扩散型与繁殖型松材线虫数字基因表达谱对比分析

【目的】松材线虫作为林业重大外来入侵种,扩散型幼虫的形成对其传播扩散起着非常重要的作用,但扩散虫态的形成与维持机制尚未阐明。【方法】通过构建松材线虫数字基因表达谱(DGE),从滞育状态的维持、化学感受、代谢途径等方面分析松材线虫不同虫态的基因表达差异。【结果】参考松材线虫基因组数据,鉴定出2种扩散型幼虫(LⅢ,LⅣ)和繁殖型幼虫(Ln)各有11184、8533和10781个基因。相对于繁殖型虫态,大多数基因在LⅣ中下调表达,该虫态中特异上调表达的基因有化感受体基因、核受体基因以及一些代谢相关基因。推测这可能与扩散型线虫滞育状态的维持相关,并在其生理功能如化学感受和媒介/寄主互作中发挥作用。GO和Pathway富集分析显示,多数代谢相关通路在LⅣ中下调表达,而在LⅢ中的表达均活跃。【结论】以上结果与LⅣ处于不进食、总体代谢水平较低等生理状态的表型相一致。     

卡尼鄂拉蜂锌转运蛋白-7相似蛋白（ZnT-7-like）的基因克隆、 抗体制备及差异表达

【目的】本研究旨在克隆卡尼鄂拉蜂Apis mellifera carnica锌转运蛋白 7相似蛋白（zinc transporter 7-like, ZnT-7-like）基因, 制备ZnT-7-like多克隆抗体, 了解该基因在卡尼鄂拉蜂王浆腺中不同时期的差异表达情况。【方法】运用RT PCR法从卡尼鄂拉蜂王浆腺总RNA中扩增ZnT-7-like基因, 进行生物信息学分析, 为避开跨膜结构的干扰, 选择克隆其部分序列（273 bp）作为多肽免疫序列。将其亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1, 转入大肠杆菌Escherichia coli BL21 （DE3）中诱导表达获得融合蛋白, 然后将融合蛋白纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体, 分别用间接ELISA和Western blot检测抗体的效价和特异性, 最后采用实时荧光定量RT-PCR以及Western blot技术检测该基因在不同日龄成虫王浆腺中的相对表达量。【结果】克隆得到卡尼鄂拉蜂ZnT-7-like基因, 大小为1 065 bp。SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白成功表达; 制备的多克隆抗体效价高达1∶64 000, 且具有很高的特异性。ZnT-7-like在卡尼鄂拉蜂5个日龄成虫中的转录情况存在较大差异, 表现为3日龄成虫中的表达量极显著高于其他日龄（P<0.01）, 12日龄表达量最低, 其他日龄间表达量两两差异显著(P<0.05)或极显著（P<0.01）; ZnT-7-like蛋白表达与转录水平基本一致。【结论】成功克隆了卡尼鄂拉蜂ZnT-7-like基因, 制备了兔抗蜂ZnT-7-like多克隆抗体, 并在转录和翻译两个水平上测定了ZnT-7-like在卡尼鄂拉蜂王浆腺中不同时期的相对表达量。这些结果为深入研究卡尼鄂拉蜂ZnT-7-like基因的功能奠定了基础。     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂20的表达特征分析

【目的】原核表达家蚕Bombyx mori丝氨酸蛋白酶抑制剂20(Serine proteinase inhibitor 20,Bm Serpin-20),分析Bm Serpin-20基因和蛋白组织表达分布特点,以及不同外源病原物刺激家蚕后Bm Serpin-20基因的表达模式。【方法】利用p ET-28a表达载体在大肠杆菌Transetta(DE3)中融合表达Bm Serpin-20蛋白,利用纯化的重组蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,利用实时定量PCR技术及Western blot方法分别分析Bm Serpin-20基因和蛋白的组织表达水平,以及病原物免疫刺激后的表达模式。【结果】在大肠杆菌中正确表达和纯化了融合Bm Serpin-20蛋白,并制备了多克隆抗体;Bm Serpin-20基因和蛋白在脂肪体、中肠、血细胞、马氏管、表皮、睾丸、卵巢中均有表达,且在表皮中表达量最高;家蚕5龄幼虫经核型多角体病毒(Nuclear polyhedrosis viruses)、藤黄微球菌Micrococcus luteus、大肠杆菌Escherichia coli、白僵菌Beauveria bassiana处理后,Bm Serpin-20基因表达量先下调而后上调,但不同病原物在不同时间的影响不尽相同。【结论】研究了Bm Serpin-20基因和蛋白的表达模式,为下一步研究其在家蚕免疫系统中的作用奠定了基础。     

小菜蛾C型凝集素基因PxCTL5的克隆及其在细菌刺激下的转录水平变化

【目的】本研究旨在克隆小菜蛾Plutella xylostella体内一种C型凝集素基因,检测其在小菜蛾体内的表达模式,并探讨该蛋白对细菌的凝集作用。【方法】基于对小菜蛾转录组和基因组进行生物信息学分析的基础上,RT-PCR结合RACE技术克隆小菜蛾C型凝集素基因全长cDNA序列。构建原核表达质粒载体,在大肠杆菌BL21中高效表达小菜蛾C型凝集素融合蛋白,利用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价的抗血清。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测小菜蛾C型凝集素基因在小菜蛾不同发育时期(卵期、1-4龄幼虫、预蛹期、蛹期和成虫期)和小菜蛾4龄第1天幼虫不同组织(血细胞、表皮、脂肪体、中肠和马氏管)中的表达模式。RT-qPCR和Western blot检测小菜蛾C型凝集素基因在大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌刺激下的表达差异。显微镜下观察重组蛋白对这两种细菌的体外凝集现象。【结果】克隆了小菜蛾型C型凝集素基因PxCTL5(GenBank登录号:KY807084),cDNA序列全长1 243 bp,开放阅读框(ORF)序列长672bp,编码223个氨基酸残基。RT-qPCR显示PxCTL5基因在小菜蛾各个龄期均有表达,在成虫期处于高水平表达;主要在表皮中表达,可被苏云金芽孢杆菌和大肠杆菌强烈诱导表达,表达高峰期分别为诱导后18 h和24 h。Western blot检测表明,经苏云金芽孢杆菌和大肠杆菌诱导后,小菜蛾血淋巴中PxCTL5蛋白表达量明显提高。体外凝集实验表明,在钙离子存在下,PxCTL5蛋白对两种细菌都有一定的凝集作用,对苏云金芽孢杆菌的凝集作用较强。【结论】小菜蛾PxCTL5可经细菌诱导表达,PxCTL5对苏云金芽孢杆菌有较强凝集作用。     

褐飞虱基因BphMIF1克隆及表达分析

【目的】克隆水稻重要害虫褐飞虱Nilaparvatalugens唾液蛋白基因BphMIF1,探析BphMIF1在响应褐飞虱取食过程中的表达谱。【方法】采用RT-PCR法克隆了褐飞虱唾液蛋白基因BphMIF1,测序后对序列进行生物信息学分析,使用实时荧光定量PCR(qPCR)对褐飞虱1-5龄若虫及成虫以及不同成虫虫体部位BphMIF1的表达量进行分析,同时对BphMIF1进行了原核表达分析。【结果】克隆得到BphMIF1基因,编码119个氨基酸。qPCR结果表明BphMIF1基因在若虫4龄期表达会迅速上调,在成虫的头、胸、腹均有表达,以腹部表达量最高。原核表达结果显示褐飞虱BphMIF1基因以0.5mmol?L-1的IPTG作为诱导浓度,诱导时间为4h表达效果较好。【结论】BphMIF1基因在褐飞虱成虫头、胸、腹部均有表达,在若虫不同发育历期其表达量有所差异且在4龄若虫时期表达量有显著上调。该结果可为BphMIF1在褐飞虱取食过程中的功能研究奠定基础。     

家蚕蚕蛹过敏原CPH30的表达、纯化、免疫学鉴定及B细胞抗原表位预测

【目的】克隆、表达纯化出家蚕Bombyx mori蚕蛹过敏原蛋白CPH30(cuticular protein hypothetical 30 precursor),并对其进行免疫学鉴定及B细胞抗原表位预测。【方法】通过蛋白组学方法分析CPH30蛋白的潜在过敏原性,人工化学合成该蛋白基因,将基因连接到p ET-28a载体上,重组质粒转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21,IPTG诱导基因表达。通过镍亲和层析获取高纯度蛋白,用Western blot方法对蛋白进行免疫学鉴定。通过DNAStar软件分析其潜在的B细胞表位。【结果】成功构建出CPH30基因的表达载体;表达纯化出CPH30蛋白,SDS-PAGE电泳结果显示分子量为25 k Da左右;Western blot结果显示,CPH30蛋白与家蚕过敏患者血清具有Ig E结合性,证明CPH30具有免疫原性;利用DNAStar软件成功分析出氨基酸序列第57-69和150-158位为潜在的B细胞表位。【结论】成功克隆表达出CPH30蛋白,并成功鉴定出其免疫原性,为家蚕蚕蛹过敏反应性疾病的特异性诊断和疫苗治疗奠定理论基础。     

家蚕磷酸吡哆醇氧化酶基因的表达谱分析

【目的】了解家蚕Bombyx mori维生素B6关键代谢酶磷酸吡哆醇氧化酶（pyridoxine- 5′-phosphate oxidase, PNPO）基因在家蚕不同发育阶段及5龄幼虫不同组织中的表达差异。【方法】将家蚕PNPO基因的重组表达质粒pET-22b(+)-PNPO转化入大肠杆菌Escherichia coli Rosetta中诱导表达, 纯化蛋白制备多克隆抗体。分别采用荧光定量PCR和Western blot方法对家蚕PNPO基因进行了转录水平和翻译水平的表达分析。【结果】在家蚕发育水平上, 5龄幼虫的PNPO翻译量为最高。PNPO基因在5龄幼虫各组织中的转录水平由高到低依次为精巢、 头、 中肠、 马氏管、 卵巢、 表皮、 脂肪体、 丝腺; 翻译量也以精巢为最高, 其次是头、 中肠和马氏管。【结论】明确了PNPO在家蚕各发育阶段及5龄幼虫各组织中的表达情况。     

家蚕生殖细胞相关基因nanos的克隆表达及在胚胎发育中的表达模式

【目的】探讨nanos基因在家蚕Bombyx mori胚胎发育中的表达模式,为进一步研究该基因在家蚕胚胎发育中的功能奠定基础。【方法】根据本实验室提交到GenBank中家蚕nanos的cDNA序列(登录号EF647589)设计引物,扩增出了一条长684 bp的编码片段,对该片段进行了克隆和表达,亲和纯化表达的蛋白并免疫新西兰大白兔制备抗体。Western blot检测家蚕早期胚胎nanos的表达情况,荧光定量PCR检测nanos在整个家蚕胚胎发育中的表达情况。【结果】克隆并表达了一条长684 bp的编码片段,得到了分子量约33 kD的融合蛋白。用制备的抗血清对家蚕早期胚胎蛋白的Western blot检测表明,nanos在此阶段基本是恒定表达。荧光定量PCR结果显示刚产的卵中nanos的表达量最大,第2天开始急剧下降,此后到第10天表达量几乎没有变化。【结论】本实验克隆的nanos是家蚕中的一个同源物,该基因在家蚕胚胎发育中的表达模式与蜜蜂等有很大的不同,反映了昆虫生殖细胞形成机制的多样性。     

茶尺蠖蜕皮激素受体基因Eo-EcR的克隆、生物信息学分析和表达检测

【目的】蜕皮激素受体(ecdysteroid receptor,EcR)是一种超家族核受体,它能与超气门蛋白USP组成异源二聚体复合物EcR/USP,调节20-羟基蜕皮酮(20E)的生物活性,进而调控昆虫的发育、变态及繁殖等生命过程。本研究旨在克隆茶尺蠖Ectropis obliqua Prout EcR基因全长,并了解该基因的编码蛋白特征和时空表达模式。【方法】通过RT-PCR方法并结合RACE技术,克隆茶尺蠖EcR的基因全长,通过生物信息学软件和在线网站分析茶尺蠖EcR的生物学特性,通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)技术比较茶尺蠖EcR在不同发育时期和6龄幼虫不同组织中的相对表达含量。【结果】克隆并鉴定了茶尺蠖EcR基因,将其命名为Eo-EcR(基因登录号:KP869130.1),Eo-EcR全长2 268 bp,含有1 728 bp开放阅读框,编码576个氨基酸。系统进化树和氨基酸同源性比对表明,Eo-EcR具有相对保守的进化特性,特别是与鳞翅目昆虫的保守性最高。三级结构模拟和功能结构域预测表明,Eo-EcR具有3个经典的结构模型,并以α螺旋为主,功能位点单一且为C4型锌指结构。qRT-PCR结果表明,Eo-EcR在5龄和6龄幼虫期以及成虫期表达量较高,在其他龄期表达量变化不大;同时在前胸腺表达量最高,在血淋巴表达量最低。【结论】明确了Eo-EcR的核苷酸序列及编码蛋白特征,明确了Eo-EcR的时空表达特性。该研究结果为进一步研究Eo-EcR的分子功能和基于Eo-EcR为靶标杀虫剂的研制奠定分子基础。     

小菜蛾中肠Polycalin蛋白的基因克隆、表达及与Cry1Ac毒素的结合特性分析

【目的】Polycalin蛋白是一种新发现的Bt毒素受体,可能与昆虫对Bt的抗性有关。本研究旨在明确小菜蛾Plutella xylostella Polycalin蛋白与Bt Cry1Ac毒素的关系。【方法】本研究通过PCR结合RACE技术从小菜蛾3龄幼虫中肠克隆获得Polycalin蛋白基因的全长cDNA序列,采用实时定量PCR技术研究Polycalin蛋白在小菜蛾不同发育阶段、4龄幼虫不同组织及用不同浓度Cry1Ac毒素饲喂3龄幼虫后的表达量。提取小菜蛾幼虫中肠的刷状缘膜囊泡(BBMV),运用合成多肽的方法制备Polycalin蛋白抗体,利用Western blot和Ligand blot技术对小菜蛾Polycalin蛋白进行鉴定,分析其与Cry1Ac毒素的结合特性。【结果】克隆得到的小菜蛾Polycalin蛋白基因的cDNA序列全长为9 102 bp(GenBank登录号:MF138149),其中,开放阅读框为8 778 bp,编码2 925个氨基酸;预测蛋白质分子量为326.38 kD,等电点为4.39;在推导的氨基酸序列中,前20个氨基酸为N-末端信号肽序列,含有14个N-糖基化位点,67个O-糖基化位点,6个脂质运载蛋白特征序列,6个脂质运载蛋白位点和13个类脂质运载蛋白结构域,并且在第20和21位(TSG-QVV)氨基酸之间存在一个裂解位点,在C-末端存在2个GPI结合位点,具有Bt毒素受体的特征。该蛋白在幼虫期的表达量较高,尤其在3龄幼虫体内表达量最高,在蛹和成虫中的表达量最低;在4龄幼虫的头、胸、腹中均有表达,在幼虫腹部中的表达量最高;3龄幼虫取食不同浓度的Cry1Ac毒素后,Polycalin蛋白的表达量下降,且Cry1Ac毒素浓度越高,下降越明显。通过Western blot检测到小菜蛾中肠刷状缘膜囊泡(BBMV)上存在大约300 kD的Polycalin蛋白条带;Ligand blot实验证明了小菜蛾Polycalin蛋白能与Cry1Ac毒素结合。【结论】本研究首次初步明确了小菜蛾Polycalin蛋白具有与Bt毒素结合的特性,为研究Bt对昆虫的作用机理和利用Bt防治害虫提供一定的理论基础和参考价值。     

一种高R-选择性水解R,S-甲霜灵的酯酶基因的克隆表达及表征

[目的] 将一种可以高选择性水解R-甲霜灵的新脂酶基因,在大肠杆菌中进行克隆和表达,并研究重组脂酶的性质。[方法] 根据已知的目标酯酶N端10个氨基酸序列,在已测序的Albibacters sp. zjut528基因组中找到相匹配的一个酯酶基因,它全长969 bp,编码322个氨基酸,将该基因命名为RMest。通过引物扩增得到该基因的DNA片段,将它与表达载体pET-28a（+）连接后,转化大肠杆菌BL21Gold（DE3）,构建重组菌,IPTG诱导表达该酯酶,并用Ni²⁺亲和层析介质进行纯化。[结果] 在重组菌RMest-pET-28a（+）-E.coli BL21 Gold（DE3）中成功表达了重组酯酶RMesterase,大小约为46 kDa。用胞内重组酶液催化水解R,S-甲霜灵,底物浓度10 g/L,反应6 h,底物转化率为49.8%,产物（甲霜灵酸）的ee_p为99.3%,对底物的对映体R-构型具有专一（选择）性。该酶最适温度和pH分别为40℃和pH 9.0。该酶的活性受到产物甲醇的抑制。通过Blast+在Uniprot KB数据库中搜寻与酯酶RMest同源的蛋白,采用邻近法构建该酶的蛋白系统发育树,结果显示它与某些Lysophospholipase、AB hydrolase-1 domain-containing protein和Esterase的同源性最高,但是与它们均存在较大的进化距离,表明该酶是一种相对独立进化的新酯酶。[结论] 在大肠杆菌中成功克隆和表达了一种新的脂酶基因RMest,重组酯酶RMesterase可以高手性选择性水解R,S-甲霜灵生成R-甲霜灵酸。     

水稻条斑病细菌hrp基因诱导表达系统的建立

水稻条斑病细菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xooc)决定在非寄主植物上激发过敏反应(hypersensitive response)和在寄主水稻上具致病性(pathogenicity)的hrp基因簇是诱导表达的。为研究hrp基因的功能,利用hpa1和hrpX基因的启动子与gfp基因进行融合,构建了hrp基因诱导表达系统。绿色荧光蛋白表达揭示,Xooc的hrp基因在营养丰富的NB培养基上不能有效表达,在hrp诱导培养基XOM3上可有效表达。以hrpX和hrpG突变体为参照,RT-PCR研究结果提示,Xooc野生型菌株hpa1基因在NB上不能有效表达,在XOM3培养基上可有效表达。相应地,hrpX突变体中hpa1基因不能被诱导表达,而在hrpG突变体中hpa1基因转录表达水平低于野生菌。研究结果还证实,水稻悬浮细胞能高效诱导Xooc的hrp基因表达。Xooc hrp基因诱导表达系统的建立为研究hrp基因功能、发掘T3SS效应分子以及开展Xooc致病性研究奠定了基础。     

Specific expression of the Drosophila midline-jumper retro-transposon in embryonic CNS midline cells

Here we describe of a novel Drosophila LTR-type retrotransposon that is expressed in the embryonic CNS midline glia and in the embryonic germ cells. The element is related to the gypsy and burdock retrotransposons and was termed midline-jumper. In addition to cDNA clones generated from internal retrotransposon sequences, we have identified one cDNA clone that appears to reflect a transposition event, indicating that the midline-jumper retrotransposon is not only transcribed but also able to transpose during Drosophila development.     

Structure and expression of AtS1, an Arabidopsis thaliana gene homologous to the S-locus related genes of Brassica

Summary Genetic and molecular analysis of the self-incompatibility locus (S-locus) of the crucifer Brassica has led to the characterization of a multigene family involved in pollen-stigma interactions. While the crucifer Arabidopsis thaliana does not have a self-incompatibility system, S-related sequences were detected in this species by cross-hybridization with Brassica DNA probes. In this paper, we show that an A. thaliana S-related sequence, designated AtS1, is expressed specifically in flower buds. Sequence analysis suggests that AtS1 encodes a secreted glycoprotein that is most similar to the Brassica S-locus related protein SLR1. As has been proposed for SLR1, this gene may be involved in determining some fundamental aspect of pollen-stigma interactions during pollination. The molecular and genetic advantages of the Arabidopsis system will provide many avenues for testing this hypothesis.     

Molecular cloning, sequence and regulation of expression of the recA gene of the phototrophic bacterium Rhodobacter sphaeroides

The recA gene of Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 has been isolated by complementation of a UV-sensitive RecA^– mutant of Pseudomonas aeruginosa. Its complete nucleotide sequence consists of 1032 bp, encoding a polypeptide of 343 amino acids. The deduced amino acid sequence displayed highest identity to the RecA proteins from Rhizobium mehloti, Rhizobium phaseoli, and Agrobacterium tumefaciens. An Escherichia coli-like SOS consensus region, which functions as a binding site for the LexA repressor molecule was not present in the 215 by upstream region of the R. sphaeroides recA gene. Nevertheless, by using a recA-lacZ fusion, we have shown that expression of the recA gene of R. sphaeroides is inducible by DNA damage. A recA-defective strain of R. sphaeroides was obtained by replacement of the active recA gene by a gene copy inactived in vitro. The resulting recA mutant exhibited increased sensitivity to UV irradiation, and was impaired in its ability to perform homologous recombination as well as to trigger DNA damage-mediated expression. This is the first recA gene from a Gram-negative bacterium that lacks an E. coli-like SOS box but whose expression has been shown to be DNA damage-inducible and auto-regulated.     

The sibling species Drosophila melanogaster and Drosophila simulans differ in the expression profile of glutathione S-transferases

Two major forms of glutathione S-transferase are known in Drosophila melanogaster: GST D and GST 2. In the present paper we report the existence of a third major form of glutathione S-transferase in Drosophila simulans. Induction with phenobarbital revealed a different regulation of GST between these species. Despite the fact that these two species are closely related, there was a difference in the expression profile of the enzyme implicated in the detoxification system, suggesting variations in capacity to suit their environment.     

Solitalea canadensis源β-N-乙酰氨基己糖苷酶的基因克隆、异源表达和酶学特性

【目的】对细菌Solitalea canadensis中编码β-N-乙酰氨基己糖苷酶的基因进行克隆,通过原核表达获得重组β-N-乙酰氨基己糖苷酶,并研究其酶学性质。【方法】以Solitalea canadensis基因组DNA为模板,使用加尾PCR的方法克隆编码β-N-乙酰氨基己糖苷酶的基因,构建含有组氨酸标签的重组表达载体,并将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达。重组蛋白经Ni-NTA纯化,以对硝基苯酚-β-乙酰氨基葡萄糖(pNP-β-Glc NAc)为底物研究其酶学性质,包括最适温度、最适p H以及金属离子和抑制剂的影响。【结果】从菌株Solitalea canadensis克隆得到了β-N-乙酰氨基己糖苷酶基因片段(Gene Bank:WP_014682183.1),全长2586 bp,重组表达所得蛋白表观分子量约为97 k Da,最适pH 6.0,最适温度42°C,但不稳定,半衰期小于5 min。该酶对十二烷基磺酸钠(SDS)敏感,活性受Triton X-100和尿素的抑制。此外二糖分子也能不同程度地抑制该重组酶的活性,特异性抑制剂PugNAc(O-(2-Acetamido-2-deoxy-D-glucopyranosylideneamino)N-phenylcarbamate)对该酶的IC_(50)为2μmol/L。该重组酶蛋白除能水解对硝基苯酚-β-乙酰氨基葡萄糖苷和对硝基苯酚-β-乙酰氨基半乳糖(pNP-β-GalNAc)外,还能对O-链聚糖核心结构Core Ⅱ末端的乙酰氨基葡萄糖进行水解。【结论】本文首次从Solitalea canadensis中克隆得到能水解末端β1-6连接的乙酰氨基葡萄糖而不能水解β1-4连接键的β-N-乙酰氨基己糖苷酶,并对其进行了酶学性质研究和底物特异性分析,为开发高效特异性强的糖链分析工具酶提供理论基础。