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介绍了液相原位反转录PCR(inwellinsituRTPCR)的操作程序、存在的问题及改良方法,最后探讨了原位反转录PCR在研究RNA转录、加工、编辑和多聚腺苷酸化等方面的应用。 相似文献
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不同牛分枝杆菌特异性基因PCR方法的比较 总被引:1,自引:0,他引:1
【背景】牛结核病是我国二类动物疫病,世界动物卫生组织将其列为法定报告的动物疫病。牛主要通过患病牛呼吸道分泌物和咳嗽所产生的气溶胶感染;人则主要通过食用未经高温处理的病牛的肉或奶感染。因此,经过病原学PCR检测对疑似患病牛牛奶或屠宰组织样品进行快速检验确诊,能够最大限度地减少奶牛养殖中乳品生产业的经济损失。【目的】研究并确定适宜的牛分枝杆菌PCR扩增引物及参数,为临床快速准确诊断牛结核病提供参考。【方法】对已报道的5对PCR引物,运用降落(touch down) PCR法确定适宜退火温度(Tm);运用梯度稀释的牛分枝杆菌C68001株(国内牛结核菌素生产用菌株)基因组DNA以及不同菌液含量的人工模拟临床样本(淋巴结、肺脏和牛奶),确定不同引物PCR方法的敏感性;同时以6种常见牛感染菌(牛种布鲁氏菌2308、羊种布鲁氏菌Rev.1、牛分枝杆菌C68001和AN5、禽分枝杆菌C68202、副结核分枝杆菌C68681和胞内分枝杆菌C68226)核酸样本,确定不同引物PCR方法的特异性。【结果】所有引物在53-63℃均含有目的条带,确定引物的最佳退火温度是60℃。在细菌核酸敏感性检验中,1号和3... 相似文献
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直接从鱼类组织提取线粒体DNA和先提取基因组DNA再用相应引物PCR扩增所需mtDNA某一区域序列片段是获取鱼类mtDNA切实可行的两种方法。对这两种方法在使用过程中的注意事项、各自的优缺点及应用范围进行了较为细致的比较,为更好地利用mtDNA这一重要分子标记研究鱼类mtDNA的遗传多态提供参考。 相似文献
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为了解决在一些特殊位点上利用Quick Change方法进行定点突变时会在突变位点处额外插入引物序列导致突变失败的问题,对Quick Change法进行了改良。改良方法为:合成在突变位点处点突变的一对反向互补引物,分别进行单引物PCR扩增,将两种扩增产物混合,变性复性后加入Dpn I进行酶切,酶切产物转化大肠杆菌DH5α,抗性筛选阳性克隆进行测序验证。利用此法成功突变紫穗槐二烯合酶(amorpha-4,11-diene synthase,ADS)基因中多个利用常规方法突变均因引入额外引物而无法成功的特殊位点,证明此方法实践上可行,而且也可以避免插入额外引物序列,这也从侧面证明额外引物插入的原因是双引物同时反应。 相似文献
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PCR构建融合基因方法的建立 总被引:1,自引:0,他引:1
以聚合酶链式反应为基础的片段拼接技术——融合PCR技术是一种新的基因片段融合技术。以含有马铃薯块茎两种淀粉合成关键酶ssⅡ和ssⅢ基因为模板,利用融合PCR对其进行融合拼接,初步建立以PCR产物(不回收)及一步PCR法融合基因的构建方法,并对融合基因构建时PCR产物(不回收)的使用量及一步PCR法构建融合基因的中间引物浓度等条件进行优化。结果表明,以不回收的PCR产物为模板构建融合基因时PCR产物(不回收)的使用量在10-20 ng范围内为佳;一步PCR法构建融合基因的中间引物浓度在25-1 000 nmol/L为宜。 相似文献
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目的建立检测博尔纳病病毒(BDV)RNA的原位PCR方法。方法首先设计BDV特异性引物以及检测BDV-RNA的原位PCR扩增系统.然后对BDV持续感染细胞(BDV/OL)和正常细胞(OL细胞)爬片进行原位PCR扩增,进而分别用DNA酶或RNA酶消化处理BDV/OL细胞爬片后,再进行原位PCR扩增。结果经原位PCR扩增后.约60%~70%的BDV持续感染细胞核中出现了阳性反应信号,但正常细胞无信号出现,并且病毒感染细胞中的阳性信号在RNA酶消化作用下消失,但不受DNA酶作用的影响。结论该研究建立的PCR检测方法具有BDV和RNA特异性,可以应用于检测相关动物或神经精神疾病患者的脑组织中BDV-RNA,为进一步证明BDV的致病性奠定基础。 相似文献
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红豆杉属植物三种不同总DNA提取方法的分析比较 总被引:3,自引:0,他引:3
红豆杉属植物均为濒危物种,也是国家一级保护植物.以红豆杉属植物叶片为材料,利用三种不同的DNA提取方法提取总DNA,用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳方法检测所得总DNA的得率和纯度,用PCR扩增的方法检测所得总DNA的质量,并对三种不同提取方法的结果进行了比较分析.结果表明:CTAB法提取的DNA纯度和得率均较高,可直接用... 相似文献
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猫肾F_(81)传代细胞中犬细小病毒原位PCR检测方法 总被引:2,自引:0,他引:2
目的 建立在猫肾F81 细胞中犬细小病毒原位PCR的检测方法。方法 在猫肾F81 细胞上感染犬细小病毒 ,设计特异性引物 ,用直接原位PCR法在染毒 12h ,2 4h ,48h细胞片上检测出犬细小病毒 ,并与常规免疫组化的方法进行了比较。结果 在染毒 48h的细胞片上 ,用阳性记分法将两种检测方法得到的阳性细胞进行统计比较 ,差异极显著 (P <0 .0 0 1) ,用原位PCR法所得出的阳性率高。结论 原位PCR法检测犬细小病毒具有敏感性高和组织定位的优点 相似文献
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应用原位PCR对鸡传染法氏囊病病毒早期侵染过程的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
人工接种35日龄SPF鸡传染法氏囊病病毒,间隔不同时间采集法氏囊、胸腺、脾、盲肠扁桃体、肾、肝和腿肌进行了原位PCR检测,同时观察各组织病理变化。结果无论是H毒株还是Ts毒株,接种后4h肝、肾、脾等组织中即出现明显的阳性信号,Ts毒株4hPI从胸腺、盲肠扁桃体、腿肌等组织中也检出了病毒基因序列。接种H毒株和Ts毒株后28h和40h,法氏囊淋巴细胞开始出现变性、坏死。在阳性信号检出的时间上,法氏囊较肝、肾、脾等组织是滞后的。H毒株较Ts毒株在早期对法氏囊具有更强的侵染能力。 相似文献
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金银花不同提取方法的绿原酸比较研究 总被引:33,自引:0,他引:33
本文采用了水提法、水提醇沉法、酶解法、醇提法对金银花进行提取,并用紫外分光光度法来测定提取物中绿原酸的含量,依此来比较各种方法的优劣。由实验结果可得:以绿原酸作为指标来考察各种方法的优劣,尤以醇提法较好,绿原酸的含量可达到15.28%;以提取物的得率为指标来考察,以酶解法为最好,提取物的得率可达到37.91%。 相似文献
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对DNA合成的幽门螺杆菌尿素酶引物HP1、HP2、HP3、HP4进行了几种不同的纯化试验,分别采用无水乙醇沉淀法、NT柱及聚丙烯酰胺凝胶电泳方法,对其相应的纯化收率,PCR扩增效率作了比较及分析。琼脂糖凝胶电泳结果证实,以无水乙醇沉淀纯化方法的PCR扩增效果较为理想。该方法操作简便、稳定高效、省时省力、成本低。为此建议用该法处理DNA合成引物。 相似文献
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玉米两个RFLP标记的原位单杂交与共杂交定位的比较 总被引:4,自引:0,他引:4
RFLP标记bn18.23和 umc111位于玉米遗传日第 4连锁群近端,彼此密切连锁但次序尚未确定。用生物素标记对它们进行了原位单杂交和共杂交的比较定位。在植物中,这类原位共杂交的研究为首次报道。在单一探针的原位杂交中 umc111被定位在第 1、 4和9染色体长上,与着丝粒的百分距离分别是7.36±2.65、63.67±1.07、47.87±2.90。bn18.23被定位在第4和8染色体长臂上,与着丝粒的百分距离分别是87.42±2.45和27.60±1.75,清楚地表明了这两个标记在第4染色体上的次序。bn18.23和umc111分别与编码过氧化氢酶的cat3基因和编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的cde2A基因紧密连锁。根据供试RFLP标记检出位点推断了基因cdc2A和cat3的物理位置。原位共杂交在第 4染色体长臂上同时显示出了umc111和bn18.23两个标记的杂交信号,它们的位置分别与单一探针原位杂交的位置基本吻合。这为低拷贝或单一拷贝等小片段DNA物理定位的可靠性以及它们共杂交的可行性提供了令人信服的证据。 相似文献