细胞松弛素B诱导虾夷扇贝多倍体初探

Triploid shellfish are useful for aquaculture because of their sterility,superior growth and improved meat quality.Tetraploid are also valuable for 100% producing triploids through mating with diploid.We tested polyploid induction in Japanese scallop,Patinopecten yessoensis,by inhibiting polar body Ⅰ (PB group) and both polar bodyⅠandⅡ (PPB group) in newly fertilized eggs.Cytochalasin B (0.6 mg/L) was applied at 11～22 min post fertilization (PF),and terminated in PB group when polar body Ⅰ was released about 70% in untreated eggs,in PPB group when polar lobe was observed in control group.The treatment and its control were repeated 5～7 times using different pairs of parents.The ploidy was determined by counting chromosome number at embryo stage,and then was detected by flow cytometry (FCM) at larvae stage and juvenile stage.\;In PB group,aneuploid (31.13%),triploid (3.96%),tetraploid (17.46%) and pentaploid (46.65%) embryos were produced,and in PPB groups,pentaploid embryos became higher (56.2%),triploid and tetraploid were 2.42% and 9.11%.At day 3 PF,the larvae showed tetraploid,pentaploid and aneuploid peaks through checking with FCM in PB group,and showed mainly higher pentaploidy peak in PPB groups.However,at day 14 PF diploids were mainly left,sometimes with small triploid peak.It suggested that most tetraploid,aneuploid and pentaploid larvae were died within the first two weeks PF.At three months PF,a few diploid juveniles were harvested in three control groups.Only 12 juvenile scallops were harvested in one of treated group (PB-7),and 11 of them died accidentally,the alive one in treated group was triploid through checking with FCM.     

细胞松弛素B对日本沼虾四倍体的适宜诱导条件的研究

本文研究了用细胞松弛素B(Cytochalasin B,CB)诱导日本沼虾(Macrobrachium nipponense)多倍体的处理条件和方法。试验水温分别为18—19℃、22—23℃,CB浓度为1.0—2.0mg/L,处理的起始时间在受精后5—9h,处理的持续时间为10—20min。结果表明,在水温为18—19℃时,四倍体卵子的最适诱导条件为:受精后7—8h,CB溶液的浓度1.5mg/L,处理20min,四倍体诱导率最高可达56.1%;在水温为22—23℃时,最适诱导条件为:在受精后6 h左右,CB溶液浓度为1.5mg/L,处理15—20min,四倍体诱导率最高可达54.3%。处理的起始时间和CB溶液的浓度对胚胎的四倍体率有显著影响(P<0.05);胚胎的成活率随CB浓度的提高与处理的持续时间的延长而下降。考虑到胚胎成活率因素,建议选择CB浓度为1.5mg/L,处理持续时间15—20min。     

虾夷扇贝精子的超微结构

用扫描和透射电镜研究了虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)精子的超微结构.虾夷扇贝精子为典型的原生型,全长50μm左右,头部长约3 μm.精子主要由头部、中段和尾部三部分组成.头部顶体突出,呈倒"V"形;顶体下方为精核,电子密度较高且占头部大部分,具有核前窝(anterior nuclear fossa)、核后窝(posterior nuclear fossa)和植入窝(implantation fossa);4～5个近圆形的线粒体围绕着中心粒复合体形成精子的中段.尾部细长,尾部鞭毛横切面为典型的"9 2"结构.     

虾夷扇贝雄核发育单倍体的人工诱导研究

人工雄核发育,是利用遗传失活的卵子与正常精子受精,再利用染色体加倍技术使受精卵恢复为二倍体的遗传操作技术。利用该技术可大大加速品系纯化的过程,对遗传育种学研究有重要意义。目前有关鱼类雄核发育的研究已见于鲤( Gyprnus carpio)1,2、虹鳟( Oncorhynchus mykiss)3、红点溪鳟(Salvelinus fontinalis)4、泥鳅(Misgurnus anguilicaudatus)5,6、斑马鱼(Danio rerio)7、马苏大麻哈鱼(Oncorhynchus masou)8等种类。人工诱导贝类雄核发育的研究资料在国内外都很少,目前只有栉孔扇贝和太平洋牡蛎雄核发育诱导条件及其发育早期荧光显微观察方面的报道9,10。虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis) 原产于日本,目前已成为北方沿海地区一种重要的增养殖种类,具有很高的经济价值,同时也是目前海洋贝类育种研究的对象之一。本实验首次研究了紫外线照射对虾夷扇贝卵子遗传失活的影响,成功诱导出雄核发育单倍体,为今后开展虾夷扇贝雄核发育二倍体的人工诱导奠定了基础,现将其结果予以报道。       

虾夷扇贝的多态性微卫星座位

虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis),为冷水性贝类,是世界最重要的养殖经济贝类之一。原产于俄罗斯千岛群岛的南部水域,日本北海道及本洲北部。中国80年代初从日本引种,并开始养殖,目前已经在黄海北部形成规模化和产业化养殖,其中以大连长海养殖规模最大,近10年来创造出了数十亿     

虾夷扇贝遗传连锁图谱的初步构建

用AFLP标记首次构建了虾夷扇贝遗传连锁图谱。用56对引物组合对父母本和52个F^₁代个体进行遗传连锁分析, 共得到1 855个标记, 其中多态位点为598(32.2%)个, 而354个符合孟德尔1: 1分离比。用这些标记和23个偏分离标记(0.01相似文献   

FISH技术在栉孔扇贝和虾夷扇贝杂交子代染色体识别中的运用初探

核糖体间隔序列(ITS)是扇贝基因组中进化较快的基因片段,研究利用虾夷扇贝(Patinopecten yessoen-sis)与栉孔扇贝(Chlamys farreri)在核糖体间隔区ITS-1基因的序列差异,构建了虾夷扇贝的种特异性荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization,FISH)探针,并成功地将其运用于两种扇贝杂交子代的染色体识别和遗传变异分析中.研究结果表明,在适当的杂交和洗脱条件下,两扇贝ITS-1基因20.3%的差异已足够使虾夷扇贝ITS-1探针产生明显种特异性,探针只在虾夷扇贝分裂相第3对和第5对亚端部染色体或间期细胞上产生稳定的4个杂交信号,但在栉孔扇贝上并不产生明显的杂交信号;采用该探针对两扇贝的正反交子代染色体进行分析,结果表明所有杂交子代染色体分裂相均产生半数的杂交信号,与杂交种含半数的虾夷扇贝亲本染色体相符,杂交信号在杂交种染色体卜的数目和位置保持恒定,并未产生明显的变异;该结果证实了两扇贝的杂交为真正的精卵结合意义的杂交,子代对双亲遗传物质的继承仍以单倍染色体组的叠加为主;同时研究也表明ITS-1探针可有效地运用于杂交子代中特定染色体识别和跟踪过程中,对今后扇贝遗传变异系的识别和鉴定及进一步育种具有重要意义.     

SSR不对称PCR法分析虾夷扇贝遗传多样性

采用微卫星引物的不对称扩增法(即不对称PCR-SSR方法),得到了较为准确的微卫星,运用8对微卫星标记对取自日本青森县的自然群体(QSX)、俄罗斯海参崴自然生群体(HSW)和大连旅顺口的自然群体(LSK)及大连的广鹿岛(GLD)、獐子岛(ZZD)、小长山(XCS)和凌水桥(LSQ)养殖群体进行遗传多样性分析.平均观察杂合度(Ho)和期望杂合度(He)分别为0.51563～0.64583和0.67575～0.74535,其中QSX群体的平均杂合度最高,HSW群体的最低,各群体间的差异不显著,说明中国的扇贝的群体遗传多样性仍然处于一个很高的水平,种质资源较丰富.并对常规PCR和不对称PCR方法扩增微卫星的优缺点进行了探讨.     

栉孔扇贝(♀)×虾夷扇贝( ♂ )受精细胞学观察

采用Bouin氏液固定、石蜡包埋、切片 ,用苏木精 伊红染色 ,在光学显微镜下观察栉孔扇贝 (♀ )与虾夷扇贝 (♂ )杂交的受精细胞学过程。尽管栉孔扇贝与虾夷扇贝同科不同属 ,但它们的杂交仍具有正常的受精细胞学程序。栉孔扇贝卵子处于第一次成熟分裂中期时接受虾夷扇贝的精子入卵 ,精卵混合后 6min精子入卵 ;8～ 1 0min精核略微膨胀 ;2 5～ 3 0min排出第一极体 ;1h左右 ,雌雄原核同时形成 ;1小时 3 0分钟左右 ,雌雄原核融合 ;2h左右开始卵裂。杂交过程中的精子入卵行为较本交迟缓 ,但杂交后代仍能正常发育     

虾夷扇贝脂多糖诱导的肿瘤坏死因子LITAF基因的克隆及表达分析

脂多糖诱导的肿瘤坏死因子(Lipopolysaccharide-induced TNF-alpha factor,LITAF)是一类重要的炎症细胞因子,在先天性免疫系统中发挥重要的介质作用。文章根据虾夷扇贝LITAF基因EST序列,应用RACE技术克隆了虾夷扇贝LITAF全长cDNA,对序列及编码的氨基酸进行生物信息学分析。结果显示,该基因cDNA全长1 551 bp,其5′非编码区包含76 bp,3′非编码区包含1 001 bp;开放阅读框(ORF)为474 bp,编码157个氨基酸,氨基酸序列中存在一个保守的LITAF结构域;理论分子量16.99 kDa,等电点为6.24。LITAF基因序列为3 698 bp,由3个外显子和两个内含子组成。利用实时荧光定量PCR技术分析LITAF在虾夷扇贝不同组织、不同胚胎发育阶段以及鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激后各时间段的表达情况。结果表明:LITAF基因在所检测的6个成体组织中均有表达,其中肾脏的表达量最高;胚胎发育的7个时期中,担轮幼体时期表达量最高;菌刺激36 h实验组与对照组的表达量差异大。LITAF基因是LITAF家族的一员,推测LITAF基因参与虾夷扇贝的先天性免疫反应。     

虾夷扇贝β-actin基因的克隆和序列分析

为进一步研究虾夷扇贝功能基因的表达调控。利用SMART cDNA文库构建试剂盒成功构建了健康虾夷扇贝外套膜和肾脏两种组织的cDNA文库。对随机选取的4009个克隆进行5′端测序,比对,筛选出1条β肌动蛋白同源序列,对此EST序列两端进行扩增、测序,得到肌动蛋白基因cDNA全长序列。肌动蛋白基因cDNA全长1536bp(不包括polyA),5′端非编码区84bp,3′端非翻译区321bp,阅读框1131bp,编码377个氨基酸。在基因组DNA中,该基因被一个内含子分为两段,内含子位于第41和第42个氨基酸之间,长度为1498bp。系统发育分析显示该肌动蛋白属于β类型。本研究得到的虾夷扇贝β-肌动蛋白基因可以被用于作为定量某种虾夷扇贝mRNA的标准,这为继续研究虾夷扇贝其它功能基因,及其分子生物的进一步研究、促进其他相关分子发育和系统进化研究奠定了基础。     

基于454焦磷酸测序分析虾夷扇贝外套膜菌群多样性

运用454焦磷酸测序技术分析了健康虾夷扇贝和缺刻症状虾夷扇贝外套膜细菌多样性,分别从健康和缺刻虾夷扇贝样品中获得20872和16333条有效序列.结果表明： 缺刻虾夷扇贝样品菌群丰度和多样性分别高于健康虾夷扇贝样品;两个样品中细菌可以分为8个门,即变形菌门、厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门、蓝细菌门、浮霉菌门、螺旋体门和柔膜菌门,其中前7个门类的细菌在健康和缺刻虾夷扇贝样品中均有分布;在健康虾夷扇贝样品中,变形菌门占绝对优势,占整个菌群的97.7%,次优势类群厚壁菌门占0.8%;缺刻虾夷扇贝样品中,优势类群为厚壁菌门,占整个菌群的52.2%,次优势类群变形菌门占47.7%.     

细胞松弛素B对鲍受精卵超微结构的影响

细胞松弛素B（CB）作为一种微丝解聚剂,可用于诱导贝类三倍体,但由于其毒副作用导致了受精卵死亡和发育异常。通过透射电镜观察比较了皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai)正常受精卵与CB处理后的受精卵亚显微结构的变化,结果显示,CB对线粒体等细胞器的破坏,造成了受精卵的代谢缺陷,是导致鲍受精卵孵化率低的原因之一。     

细胞松弛素B对蚕豆气孔运动的影响

以蚕豆叶片下表皮条为材料,研究了微丝在气孔运动中的作用。利用肌动蛋白纤丝专一性抑制剂──细胞松弛素Ｂ（ＣＢ）预处理后,再用诱导气孔运动的因子处理表皮条,在显微镜下观测气孔孔径的变化。结果显示,用ＣＢ处理开放或关闭状态气孔,其开度均不发生变化;ＣＢ处理使微丝解聚,气孔运动被抑制;且ＣＢ处理后气孔的运动是可以恢复的。实验进一步表明,开放气孔经１０ｍｇ／Ｌ的ＣＢ预处理后,ＡＢＡ、Ｃａ２＋及暗诱导气孔关闭的作用均不同程度地受到抑制,推测微丝可能参与ＡＢＡ、Ｃａ２＋及暗诱导的气孔关闭过程;关闭气孔经１０ｍｇ／Ｌ的ＣＢ预处理后,Ｋ＋和（或）光诱导气孔开放的作用受到抑制,推测微丝可能参与光及Ｋ＋诱导的气孔开放过程。     

细胞松弛素B对蚕豆气孔运动的影响

以蚕豆叶片下表皮条为材料,研究了微丝在气孔运动中的作用,利用肌动蛋白纤丝专一性抑制剂－－细胞松弛素Ｂ预处理后,再用诱导气孔运动的因子处理表皮条,在显微镜下观测气孔孔径的变化。     

栉孔扇贝×虾夷扇贝杂交子一代与双亲染色体核型的分析

连续几年栉孔扇贝大面积死亡现象严重制约了北方贝类养殖业的发展 ,造成了巨大的经济损失。栉孔扇贝和虾夷扇贝生物学性状差异较大 ,可望通过杂交途径培育出抗逆性强、生长快的扇贝养殖新品种。杨爱国等[1] 和周丽青等[2 ] 的研究结果表明 ,栉孔扇贝与虾夷扇贝正反交杂交子一代     

虾夷扇贝热休克蛋白60基因克隆及表达特性研究

旨在探讨虾夷扇贝高温应激的分子机理并为解决该种夏季死亡问题打下基础。基于HSP60的转录组序列设计特异引物,采用RACE技术成功克隆获得虾夷扇贝热休克蛋白60(My HSP60)c DNA全序列。其c DNA序列全长3 368 bp,包括68 bp的5'UTR,1 569 bp的3'UTR和1 731 bp的开放阅读框,共编码576个氨基酸。利用基因步移技术扩增My HSP60基因启动子区域序列并测序,获得My HSP60基因启动子区域序列1 236 bp,该区域包含2个TATA盒,4个CCAAT盒,3个热激元件。基于氨基酸序列构建的系统进化树与传统物种进化规律基本吻合。通过实时PCR检测发现HSP60在虾夷扇贝各组织中均有表达,升温后肾脏中该基因的转录量升高极显著,而肝胰腺、外套膜、血淋巴和闭壳肌中的转录量升高显著(P0.05),说明该基因在热应激过程中发挥一定作用。     

不同苗种来源的中国虾夷扇贝群体的遗传多样性分析

虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)于1982年从日本引入中国并展开规模化养殖.由于引入的亲贝数目有限,使虾夷扇贝在人工育苗养殖过程中群体遗传多样性水平下降.本研究使用7对微卫星引物对日本原种贝(♀、♂)自交后的子代群体(RZ)、国内种贝(♀、♂)自交后的子代群体(DZ)、日本原种贝(♂)与国内种贝(♀)的杂交群体(ZJ)和国内自然海区(中国旅顺月亮湾)天然繁殖群体(HC)4个不同的虾夷扇贝群体的遗传多样性进行了研究.实验结果表明,4个群体的平均有效等位基因数为3.2～3.8,平均期望杂合度为0.6718～0.7017,日本野生群体做为种贝繁殖的苗种(KZ)与中国养殖群体相比,遗传多样性水平较高,除了DZ群体外其他群体的遗传多样性并无显著的变化.     

虾夷扇贝家系闭壳肌脂肪酸与C/N相关性研究

以虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)的生长性状、闭壳肌脂肪酸组成与含量、闭壳肌C、N元素含量及其比值为主要考察指标, 在对比选育家系的生长性状差异的基础上, 分析了不同生长速度的虾夷扇贝家系闭壳肌脂肪酸组成与含量差异, 研究了闭壳肌C、N元素含量及其C/N比值与脂肪酸含量的相关性。结果表明, 不同扇贝家系闭壳肌的主要脂肪酸含量差异较小而相对丰度差异明显, EPA (3.59—4.09 mg/g)和DHA (3.03—3.46 mg/g)之和占比扇贝闭壳肌脂肪酸总量的47.19%—49.32%; 不同家系的虾夷扇贝闭壳肌C、N元素稳态性较好, C元素和N元素的含量分别为(39.21±0.04)%和(10.62±0.16)%, C/N比值为3.70±0.06; 相关分析表明家系闭壳肌C/N比值与TFA、SFA、PUFA、EPA以及DHA等脂肪酸含量呈显著负相关。因此, 在进行虾夷扇贝生长相关选择育种时, 可以结合闭壳肌脂肪酸组成与含量、闭壳肌元素C/N比值开展复合性状选育, 从而为扇贝闭壳肌高品质脂肪酸家系选育提供科学依据。