心脏特异表达绿色荧光斑马鱼模型的建立与评估

本课题组前期研究中, 利用斑马鱼cmlc2 (Cardiac myosin light chain 2)基因启动子构建了一个用于斑马鱼心脏组织特异表达外源基因的转基因表达载体pTol2-cmlc2-IRES-EGFP。文章利用该载体构建了一个稳定表达EGFP的转基因斑马鱼品系, 并初步分析了EGFP的表达对该转基因斑马鱼品系的心脏发育和功能的影响。结果表明, 在建立的转基因斑马鱼品系早期胚胎发育过程中, 绿色荧光信号在心脏中特异表达, 该表达模式与原位杂交分析的cmlc2的表达模式结果相同; 该转基因斑马鱼品系的心脏形态及发育生长正常; 进一步通过M-Mode分析心脏生理学功能的结果表明：该转基因品系心动周期、心率、收缩与舒张表面积及表面积缩短率等重要生理指标与正常野生型的斑马鱼对照组相比没有显著差别。以上结果表明该转基因品系中绿色荧光蛋白的表达对斑马鱼心脏的发育和功能没有影响。研究结果为进一步利用该载体建立外源目的基因转基因表达模型, 研究心脏表达基因的功能奠定了重要基础。     

微小染色体维系蛋白3基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

目的:制备地高辛标记的微小染色体维系蛋白3(MCM3)基因的RNA探针,研究MCM3在斑马鱼早期发育中的时空表达。方法:收集并固定受精后24 h时期的野生型斑马鱼胚胎,提取总RNA,制备DIG标记的MCM3 RNA反义探针,整胚原位杂交,研究MCM3在斑马鱼胚胎早期发育过程的表达。结果:斑马鱼的MCM3氨基酸序列与小鼠、人具有高度同源性,通过不同时期胚胎的原位杂交,发现MCM3在早期发育过程中普遍性表达,胚胎受精后0~2 hMCM3在增殖性区域泛表达,受精后14~22 h在中枢神经系统、发育未成熟的眼部、体节及增殖性区域表达,受精后24 h在血液、中枢神经、翼板中脑、视觉盖及增殖性区域表达,受精后48 h在头部及肛门增殖性区域表达。结论:明确了MCM3在斑马鱼胚胎发育过程中的表达模式,证明其与早期斑马鱼发育细胞增殖密切相关,为研究该基因功能提供了一定的理论基础。     

斑马鱼整体原位杂交法研究MMP15a的发育相关表达的初步观察

克隆斑马鱼基质金属蛋白酶15a（MMP15a）基因,并研究其在斑马鱼胚胎早期发育中的时空表达状况。收集不同发育时期的斑马鱼胚胎,制备DIG标记的MMP15a RNA探针,采用全胚胎原位杂交方法研究MMP15a基因在胚胎斑马鱼的表达。结果MMP15a基因在胚胎受精后一个细胞时期就开始表达,从受精后24h起,在眼睛处表达明显,从受精后48h MMP15a在胸鳍和耳囊有特异性表达至到受精后96h。MMP15a在斑马鱼胚胎发育不同时期表达明显,且在胸鳍和耳囊处有持续表达。     

整体原位杂交法初步研究MMP11b在斑马鱼胚胎发育过程中的表达

克隆斑马鱼基质金属蛋白酶11b（MMP11b）基因,并研究其在斑马鱼胚胎早期发育中的时空表达状况。收集不同发育时期的斑马鱼胚胎,制备DIG标记的MMP11b RNA探针,采用全胚胎原位杂交方法研究MMP11b基因在斑马鱼胚胎的表达。MMP11b基因在胚胎受精后一个细胞时期就开始表达,并且一直持续到96h,从受精后24h起,在耳囊处表达明显,在受精后48h时期在胸鳍和肛门处也有特异性表达。MMP11b在斑马鱼胚胎发育不同时期表达明显,且在耳囊处有持续表达。     

斑马鱼胚胎发育过程中FGF3基因的表达

为了解斑马鱼胚胎发育过程中FGF3基因的时空性表达情况,并探讨其对胚胎发育的调控作用,该研究分别提取2,4,8,12,24,36,48,72hpf斑马鱼胚胎的总RNA,经逆转录成cDNA,实时荧光定量PcR检测FGF3基因mRNA表达量;扩增FGF3基因特异片段,构建pGEM-T／FGF3基因片段重组质粒,经克隆及测序验证后,合成地高辛标记的反义RNA探针,以整体原位杂交法检测斑马鱼胚胎FGF3基因的空间性表达。结果显示：FGF3P基因在2hp胚胎就有表达,并持续至胚胎孵化,12hpf胚胎FGF3表达量达到高峰（P〈0．01）;胚胎发育过程中心表达部位以头、尾、咽弓为主。由此得出结论,FGF3主要在胚胎发育早期表达,其表达可能与胚胎脑、眼、耳、咽弓及尾部器官的发育调控有关。     

Sema4d基因在斑马鱼早期发育过程中的表达

目的:研究sema(semaphorin)4d基因在斑马鱼早期发育过程中的表达.方法:提取斑马鱼胚胎的总RNA,制备地高辛标记的sema4d RNA反义探针,WISH(整胚胎原位杂交)研究sema4d在斑马鱼早期发育过程中的表达.结果:成功合成sema4d基因探针,获得sema4d基因在斑马鱼早期发育过程中的表达情况:sema4d在0.75 hpf(hours post fertilization)、1.0 hpf、1.5 hpf、12 hpf前普遍性表达;17 hpf开始至24 hpf在头部表达较多,在脊髓、肌肉、中间细胞群ICM(intermediate cell mass)区处有特异性表达区处有特异性表达;48 hpf在头部和躯干肌肉持续表达.结论:Sema4d在早期参与了造血的发生,在脑部,脊髓,肌肉的发育中可能起到了重要作用.     

FLT4 基因在斑马鱼早期发育过程中的表达

目的:研究FLT4(VEGFR3)基因在斑马鱼早期发育过程中的表达。方法:提取斑马鱼胚胎的总RNA,制备地高辛标记的FLT4RNA反义探针,WISH(整胚胎原位杂交)研究FLT4在斑马鱼早期发育过程中的表达。结果:成功合成FLT4基因探针,获得FLT4基因在斑马鱼早期发育过程中的表达情况:FlT4在2-cell、32-cell、oblong、shield期前普遍性表达(0.75h、1.7h、3.7h、6h);24h在头部表达较多,特别是在ICM(intermediate cell mass,中间细胞群)区处有特异性表达;48h、72h在头部表达均较高表达。结论:FLT4在早期参与了血管的形成和造血的发生,在脑部和肾小管的发育中可能起到了重要作用。     

应用双荧光报告系统检测斑马鱼microRNA的动态表达

microRNA(miRNA)是一类细胞内源表达的小分子非编码RNA, 主要通过降解靶基因的mRNA或者抑制靶基因的翻译, 在动植物的发育以及其他重要的生理过程中起调控作用。miRNA的功能跟它的表达位置与时间密切相关, 但是目前尚缺乏一个能够在活体与个体水平稳定、持续地实时观察miRNA动态表达的方法。文章以斑马鱼为模式, 建立了一个双荧光报告系统(我们称之为miRNA Tracer), 用于在斑马鱼整体胚胎中追踪特定miRNA的表达谱及动态变化过程。该系统以Tol2转座子为基础, 采用来自斑马鱼hsp70基因的热激启动子分别驱动eGFP和mRFP1荧光报告基因, 同时在其中一个报告基因的3′-UTR区连接待测miRNA的互补序列, 构成Tracer质粒。该互补序列与斑马鱼胚胎中相应的内源miRNA结合后能够使对应报告基因的荧光信号强度减弱, 通过比较两个报告基因在表达谱上的差异辨别miRNA的表达区域, 检测斑马鱼胚胎中miRNA起作用的位置和时间。文章选择在肌肉系统特异表达的miR-206以及在神经系统特异表达的miR-219, 分别在显微注射瞬时表达和转基因稳定整合等两个层次上验证了上述Tracer系统。结果表明, 所用的方法能够如实地在单细胞水平和整体水平检测到目标miRNA的时空表达动态变化。miRNA Tracer系统为在斑马鱼发育过程中对miRNA进行活体、实时的时空定位提供了一个独特而有效的方法, 也为对miRNA进行功能与作用机制等更深入的研究奠定了基础。

补充资料

s219mRFP1-dF转基因胚胎的3-D图像 [视频]     

二氢叶酸还原酶基因在斑马鱼咽弓发育过程中作用的研究

叶酸缺乏可导致胚胎先天性发育异常,二氢叶酸还原酶是叶酸生物学作用通路中的关键因子,其功能阻抑将抑制叶酸生物学作用的发挥.咽弓是脊椎动物胚胎发育中头面部结构、心脏流出道等的共同前体.在模式生物斑马鱼中,利用基因表达阻抑以及过表达技术,探讨二氢叶酸还原酶基因(DHFR)在斑马鱼咽弓发育过程中的作用.石蜡切片以及软骨染色结果显示,DHFR表达阻抑导致斑马鱼咽弓以及腭发育明显异常,而DHFR过表达可部分挽救上述发育异常表型.TBX1和HAND2在咽弓发育中有重要作用.通过胚胎整体原位杂交以及Real-timePCR技术检测TBX1和HAND2表达水平.DHFR表达阻抑后TBX1和HAND2的表达降低,DHFR过表达可使TBX1和HAND2的表达增加.上述结果表明,DHFR在斑马鱼咽弓发育过程中扮演重要角色,DHFR通过影响TBX1和HAND2的表达而调控咽弓的形成和分化.     

α-L-岩藻糖苷酶基因在斑马鱼发育过程中的功能分析

α-L-岩藻糖苷酶(alpha-L-fucosidase,FUCA1/2)是糖基水解酶家族的成员,参与糖蛋白、糖脂等生物大分子的分解代谢反应.为了解α-L-岩藻糖苷酶在动物发育中的功能,检测了fuca1和fuca2在斑马鱼组织和胚胎发育中的特异表达模式.fuca1和fuca2基因在斑马鱼成体中的表达存在组织差异,在斑马鱼的精巢中表达量最高,此外肝脏中也检测到fuca1和fuca2的高表达.在斑马鱼胚胎发育中,在其整个胚胎发育时期均检测到了fuca1和fuca2的表达.构建了fuca1基因的反义表达载体,显微注射到斑马鱼受精卵.统计结果显示反义载体注射导致斑马鱼胚胎高致死率.研究表明,fuca1和fuca2基因在鱼类胚胎发育和成体的精巢、卵巢与肝脏发育中可能具有重要的作用.     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.     

Principles of organization and evolution of systems of regulation of functions

Evolution of living organisms is closely connected with evolution of structure of the system of regulations and its mechanisms. The functional ground of regulations is chemical signalization. As early as in unicellular organisms there is a set of signal mechanisms providing their life activity and orientation in space and time. Subsequent evolution of ways of chemical signalization followed the way of development of delivery pathways of chemical signal and development of mechanisms of its regulation. The mechanism of chemical regulation of the signal interaction is discussed by the example of the specialized system of transduction of signal from neuron to neuron, of effect of hormone on the epithelial cell and modulation of this effect. These mechanisms are considered as the most important ways of the fine and precise adaptation of chemical signalization underlying functioning of physiological systems and organs of the living organism