用质粒纳米乳剂如p3DNA疫苗通过口服途径免疫．在小鼠的血清和粘液中检测到了特异性的抗LZP3的IgG和IgA,同时也产生了相应的抗生育作用．表明纳米乳剂作为口服不育疫苗的发送载体是可行的,为草原兔尾鼠鼠害的防治提供了理论基础．     

猪白细胞介素4、6融合基因对小鼠免疫的影响

目的：研究猪白细胞介素IL4、IL6融合基因（PIL46）对小鼠免疫应答的反应。方法：以壳聚糖纳米颗粒包裹融合基因（PIL46）的真核表达质粒（VPIL46）接种昆明小鼠,免疫后28日以口服攻毒实验小鼠,观察其体液和细胞免疫水平指标的变化和病变情况。实验结果发现：CNP包裹VPIL46接种小鼠体液免疫和细胞免疫指标不同程度地增多,均显著高于对照组（P〈0．05）;与CNP包裹VPIL4＋6免疫效果相近。免疫后28日以口服攻毒实验小鼠,检测结果发现：CNP包裹VPIL46组和CNP包裹VPIL4＋6组小鼠的上述免疫指标除中性粒细胞外均显著多于对照小鼠,免疫小鼠无症状和病变,健康存活;而对照小鼠均发病,消化道组织器官呈现明显出血病变。结论：PIL46基在具有显著增强小鼠体液和细胞免疫机能、提高对大肠杆菌感染抵抗力的免疫调节效应,可作为有效的抗感染免疫调节剂。     

载基因壳聚糖纳米粒的制备及免疫增强作用的初步研究

摘 要 目的: 制备壳聚糖载基因纳米粒,并对其体外转染效率及其在小鼠体内的免疫增强效果进行初步研究。方法: 以本课题组构建的口蹄疫DNA疫苗为模型药物,采用复凝聚法制备纳米粒;用透射电镜观察形态;用纳米粒度分析仪测定粒径、多分散度和zeta电位;凝胶阻滞分析测定基因在纳米粒中的位置;用体外基因转染实验评价纳米粒的转染活性。用载基因壳聚糖纳米粒免疫雌性Balb/c小鼠,检测免疫小鼠的细胞免疫和体液免疫水平。结果: 所制备的载基因纳米粒形态规则、大多成球形,平均粒径约为150nm,多分散度＜0.26,zeta电位约为21mV;凝胶分析结果表明质粒DNA与壳聚糖分子间可以通过电性结合作用而完全结合,基因几乎全部被包裹在纳米粒内部;体外基因转染实验表明壳聚糖作为一种新型的非病毒基因递送载体能够高效传递DNA进入BHK-21细胞,基因能够在该细胞中高效表达;小鼠免疫实验表明纳米粒不仅能诱导机体产生较高的细胞免疫水平,而且体液免疫水平也显著提高。结论: 壳聚糖纳米粒能将基因递送到细胞内并且能够表达,小鼠免疫实验显示其具有良好的免疫增强效果。     

hCGβ真核表达载体的构建和瞬时表达筛选

为探讨人绒毛膜促性腺激素β亚基（hCGβ）基因避孕疫苗的可能性,利用DNA重组技术将hCGβ的基因片段连接到真核表达载体pCMV4上,酶切分析鉴定正确构建了质粒DNApCMV4-hCGβ,将质粒DNApCMV4-hCGβ通过脂质体转染的方法导入体外培养的Hela细胞,双抗夹心ELISA法检测质粒DNApCMV4-hCGβ在Hela细胞瞬时表达系统中特异性的表达了hCGβ。结果表明hCGβ表达含量24h为6.78ng/ml,48h为15.24ng/ml,说明在体外瞬时表达了特异性hCGβ的pCMV4-hCGβ真核表达载体能够作为DNA疫苗使用,为pCMV4-hCGβ质粒DNA免疫小鼠进行DNA避孕疫苗的研究奠定了基础。     

HBXIP基因对乙肝病毒X蛋白诱导细胞凋亡的影响

探讨乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白(hepatitisBXinteractingprotein ,HBXIP)基因在乙型肝炎病毒X蛋白(HBX)诱导肝癌细胞凋亡时对细胞周期的影响.构建HBXIP基因真核表达载体pcDNA3 hbxip ,进行瞬时基因转染,将克隆有HBx基因的pCMV X (分别为1μg、2 μg和3μg)和pcDNA3 hbxip质粒分别和共转染至人H74 0 2肝癌细胞中(总体积分别为5 0 μl) .发现瞬时转染3μgpCMV X质粒后,肝癌细胞凋亡发生率为34 4 % ,肝癌细胞的细胞周期相关蛋白p2 7表达水平发生明显上调;与对照组相比,瞬时转染1μg、2 μg和3μg时,细胞周期蛋白D和细胞周期蛋白E的表达水平均发生明显上调,但随着HBX水平的增加细胞周期蛋白D和细胞周期蛋白E的表达水平发生明显下降;在稳定转染pCMV X质粒的H74 0 2 X肝癌细胞中无明显的细胞凋亡发生,研究发现p2 7的表达水平发生了明显下调,而细胞周期蛋白D和细胞周期蛋白E的表达水平发生了明显上调;当pcDNA3 hbxip质粒与pCMV X质粒进行共瞬时转染时,细胞凋亡发生率由pcDNA3质粒与pCMV X质粒共转染时的2 9 2 %下降为13 3% ,p2 7的表达水平发生了下调,但细胞周期蛋白D和细胞周期蛋白E的表达水平无明显变化.研究结果表明,瞬时转染一定剂量的x基因可导致肝癌细胞发生凋亡,细胞周期相关蛋白p2 7、细胞周期蛋白D和     

壳聚糖携载质粒纳米微球体外转染兔关节软骨细胞的实验研究

目的:研究携载质粒的不同分子量的壳聚糖纳米微球的包裹率和保护DNA的能力,镜下观察其大小和形态,观察其对原代兔关节软骨细胞的转染效率。方法:利用酶消化法消化3周龄新西兰大白兔的关节软骨,贴壁培养原代兔关节软骨细胞。购买相对分子量在5K和800K之间的八种壳聚糖,利用表达增强型绿色荧光蛋白的质粒(pEGFP)作报告基因,通过复合凝聚法制备壳聚糖-质粒纳米微球。琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计分析不同N/P比值对不同分子量壳聚糖和质粒的结合能力及包封率的影响;纳米粒度仪、透射电子显微镜和环境扫描电子显微镜考察纳米微球的粒径分布和形态;荧光显微镜观察壳聚糖纳米微球介导pEGFP在体外培养的兔关节软骨细胞中的表达情况;流失细胞仪计算具体转染效率。结果:①N/P值为4及4以上时,各分子量的壳聚糖可完全包裹质粒成球;N/P值为2时,分子量为5K、50K、85K仅部分包裹质粒,其余可完全包裹;N/P值为1时,各壳聚糖均与质粒部分包裹;N/P值为0.25时,各壳聚糖均与质粒完全分离。②纳米粒度仪分析得出:N/P值为4时,各分子量的壳聚糖纳米微球的平均粒径均在1微米以下,③透射电子显微镜和扫描电子显微镜均可观察到球形或不规则形的大小不同的微球。荧光显微镜可大致观察到绿色荧光蛋白在软骨细胞内表达的表达情况。④流式细胞仪得出具体转染效率,分子量为170K、250K和800K的壳聚糖纳米微球的转染效率均高于5K、50K和85K的壳聚糖纳米微球,其中800K的壳聚糖纳米微球与脂质体相当(差异有统计学意义,P<0.05)。结论:与脂质体相比,N/P比值为4时,相对分子量为800k的壳聚糖纳米微球可高效转染原代培养的兔软骨细胞,可以作为今后进一步体外、体内实验的首选转染载体。     

修饰猪IGF-1基因壳聚糖纳米颗粒对小鼠生长及免疫的促进效应(英文)

目的研究比较修饰后IGF-1基因对小鼠免疫机能及生长的影响,探索研制调控动物免疫和生长发育的新型安全高效的分子制剂。方法通过重叠PCR扩增技术克隆得到新型短链IGF-1基因,将其分别构建到原核表达载体pGEX-4T-1及真核表达载体VR1020中,得到重组质粒pGG,pGF,VRG和VRF,分别进行体外实验检测器表达活性;然后用壳聚糖和mPEG-PEI修饰得壳聚糖通过离子交联包裹重组质粒,将包裹后形成的纳米颗粒,按0.1mg质粒/只的剂量接种3周龄昆明小鼠。在免疫前及免疫后每隔一周采血,检测小鼠体重变化,血常规检测免疫细胞数量的变化,流式细胞分型技术检测CD4+/CD8+标记的T细胞,并且通过MTT实验检测上清对L-02细胞的增殖作用。结果发现免疫后14～42d之间,与对照组相比实验组VRI、VRG小鼠外周血中淋巴细胞、CD4+T细胞量明显升高(P<0.05);并且免疫后14～56d之间,与对照组相比,实验组VRI、VRG对小鼠生长的促进作用也非常显著(P<0.05);另外mPEG-PEI-CS和CS包裹VRI、VRG接种的实验组小鼠血清对L-02细胞具有明显的增殖作用。结论我们的研究首次证明在小鼠免疫后14～42d中,VRG/F与对照组相比,对L-02细胞具有明显的增殖作用(P<0.05)。这些结果说明了短链的IGF-1基因能够促进接种后小鼠的生长发育,提高其免疫功能,为进一步研究控制动物传染疾病安全高效的生物制剂奠定了基础。     

壳聚糖携载质粒纳米微球体外转染兔关节软骨细胞的实验研究

目的：研究携载质粒的不同分子量的壳聚糖纳米微球的包裹率和保护DNA的能力,镜下观察其大小和形态,观察其对原代兔关节软骨细胞的转染效率。方法：利用酶消化法消化3周龄新西兰大白兔的关节软骨,贴壁培养原代兔关节软骨细胞。购买相对分子量在5K和800K之间的八种壳聚糖,利用表达增强型绿色荧光蛋白的质粒（pEGFP）作报告基因,通过复合凝聚法制备壳聚糖-质粒纳米微球。琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计分析不同N/P比值对不同分子量壳聚糖和质粒的结合能力及包封率的影响;纳米粒度仪、透射电子显微镜和环境扫描电子显微镜考察纳米微球的粒径分布和形态;荧光显微镜观察壳聚糖纳米微球介导pEGFP在体外培养的兔关节软骨细胞中的表达情况;流失细胞仪计算具体转染效率。结果：①N/P值为4及4以上时,各分子量的壳聚糖可完全包裹质粒成球;N/P值为2时,分子量为5K、50K、85K仅部分包裹质粒,其余可完全包裹;N/P值为1时,各壳聚糖均与质粒部分包裹;N/P值为0.25时,各壳聚糖均与质粒完全分离。②纳米粒度仪分析得出：N/P值为4时,各分子量的壳聚糖纳米微球的平均粒径均在1微米以下,③透射电子显微镜和扫描电子显微镜均可观察到球形或不规则形的大小不同的微球。荧光显微镜可大致观察到绿色荧光蛋白在软骨细胞内表达的表达情况。④流式细胞仪得出具体转染效率,分子量为170K、250K和800K的壳聚糖纳米微球的转染效率均高于5K、50K和85K的壳聚糖纳米微球,其中800K的壳聚糖纳米微球与脂质体相当（差异有统计学意义,P〈0.05）。结论：与脂质体相比,N/P比值为4时,相对分子量为800k的壳聚糖纳米微球可高效转染原代培养的兔软骨细胞,可以作为今后进一步体外、体内实验的首选转染载体。