重组荞麦胰蛋白酶抑制剂通过下调己糖激酶Ⅱ抑制HepG2细胞生长

糖酵解过度活跃是肿瘤细胞能量代谢的显著特征。抑制过度糖酵解已经成为一种新的癌症疗法。重组荞麦胰蛋白酶抑制剂 (recombinant buckwheat trypsin inhibitor, rBTI)可以通过上调磷酸酶及张力蛋白同源基因 (PTEN) 进而抑制HepG2细胞增殖。有关rBTI对肿瘤细胞能量代谢的影响仍未见报道。本研究中的MTT和ATP检测分析表明,rBTI以剂量依赖性方式抑制细胞活力及胞内ATP含量。qRT-PCR和Western印迹分析表明,rBTI处理HepG2细胞后,己糖激酶Ⅱ转录显著下调,但是糖酵解过程中的其他酶及葡萄糖转运蛋白基因在转录水平未发生显著变化,同时己糖激酶Ⅱ蛋白水平的表达也显著下调。酶活性分析也表明,rBTI能显著降低己糖激酶的活性。进一步分析表明, rBTI使细胞内PTEN转录及表达水平明显上调,己糖激酶Ⅱ转录和p-AKT,p-mTOR、己糖激酶Ⅱ的表达下调。当PTEN抑制剂phen存在时,可阻断rBTI诱导的己糖激酶 Ⅱ表达下降,表明rBTI能通过上调PTEN进而影响己糖激酶Ⅱ的表达。免疫荧光及Western印迹分析显示,rBTI作用后减弱了己糖激酶 Ⅱ在线粒体的定位,导致己糖激酶Ⅱ与线粒体电压依赖性阴离子通道蛋白 (voltage-dependent anion channel, VDAC) 分离,促使己糖激酶Ⅱ从线粒体转位到细胞质,降低糖酵解的效率。上述结果证明,rBTI对肿瘤细胞能量代谢的调控作用主要通过抑制PI3K/AKT信号通路,下调己糖激酶Ⅱ的表达并影响空间定位,进而抑制肿瘤细胞糖酵解过程,导致癌细胞生长受到抑制。     

福建产尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒的柱层析分离及酶活力和某些生理效应的测定

用二乙氨基乙基葡聚糖凝胶A—50(DEAE-Sephadex A—50)对福建产尖吻蝮蛇蛇毒进行柱层析分离,获得11个蛋白峰。其中第一峰具有蛋白水解酶及磷酸二酯酶活力,同时还有纤维蛋白溶解作用及局部出血作用。第Ⅵ峰具有较强的精氨酸酯酶活力及凝血酶样的直接凝血效应。第Ⅰ及Ⅳ峰能明显延长血液凝固时间,呈抗凝血效应。第Ⅹ峰具有明显的毒性作用,腹腔注射于小白鼠,可致远隔部位的皮下、肌肉,胸壁内侧以及腹腔等处出血甚至死亡。 尖吻蝮蛇粗毒具有较高的蛋白水解酶、精氨酸酯酶、5′一核苷酸酶及磷酸二酯酶的活力,而碱性磷酸单酯酶、L—氨基酸氧化酶及磷酯酶A的活力均较低,胆碱酯酶的活力近于零。     

蛇毒的研究与利用——Ⅳ.浙江产蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒的柱层析分离及磷酸二酯酶的大规模纯化

应用二乙胺基乙基葡聚糖A-50和盐浓度梯度洗脱的方法,对浙江产蝮蛇毒进行了柱层析分离,获得14个蛋白峰,测定了磷酸二酯酶、磷酸单酯酶、5'-核苷酸酶、蛋白水解酶、氨基酸酯酶、L-氨基酸氧化酶、磷脂酶A、出血毒素、抗凝血活酶组份以及血纤溶酶样物质在蛋白质峰中的分布。介绍了一种大规模制备磷酸二酯酶的简便、经济的纯化方法,对用这种方法制备的酶制剂的某些主要质量标准进行了分析鉴定并与国外同类产品进行了比较,该酶用于人工合成核糖和脱氧核糖寡核苷酸的顺序分析获得了较为满意的结果。     

三角酵母D-氨基酸氧化酶基因的克隆、测序及表达*

利用跨越内含子的PCR技术,三角酵母(Trigonopsos variabilis)变种FA1-10中扩增得到D-氨基酸氧化酶基因(daao),并通过TA克隆的方法将其克隆至pGEM—T载体。序列测定结果表明,所得daao基因的5’端内含子已被删除,基因总长度为1071bp,它与Trigonopsis variabilis D-氨基酸氧化酶同源性达98.3％,与Fusarium solanii和Rhodotoru-la gracilis的同源性分别是38.9％和30.8％。为提高表达水平,又将此基因转移至高表达载体pET-28b上．在大肠杆菌BL-2l(DE3)中进行诱导表达。经IPTG诱导,目的蛋白的产生量可占菌体总蛋白量的46％,分子量约为38kD。D-氨基酸氧化酶的活力可达802u／L。     

碱性磷酸酶异常在临床诊断中的作用

碱性磷酸酶是属于磷酸酶系列酶中的一类,它能够有效的对应底物分子起到去磷酸化的作用,通俗的讲就是在水解磷酸单酯的作用下将底物分子上存在的磷酸基团除去,进一步生成自由的磷酸根离子,并在底物分子中引入羟基。这类底物分子主要包括:核酸、生物碱、蛋白等成分。与激酶的作用正好相反,激酶属于磷酸化酶,可以在充分利用ATP等能量分子的基础上将磷酸基团加到对应的底物分子上。碱性的磷酸酶能够在碱性环境中具有较强的活力,AKP有来源于细菌的,它最适合的生长环境是p H值为8.0的碱性环境;AKP有的来源于牛,它最适合的生长环境是p H值为8.5的碱性环境。因此,碱性磷酸酶在碱性环境中完全可以水解成各种天然、人工合成的磷酸单酯化合物底物分子中的磷酸基团,脱去磷酸基团的这个过程被称为去磷酸化、脱磷酸化。     

基于己糖激酶与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶共表达的辅酶NADPH高效再生

【目的】构建己糖激酶与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的大肠杆菌共表达体系,以葡萄糖为底物实现辅酶NADPH的高效再生。【方法】通过分子生物学方法,克隆己糖激酶HKgs、HKpp基因,并于Escherichia coli BL21(DE3)中表达,再将己糖激酶HKgs、HKpp分别与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶Gpd PP共表达,实现NADPH的原位再生。比较两个共表达工程菌的辅酶再生效果,并针对催化活力较高的工程菌BL21(HKgs+Gpd PP)进行表达条件优化。【结果】NADPH再生活力达到856 U/L。该辅酶再生体系与醇脱氢酶Adh R联合催化,使不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯的催化活力提高至原始值的2.5倍。【结论】通过己糖激酶与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在大肠杆菌中的共表达,构建了一个新的NADPH高效再生体系,并用于醇脱氢酶催化的不对称还原反应。     

顶头孢霉中己糖激酶编码基因Achka的功能研究

己糖激酶在真菌中广泛存在,参与葡萄糖磷酸化等生理过程。本文从头孢菌素产生菌顶头孢霉中克隆并鉴定了一个己糖激酶编码基因,命名为Achka。通过RT‐PCR证明Achka含有4个内含子,其推测的编码蛋白含有484个氨基酸,分子量为53.7k Da。在顶头孢霉中敲除Achka后发现,突变株在以果糖、蔗糖或甘露糖为唯一碳源的培养基上生长受到严重限制。我们在大肠杆菌中异源表达了Achka,并对表达的重组蛋白AcHKA进行了分离纯化。酶学动力学分析表明,AcHKA对果糖的最大反应速率要大于葡萄糖,但是却对葡萄糖有更高的亲和力。上述结果进一步证明AcHKA为己糖激酶,在顶头孢霉体内主要负责果糖、蔗糖和甘露糖等的代谢。     

D-乳酸高产菌菊糖芽胞乳杆菌Y2-8磷酸果糖激酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

以D-乳酸高产菌菊糖芽胞乳杆菌Y2-8基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到960 bp的磷酸果糖激酶基因(pfk)。氨基酸序列比对分析表明,该磷酸果糖激酶(PFK)与其他乳酸菌PFK具有保守的底物结合位点,但是其变构效应物结合位点存在差异。将pfk基因克隆到表达载体pSE380上,获得重组菌E-pSE-pfk。进一步通过诱导条件的优化,重组菌的PFK比酶活达到4.89 U/mg,是优化前的4.79倍。采用低温诱导策略有助于实现菊糖芽胞乳杆菌pfk基因在大肠杆菌中可溶性表达。     

达乌尔黄鼠育肥过程和冬眠期白色脂肪组织糖代谢相关基因的差异表达

为研究贮脂类冬眠动物育肥过程和冬眠期糖代谢的机制,使用第二代转录组测序(RNA-Seq)技术,检测了达乌尔黄鼠起始育肥期、快速育肥期、育肥完成期和冬眠期4个阶段血糖含量和白色脂肪组织中与糖代谢途径相关基因的表达情况。结果显示,起始育肥期、快速育肥期、育肥完成期的血糖浓度无组间差异,但均高于冬眠期。与起始育肥期相比,快速育肥期的果糖-1,6-二磷酸酶基因表达下调了8.3倍,己糖激酶、醛缩酶和烯醇化酶等基因表达上调;育肥完成期与快速育肥期相比,果糖-1,6-二磷酸酶基因表达上调了9.6倍,醛缩酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和柠檬酸合酶等基因表达下调1.2-2倍;冬眠期己糖激酶、丙酮酸脱氢酶E1、醛缩酶、柠檬酸合酶和6-磷酸脱氢酶等基因的表达均明显下调。结果表明,己糖激酶等基因表达上调可能与达乌尔黄鼠快速育肥期的糖代谢增强直接相关;醛缩酶和柠檬酸合酶等基因表达下调可能是动物在育肥完成期发生糖代谢降低的原因;入眠后,己糖激酶、丙酮酸脱氢酶等基因的低表达可能是调控糖代谢降至极低的主要机制。达乌尔黄鼠在冬眠前的活跃期既已启动糖代谢通路在分子水平上的主动调控。     

三角酵母菌D-氨基酸氧化酶的纯化和一些基本性质的研究

1．比较了17株霉菌和36株酵母菌的D-氨基酸氧化酶活力,其中以三角酵母的酶活力最高,比较适宜作为研究D-氨基酸氧化酶的材料。 2．用硫酸铵、聚乙二醇(PEG 6000)分部沉淀,Sephadcx G-200、羟基磷灰石柱层析分离纯化了三角酵母D-氨基酸氧化酶,聚丙烯酰胺凝胶电泳为单一组份。 以聚丙烯酰胺凝股梯度浓度电泳测得D-氢基酸氧化酶的分子量为170,000,sDs凝胶电泳测得其亚基分子量为42,000,表明三角酵母D-氨基酸氧化酶由四个相同亚基组或。 3．三角酵母D-氨基酸氧化酶在以D-丙氨酸为底物时,最适pH为8．3,米氏常数(Km)为3．3mM。三角酵母D-氨基酸氧化酶具有较宽的底物专一性,多种D或DL型氨基酸都可以做它的底物。     

鸡肝6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2-,6-二磷酸酯酶单克隆抗体制备及对酶活力影响

利用鸡肝-6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酯酶(6PF-2-K/Fru-2,6-P₂ase)的单克隆抗体对其结构和功能进行了初步研究.用鸡肝6PF-2-K/Fru-2,6-P₂ase为抗原免疫Balb/C小鼠,最后获得7株单克隆抗体.其中6株抗体的抗原决定簇位于6PF-2-K/Fru-2,6-P₂ase的酯酶结构域部分,而另一株H₂的抗原决定簇则位于其激酶结构域部分.7株单克隆抗体都能引起鸡肝6PF-2-K/Fru-2,6-P₂ase的激酶活力提高2倍左右,而对酯酶活力的影响大致相同.它们激活该酶的酯酶活力至4倍左右,但却不影响分离的鸡肝果糖-2,6-二磷酸酯酶结构域的酯酶活力.以上结果再次提示6PF-2-K/Fru-2,6-P₂ase双功能酶和分离的Fru-2,6-P₂ase结构域的酯酶处于2种不同的构象和活性状态.     

紫球藻藻红蛋白的分离纯化及光谱学特性

采用4℃反复浸提、离心、硫酸铵沉淀、DEAE—Sepharose Fast Flow离子交换柱层析,从紫球藻（Porphyridium cruentum Naegeli）冻干粉中分离纯化藻红蛋白,分离纯度达到4．85,总收率51．9％;经羟基磷灰石柱层析纯化,藻红蛋白纯度达到5．10,总收率34．0％,聚丙烯酰胺凝胶电泳显示1条带。所分离纯化的藻红蛋白含有3个亚基（α、β、γ）,在可见光区545nm和560nm处有2个吸收峰,在498nm处有1个吸收肩峰。实验结果说明所分离纯化的藻红蛋白纯度符合要求。     

金黄色葡萄球菌arl双组分信号转导系统受体蛋白ArlS_(CA)的表达、纯化及活性研究

金黄色葡萄球菌是一类重要的病原菌,其毒力因子的表达及分泌过程由多种双组分信号转导系统(two component signal transduction system,TCSTS)共同调控,其中ArlRS双组分信号转导系统与细菌的生长和分裂密切相关。ArlRS双组份系统的信号传递通过组氨酸激酶ArlS磷酸化实现,ArlS的胞内域被认为是调控毒力因子表达的重要功能域,以ArlS蛋白的胞内域部分即ArlS_(CA)为目标蛋白进行相关的活性研究。首先,构建pProEX-HTa-arls和pProEX-HTa-arlr重组质粒,对目的蛋白进行诱导表达。其次,利用金属离子螯合层析、离子交换层析以及凝胶过滤层析方法对目的蛋白进行分离纯化,纯化后的ArlR蛋白纯度可达98%,产量约为25mg/L;纯化后的ArlS蛋白纯度可达90%,产量约为15mg/L。圆二色谱检测结果显示纯化后的目的蛋白有完整的二级结构,体外磷酸化结果显示,ArlS蛋白具有激酶活性,自磷酸化后可以将磷酸基团转移给反应调控蛋白ArlR。最后,利用定点突变的方法,构建了418位和420位氨基酸残基突变的表达载体pProEX-HTa-ArlS_(CAG418A)和pProEX-HTa-ArlS_(CAG420A)。ArlS_(CAG418A)和ArlS_(CAG420A)蛋白不具有激酶活性,说明418位和420位氨基酸残基在ArlS蛋白的自磷酸过程中起着关键作用。     

用定位突变方法对人脑己糖激酶活性位点的研究

哺乳动物己糖激酶Ⅰ的分子量是１００ｋＤ．目前已经认为是由分子量５０ｋＤ酵母型己糖激酶通过基因复制和融合进化来的．己糖激酶Ⅰ的Ｃ端半分子包含了底物葡萄糖的结合位点即催化位点．Ｘ射线衍射结构的结果已经推测在酵母型的己糖激酶分子中Ｓｅｒ－１５８、Ａｓｐ－２１１是和葡萄糖的结合及催化活性有关,这些氨基酸残基相当于人脑己糖激酶Ⅰ分子中的Ｓｅｒ－６０３、Ａｓｐ－６５７,它们正好位于该酶分子的Ｃ端半分子中．定位突变这两个氨基酸残基得到４个该酶的Ｃ端半分子酶（ｍｉｎｉ－ＨＫⅠ）的突变体,它们是Ｓｅｒ－６０３→Ｃｙｓ,Ｓｅｒ－６０３→Ｔｈｒ,Ａｓｐ－６７５→Ｇｌｕ,Ａｓｐ－６７５→Ｖａｌ．实验结果指出４个突变体酶的Ｋｍ值变化不大,但酶活性只保留野生型酶的０．２８％～１１％,园二色谱分析４个突变体的ＣＤ谱与野生型酶基本一致,因此说明二级结构没有变化．这些研究结果和Ｘ射线衍射结构的推断是一致的,显示了Ｓｅｒ－６０３和Ａｓｐ－６５７氨基酸残基在该酶结合底物葡萄糖或催化作用上起了重要的作用．     

腺苷酸激酶基因在大肠杆菌中的可溶性高表达

报道了鸡肌腺苷酸激酶基因的克隆和在温控启动子P_RP_L调控下在大肠杆菌中的可溶性高效表达.SDS-PAGE分析表明,鸡肌腺苷酸激酶的含量可占大肠杆菌细胞总蛋白含量的38％.利用Johnson等的干冰/乙醇-冰水浴反复冻融法,可将此重组蛋白进行富集,纯度可达85％以上.鸡肌腺苷酸激酶可与抗兔肌腺苷酸激酶单克隆抗体产生强的交叉反应.     

肿瘤有氧糖酵解的研究进展CSCD

代谢重编程是肿瘤细胞重要的标志特征。本文通过介绍恶性肿瘤细胞己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸果糖激酶(PFK)、葡萄糖转运蛋白(GLUT)等糖酵解过程中关键酶;PI3K/PKB、m TOR和AMPK等细胞信号转导途径;p53、c-myc和HIF-1等转录因子在肿瘤细胞有氧糖酵解中的研究进展,进而深入了解其在肿瘤诊断和治疗中具有的潜在价值。     

大豆黄化子叶、幼芽完整质体和线粒体的分离纯化及其标记酶分析

采用分部离心及蔗糖密度梯度离心相结合的方法分离纯化大豆子叶和幼芽完整质体和线粒体,并以质体标记酶——磷酸三碳糖异构化酶和线粒体标记酶——细胞色素C氧化酶,分析蔗糖密度梯度离心后质体和线粒体的分布和纯度,用电子显微镜检查分离质体和线粒体的完整性。结果指出大豆子叶和幼芽的质体,线粒体分别分布在蔗糖密度梯度1.22g/cm~3和1.18g/cm~3区,分离的质体和线粒体纯度都在95％以上,完整性也是令人满意的。     

肿瘤有氧糖酵解的研究进展

代谢重编程是肿瘤细胞重要的标志特征。本文通过介绍恶性肿瘤细胞己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸果糖激酶(PFK)、葡萄糖转运蛋白(GLUT)等糖酵解过程中关键酶;PI3K/PKB、m TOR和AMPK等细胞信号转导途径;p53、c-myc和HIF-1等转录因子在肿瘤细胞有氧糖酵解中的研究进展,进而深入了解其在肿瘤诊断和治疗中具有的潜在价值。     

烙铁头(Trimeresurus mucrosquamatus)蛇毒的研究[Ⅰ]柱层析分离及酶活性与生物活性测定

本文报导了用二乙氨基乙基葡聚糖凝胶A-50和氯化钠直线梯度洗脱方法,获得14个蛋白峰。测定了11种酶活性,含有精氨酸酯酶,蛋白水解酶,L-氨基酸氧化酶,5′-核苷酸酶,腺三磷酸酶,磷酸单酯酶,磷酸二酯酶,核苷焦磷酸酶,磷脂酶A9种,不含核糖核酸酶,胆碱酯酶。对每个蛋白峰的生物活性测定表明,出血毒主要分布在12峰,其次为10—14峰。致死活性表现在1,12—14峰。1峰具有较强溶解纤维蛋白的活性。8,10—14峰具有明显的凝血酶样作用,酶活性的分布及其对凝血系统的作用接近一致。11—13峰能使血小板聚集。 烙铁头毒蛇在我国分布很广,成都生物所两栖爬行动物研究室1974年作过报导。蛇毒的研究已被许多学者所重视,Suzuki在Anthony.T.Tu.编著的Venoms Chemistry and Moleculor Biology(1977)报导了该蛇毒含磷酸单酯酶,磷酸二酯酶,5′-核苷酸酶及小分子活性多肽,1970年Ouyang报导含透明质酸酶,1963年Murata报导有蛋白水解酶活性。Ouyang等(1976—1978)分离纯化纤溶组分,并研究了该组分的理化性质。但对各组分的酶活性及生物活性测定尚未见报导。为充分利用这一丰富资源,我们对湖南产烙铁头蛇毒进行了柱层析分离和各组分的酶活性和生物活性测定,结果报导于下。     

乳糖代替IPTG诱导己糖激酶在大肠杆菌中的表达

构建了己糖激酶GLK高效表达的工程菌株BL21(DE3)/pET-glk,考察了乳糖代替IPTC诱导己糖激酶GLK在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的可行性.实验结果表明,工程菌对数生长中期(OD<,600>约为1.0)添加终浓度为10 g/L的乳糖于25℃的条件下诱导6 h能获得最大量的目的蛋白和菌体量,目的蛋白表达...