植物抗坏血酸合成的关键酶：L-半乳糖内酯脱氢酶（GLDH）

本文从酶的催化反应、酶学特征、分子生物学特性等方面介绍植物抗坏血酸合成的关键酶L-半乳糖内酯脱氢酶的研究进展。     

不结球白菜维生素C积累与相关酶活性研究

对不结球白菜‘常州乌塌菜’、‘矮脚黄’和‘二青’生长过程中维生素C(AsA)含量和L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶(GalLDH)、抗坏血酸氧化酶(AAO)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDAR)、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)的活性进行测定分析,结果显示,AsA含量的积累呈先升高后下降的模式,且‘常州乌塌菜’中的AsA含量显著高于‘矮脚黄’和‘二青’;GalLDH活性与AsA含量变化趋势基本一致,且3个品种中GalL-DH活性与AsA积累之间均呈极显著的正相关关系;AAO和APX活性的变化趋势则与AsA含量变化趋势相反,而‘常州乌塌菜’中AAO活性显著低于其它2个品种,但APX活性无显著差异;MDAR和DHAR的活性则主要表现在生长后期。结果表明,不结球白菜中AsA含量主要受GalLDH酶活性调节,同时AsA代谢酶AAO也对AsA积累起到了重要作用,而MDAR和DHAR酶活性对AsA积累的作用主要在生长后期。     

保加利亚乳杆菌ATCC11842 L-乳酸脱氢酶同工酶基因的克隆与表达分析

通过对保加利亚乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase, L-LDH)同工酶基因的异源表达、酶活测定和摇瓶发酵研究L-LDH在乳酸合成中的作用。将保加利亚乳杆菌ATCC11842中L-乳酸脱氢酶基因ldb0120和ldb0094分别克隆至载体pET28a(+)中,构建重组表达载体pET28aldb0120和pET28aldb0094,并转化到大肠埃希菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中进行表达。进一步对重组蛋白进行Ni-NTA柱亲和层析和酶学活性测定,结果显示,LDB0120和LDB0094的比活力分别为0和25 U/mg,表明LDB0094是具有低活性的L-乳酸脱氢酶,而LDB0120不具有活性。对两株重组菌分别进行好氧和微好氧发酵,重组菌E.coli BL21/pET28aldb0094在好氧和微好氧条件可以合成L-乳酸,浓度分别为41.9和227.9 mg/L,而菌株E.coli BL21/pET28aldb0120在两种培养条件下均基本不合...     

猕猴桃L-艾杜糖脱氢酶基因的克隆及转化

以猕猴桃果实为材料,利用电子克隆技术获得了L-艾杜糖脱氢酶(L-Idonate dehydrogenase,IDH)基因,然后将其转入番茄中,为了解猕猴桃IDH基因如何调控AsA的降解奠定基础。结果表明,获得的猕猴桃IDH基因cDNA全长为1 239bp,含有一个1 080bp的开放阅读框,编码359个氨基酸;成功构建了IDH基因植物表达载体pWR-IDH及工程农杆菌,以番茄叶片及茎段为受体,通过农杆菌介导法进行转化,获得了4株经PCR和RT-PCR检测呈阳性的转基因植株。     

S-扁桃酸脱氢酶基因的克隆及表达

S-扁桃酸脱氢酶能够选择性催化S-扁桃酸生成苯甲酰甲酸。通过PCR扩增获得Pseudomonas p utida NUST的S-扁桃酸脱氢酶全长基因(mdlA),并构建了表达载体pET30a(+)-mdlA,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)后,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导获得表达,SDS-PAGE结果显示表达蛋白为43kDa。所以工程菌细胞具有转化S-扁桃酸生成苯甲酰甲酸能力。     

枸杞Lb_SPL12基因的克隆及表达分析

SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)是植物发育过程中特有的转录因子,SPL基因家族由多个成员组成.本研究通过RACE方法克隆到枸杞Lb SPL12转录因子的全长cPNA.研究结果表明,该cDNA基因的开放阅读框包含1 353 bp个碱基,编码450个氨基酸.Lb_SPL...     

枣果实β-半乳糖苷酶基因的克隆及表达分析

采用3-′RACE技术获得了梨枣果实β-半乳糖苷酶(-βGal)基因的部分cDNA片段,并运用实时荧光定量PCR技术和PNPG反应比色法,研究了梨枣不同生长期及采后常温贮藏过程中ZJGAL基因的相对表达量和β-Gal活性的变化,以探索β-半乳糖苷酶在枣(Ziziphus jujubaMill.)果实生长及采后软化中的分子调控机制.结果表明,克隆的-βGal基因序列长2 584 bp(GenBank登录号HQ827769),其中包含2 193 bp的最大阅读框,编码730个氨基酸,将该基因命名为ZJGAL.Blastn和Blastp序列比对分析发现,该ZJGAL基因与已登录的其他物种的β-Gal基因相似性达到60%～80%.随着果实的生长、成熟及采后衰老,ZJGAL基因的表达量和-βGal活性在果实采收前后均呈先上升后下降的趋势,两者的采前高峰均在幼果膨大期,但是采后贮藏过程中虽然基因的表达量较高,但是-βGal活性一直较低.     

枸杞LbSPL6基因的克隆及表达分析

从实验室前期对枸杞(Lycium barbarum L.)花发育过程转录组测序结果推测,枸杞Squamosa启动子结合蛋白(Squamosa promoter binding protein-like, SPL)转录因子可能在枸杞花发育过程中发挥重要功能。该研究以宁夏特色植物资源枸杞为材料,采用RACE方法克隆LbSPL6基因,通过生物信息学及基因表达分析对该基因进行初步研究。结果表明:(1)成功克隆获得LbSPL6基因,其开放阅读框全长1 524 bp,编码507个氨基酸,分子量为55.34 kD;序列分析表明LbSPL6蛋白中包含3个保守基序,且氨基酸序列与茄科植物同源蛋白的氨基酸序列高度相似。(2)qRT-PCR分析证实,LbSPL6基因在枸杞花器官中表达,并且在花药发育的四分体时期及单核花粉时期表达量较高;亚细胞定位实验证明,LbSPL6蛋白定位于细胞核中。该研究结果为进一步研究枸杞LbSPL6转录因子在花发育过程中的功能和作用机制奠定了基础。     

枸杞LmP5CS基因的克隆及表达分析

目的:为进一步研究枸杞抗逆境胁迫的机制,并为转基因育种,提供理论依据。提高农作物的抗逆性提供优质的基因资源。方法:提选取盐胁迫后脯氨酸含量变化较大的耐盐植物枸杞为材料,用1.5%NaCl处理后,提取枸杞叶片总RNA,利用 RT-PCR 及3' RACE方法克隆获得吡咯啉-5-羧酸合成酶(delta 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase,P5CS)基因的全长cDNA,命名为LmP5CS,构建pH7m24GW,3rc-LmP5CS植物表达载体。结果:LmP5CS基因的ORF长2 154 bp,编码1个等电点为6.07、分子量为 77.5kDa、由717个氨基酸组成的蛋白。枸杞在200 mmol/L NaCl 盐胁迫下, LmP5CS基因表达量随处理时间,有先升高后降低的趋势,9h基因表达量最高,脯氨酸含量变化与之一致。结论:LmP5CS基因在盐胁迫下脯氨酸含量的变化中起关键作用。     

氧化葡萄糖酸杆菌中5-葡萄糖酸脱氢酶基因的克隆、表达及酶学性质分析

根据NCBI上的报道的基因序列设计引物,以氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)H24的基因组为模板,获得5-葡萄糖酸脱氢酶(Ga5DH)基因,将其与表达载体pET-28a连接,构建重组质粒pET-28a-Ga5DH,并转化大肠杆菌Rosetta进行表达。SDS-PAGE检测结果显示,表达蛋白的分子大小为26.5 kD,纯化后酶活达7.83 U/mg。酶学性质分析表明,该酶的最适反应温度为40℃,最适pH为11。在pH 9-11的缓冲中保温8 h,酶活力仍有80%以上的残余。该酶对多种有机溶剂具有良好的耐受性。     

枸杞蔗糖磷酸合成酶基因的克隆及组织表达分析

利用RT-PCR及RACE技术,从药用植物枸杞中克隆了1个编码蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因的全长cDNA,命名为LbSPS(GenBank登录号KC834608)。序列分析表明:LbSPS基因长3 677bp,开放阅读框为3 165bp,编码1 033个氨基酸,分子量为118.457 5kD,理论等电点6.05。系统进化分析显示,LbSPS编码的氨基酸序列与甜瓜、马铃薯、番茄等蔗糖磷酸合成酶基因编码氨基酸序列一致性为66%~98%。qRT-PCR分析显示,LbSPS基因在枸杞花中表达量最高,叶中表达水平较低。该研究为进一步了解LbSPS在枸杞生长发育、逆境胁迫等过程中的生物学功能奠定了基础。     

宁夏枸杞苯丙氨酸解氨酶基因的cDNA克隆及其表达分析

为探讨宁夏枸杞(Lycium barbarum)苯丙氨酸解氨酶基因(LbPAL)的表达特征,采用PCR法克隆了宁夏枸杞LbPAL基因的cDNA,并用实时定量PCR法分析了其表达特征。结果表明:宁夏枸杞的LbPAL基因的全长cDNA为2321 bp,包含2163 bp、编码720个氨基酸的开放阅读框;LbPAL与茄科其他物种的PAL氨基酸序列及三维结构具有较高保守性;与茄科物种的PAL聚类在同一个分支中。LbPAL在叶、花瓣、S1期果实的表达量较高,而在根及S2~S5期果实的表达水平较低。在NaCl胁迫处理下,LbPAL在根和茎中的表达量均有下调的趋势;而在叶片中,LbPAL表达量先急剧增加而后急剧下降并趋于稳定。这为解析宁夏枸杞中类黄酮化合物的生物合成调节及生理功能提供了参考。     

枸杞胼胝质酶基因克隆及在雄性不育材料中的表达分析

以雄性不育枸杞‘宁杞5号’和正常可育枸杞‘宁杞1号’为材料,提取不同发育时期枸杞花蕾RNA,反转录合成cDNA,利用胼胝质酶的β-1,3-葡聚糖酶属性进行同源克隆和半定量RT-PCR分析.结果表明:(1)所克隆的胼胝质酶基因(LG1)属于植物糖基水解酶第17家族基因,编码344个氨基酸,有5个氨基酸保守区在4种植物的花药β-1,3-葡聚糖酶基因中都存在.(2)LG1在正常可育枸杞花药中高量表达,在雄性不育枸杞花药中表达沉默,但基因序列并没有发生突变.(3)经苯胺蓝染色观察,雄性不育枸杞花药四分体分解受阻与LG1基因表达沉默同步.研究结果提示,LG1基因是受不育基因调控的下游基因,参与了枸杞花粉的败育过程,LG1基因沉默是雄性不育枸杞花粉败育的一个重要原因.     

NaCl胁迫下宁夏枸杞光合作用相关基因差异表达分析

宁夏枸杞是著名的耐盐药用植物,该研究通过室内水培试验,利用高通量测序技术和qRT-PCR技术检测了不同浓度NaCl胁迫(0、100、200、300 mmol/L)下宁夏枸杞叶片光合作用相关基因差异表达,并分析了其叶绿素含量、净光合速率、Rubisco活性的变化,以揭示宁夏枸杞在盐胁迫条件下光合机构及光合作用相关基因差异表达规律,为深入解析宁夏枸杞响应盐胁迫的光合机理奠定基础。结果表明：(1)用100、200、300 mmol/L NaCl胁迫处理7 d时宁夏枸杞分别有14、26、55个光合作用相关基因差异表达,且随着NaCl胁迫程度的增加下调表达基因多于上调表达基因。(2)qRT-PCR结果显示,宁夏枸杞的3个光合作用相关基因ATPε、CLH2、Lhcb3的相对表达量均随着NaCl胁迫程度的加深总体呈显著下降的趋势,qRT-PCR验证结果与RNA-seq测序结果基本一致。(3)随着NaCl胁迫程度的增加,宁夏枸杞叶片中的叶绿素a和叶绿素b含量以及净光合速率和Rubisco活性均呈显著下降的趋势,而类胡萝卜素含量变化不显著。研究认为,宁夏枸杞能通过诱导光合作用相关基因的差异表达来调控叶片...     

气候振荡背景下宁夏枸杞地理分区变迁研究

宁夏枸杞在中国北方广泛分布,重建宁夏枸杞的历史地理分布格局,确定其环境分布限制,为其种质资源保护和植物形成与进化趋势研究提供理论依据。该研究以宁夏枸杞(Lycium barbarum)为代表,采用MaxEnt模型对该物种228例野生有效分布点和19个环境变量进行评估,以明确影响其分布的相关环境因子;并对末次间冰期以来不同时期的地理分布格局进行建模分析,以揭示在气候变暖条件下宁夏枸杞适宜分布区的变化趋势,预测未来(2050s和2070s)在RCP2.6、RCP4.5和RCP6.0三种CO₂排放情景下宁夏枸杞的潜在地理分布变化。结果表明:(1)温度对宁夏枸杞的分布至关重要,其中最冷季度平均温度是影响该物种分布最重要的气候因子。(2)所建模型对宁夏枸杞的适宜分布区的模拟结果与当今实际分布一致,但分布区域比实际分布区域大。(3)宁夏枸杞的适宜分布区面积在末次冰盛期进行了收缩,而在末次间冰期分布区面积明显扩大(最大为4.23×10⁶km²),并呈现出向北推进和向南退缩的趋势。(4)在未来3种气候情景下宁夏枸杞的适宜分布区面积均趋于缩小;随着气候变暖的加剧,宁夏枸杞适宜分布区将向高纬度和高海拔地区迁移,且生境破碎化现象比现在更加严重。(5)在RCP2.6-2070s情景下,宁夏枸杞质心向西迁移108.66 km;在RCP6.0-2070s情景下,宁夏枸杞质心向东北迁移30.23 km。研究认为,宁夏枸杞的分布格局对气候变化具有强烈响应,随着气候变暖,宁夏枸杞的适宜分布区将向高纬度和高海拔地区迁移。     

宁夏枸杞的花粉呈现式样及交配系统研究北大核心CSCD

被子植物的花回馈、雌雄蕊时空分离特征和花粉呈现式样等花部特征及传粉者效率会影响雄性适合度和有性繁殖过程。宁夏枸杞(Lycium barbarum)是中国宁夏、新疆、内蒙等干旱和半干旱地区分布的特有种。该研究对新疆喀什地区宁夏枸杞自然种群的花部综合征、花粉呈现式样、花回馈、传粉者行为与交配方式的关系进行观察及统计分析,以探讨其花粉逐步呈现的适应性及其在提高雌雄繁殖过程中的意义。结果表明:(1)宁夏枸杞的单花寿命为(4.07±0.15) d,而雄性持续时间(0.07±0.01 d)比雌性持续时间短(4±0.01 d);花寿命内雌蕊长度比雄蕊长,属柱头探出式异位类型;花粉呈现式样为不完全逐步呈现。(2)花寿命不同阶段花回馈间存在显著差异。(3)意大利蜜蜂(Apis mellifera)、熊蜂(Bombus sp.)、食蚜蝇(Syrphidae sp.)是宁夏枸杞在自然居群的主要访花者,其中熊蜂和食蚜蝇是主要传粉者,但传粉者效率低,属于高移出低沉积类型。(4)宁夏枸杞的花粉胚珠比(2 448.11±448.32)及授粉实验结果均表现出兼性异交特征;自发自交及人工自花授粉花的座果率及结籽率很低,属于自交不亲和类型;自然传粉花的座果率及结籽率比人工去雄异花低,存在其较高的花粉限制(40.71%)。研究发现,宁夏枸杞花部综合征表现出雌雄异位和花粉不完全逐步呈现式样,这是避免雌雄功能及雄蕊各花药间的干扰、减少花粉同步移出及保障其雄性适合度的有效途径,但自然居群的传粉者种类限制、传粉效率低以及自交不亲性是导致宁夏枸杞花粉限制及降低雌性繁殖成功的主要原因。     

Lycium barbarum glycoconjugates: effect on human skin and cultured dermal fibroblasts

Lycium barbarum L. (Solanaceae) glycoconjugates (LbGp) display an interesting array of anti-apoptotic and antioxidant properties, which may be beneficial for human skin. We therefore set out to determine the effects of LbGp in full-thickness human skin, and in dermal fibroblasts. It was found that LbGp decreased the level of MMP (matrix metalloproteinase)-1 significantly, but not that of MMP-3 or -13, in the whole human skin system, without compromising the viability of the skin. Consistently, LbGp inhibited skin expansion under mechanical stress, which in this model depends on the activity of MMP-1. We found that one of L. barbarum glycoconjugates, the LbGp5, promoted the survival of human fibroblasts cultured in suboptimal conditions. Furthermore, in the presence of LbGp5, these cultures also contained higher levels of the MMP-1 substrate--collagen type I. Together these results suggest that L. barbarum glycoconjugates in general, and LbGp5 in particular, may have important skin-protective properties.     

气温升高与干旱胁迫对宁夏枸杞光合作用的影响

以宁夏枸杞1年生苗木为材料,采用开顶式生长室模拟增温环境,设置两个温度水平(正常环境温度,增温=正常环境温度+2.5—3.7℃)和3个土壤水分水平(正常水分条件(田间最大持水量的70%—75%)、中度干旱处理(田间最大持水量的50%—55%)和重度干旱处理(田间最大持水量的35%—40%)),研究气温升高和干旱胁迫对宁夏枸杞光合作用的影响。结果表明:(1)在增温条件下,中度和重度干旱处理下的净光合速率比对照(正常供水)分别下降17.5%、48.9%,气孔导度平均下降了3.9%,水分利用效率仅为正常环境温度下的57.8%。(2)在气温升高和干旱胁迫交互作用下,枸杞叶片的净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度显著下降的同时,增温处理又加剧了枸杞植株的蒸腾耗水,从而导致枸杞叶片水分的利用效率和CO2同化能力降低。(3)气温升高和干旱胁迫交互作用降低了枸杞的PSⅡ活性中心的光能转换效率、使光合机构和PSⅡ反应中心受到损伤,从而导致枸杞光合作用效率下降。(4)气温升高加剧了干旱胁迫对宁夏枸杞叶片净光合速率和水分利用效率的减小作用,即气温升高加剧了干旱胁迫对宁夏枸杞光合作用的抑制作用。     

干旱胁迫对宁夏枸杞叶片蔗糖代谢及光合特性的影响

以宁夏枸杞品种‘宁杞1号’为材料,采用防雨棚内盆栽控水法研究了轻度干旱(LD)、中度干旱(MD)、重度干旱(SD)和正常灌水(CK)4种土壤水分条件下枸杞叶片糖分含量、蔗糖代谢酶活性和光合参数的响应规律,为宁夏枸杞在干旱地区高产栽培提供参考依据。结果显示:(1)干旱胁迫降低了枸杞青果期叶片蔗糖和淀粉含量,轻度干旱胁迫可提高枸杞色变期叶片果糖和蔗糖含量,而成熟期叶片淀粉含量则随着干旱加重而升高。(2)干旱胁迫降低了青果期枸杞叶片中性转化酶(NI)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)和蔗糖合成酶(SS)的活性,降低了色变期和成熟期叶片酸性转化酶(AI)和SS的活性,但提高了色变期和成熟期叶片NI的活性。(3)随着干旱胁迫的加剧,叶片净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)和气孔导度(Gs)呈降低趋势,瞬时水分利用率(WUE)呈现:LD>CK>SD>MD的变化趋势。研究认为,轻度干旱胁迫能促进宁夏枸杞成熟期叶片蔗糖积累和水分利用率提高,有利于更多光合同化物输送到果实中。