应用正交实验法优化大肠杆菌表达CTB-PSMA624-632蛋白的条件

通过基因工程方法,将含霍乱毒素B亚单位(CTB)和前列腺特异性膜抗原(PSMA)表位肽的重组质粒pET28a-CTB-PSMA624-632,转化表达宿主菌BL21 (DE3)。CTB蛋白的表达有利于开发粘膜佐剂和霍乱弧菌基因工程疫苗,同时抗原肽疫苗也是肿瘤免疫治疗的理想候选。本研究采用正交实验法,优化条件以增加大肠杆菌中CTB-PSMA624-632蛋白的表达量。选取了5个单因素作为考察因子,分别为:预诱导时间、诱导时间、诱导温度、IPTG浓度、诱导转速。先做了4水平的实验L16(45)。根据极差分析的数据对影响较大的3个因素又做了细调型的3水平实验L9(33)。结果表明,在早期指数生长期的诱导能得到相对高水平的包涵体形式的CTB-PSMA624-632蛋白,并且此蛋白的表达随着诱导温度升高到37℃而逐渐增加;相比于使用正常浓度的IPTG诱导得到的蛋白表达量,用100%μmol/L诱导足以诱导蛋白的表达,这比通常使用的IPTG浓度小10倍;此外,诱导时间5 h与7 h对蛋白的表达量差距甚微,因此选定较短时间的5 h,240 r/min的诱导转速也被认为是能诱导目的蛋白CTB-PSMA624-632具有高表达量的最优条件。     

猪SsBHMT基因的原核表达及条件优化

甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶（BHMT）是一种甲基代谢酶,催化甜菜碱转甲基到高半胱氨酸生成甲硫氨酸。对含有pET30a-SsBHMT重组质粒的菌株进行诱导表达分析,通过对菌株、IPTG诱导浓度、时间等诱导表达条件进行优化,结果表明：该目的蛋白主要以包涵体的形式出现;经过条件优化,目的蛋白表达量在上清和沉淀中均有所增加,但仍主要以包涵体的形式存在;大肠杆菌菌株ER2566为适合目的蛋白表达的菌株;在37℃,IPTG浓度为0.4 mmol/L,诱导时间为10 h的条件下,目的蛋白表达量最多。研究结果为进一步蛋白纯化与抗体制备奠定了基础。     

抑菌蛋白Reg3A的表达纯化与功能

利用原核表达系统表达人源抑菌蛋白Reg3A,经包涵体的复性和纯化获得有体外抑菌功能的活性抑菌蛋白,并对其体外抑菌功能进行初步研究。构建Reg3A原核表达载体PET-32a-Reg3A转化补充稀缺tRNA基因的表达菌株大肠杆菌BL21-Codonplus,阳性重组子采用诱导培养基诱导5h后,采用超声破碎的方法提取包涵体蛋白,经包涵体蛋白的纯化和透析复性后通过Ni-NTA亲和层析交换柱,获得纯度达95%的蛋白质。Western blot鉴定显示在15 kD处有特异性条带。使用纯化后的蛋白进一步进行抑菌圈实验和抑菌活性实验,对获得蛋白的体外抑菌活性进行评估,从而为进一步进行Reg3A蛋白功能的评估及应用奠定基础。     

一种抗菌肽和aFGF融合蛋白的构建和表达

利用PCR技术扩增出带有凝血酶Xa因子切割位点的天蚕素蜂毒素杂合肽和aFGF的融合基因,插入大肠杆菌表达载体pET-3c中,构建出表达质粒pET-aF-CM,并转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,氨苄青霉素抗性筛选重组转化子。IPTG诱导4h后,以包涵体形式表达的融合蛋白约占菌体总蛋白的17%。将包涵体溶解后透析复性,并利用肝素亲和层析纯化,得到电泳纯的融合蛋白。Western blot分析表明,该蛋白能与aFGF抗体产生免疫反应。MTT法检测显示,融合蛋白具有促3T3Bal/b细胞分裂活性,其比活为1.471×106IU/mg。利用凝血酶Xa因子裂解融合蛋白,可以获得抗菌肽和含凝血酶Xa因子裂解序列的aFGF蛋白。分子筛回收含杂合抗菌肽,抑菌活性检测表明其对大肠杆菌K12D31具有明显抑菌活性。微量稀释法检测结果表明,回收的抗菌肽对大肠杆菌DH5α、大肠杆菌K12D31、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和绿脓杆菌的MIC分别达6.25μg/ml、10μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml和5μg/ml。     

抗菌肽CP10A在大肠杆菌中的融合表达

CP10A是一种由抗菌肽Indolicine经过序列改造,且对多数革兰氏阳性病源细菌具有较强抗菌活性的多肽序列。本研究根据已报道的CP10A氨基酸序列,兼顾大肠杆菌密码子偏好性,设计CP10A的核苷酸序列,利用PCR技术合成相应的DNA序列,后克隆构建重组表达载体pET32a（+）-CP10A,转入大肠杆菌AD494菌株。经IPTG诱导表达和15% SDS-PAGE电泳检测后发现产物以包涵体形式存在,且融合表达量占总蛋白的50%。在变性条件下经Ni-NTA亲合柱层析及复性,最终获得了较高纯度的可溶性重组蛋白。本研究首次实现了CP10A抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达,为进一步研究其生物学活性及应用奠定了一定的基础,同时也为研究抗菌肽表达提供了一种方法。     

拟南芥中一种AtBAG4蛋白的抗体制备和特异性检测

以拟南芥AtBAG4的全长cDNA,构建pET-51780重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG可诱导融合蛋白高效表达,表达产物以可溶形式存在;经Ni-NTA层析柱分离纯化,可得到分子质量约为49kDa的PAGE纯蛋白。用纯化的融合蛋白pET-51780免疫家兔,可得到抗AtBAG4抗体。Western blot结果显示该抗体能特异识别原核系统内表达的抗原以及拟南芥自身的抗原。     

可溶性HLA-A*0203-BSP原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

目的：构建HLA-A*0203重链胞外域羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的融合蛋白（HLA-A*0203-BSP）的原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达。方法：以RT-PCR方法从HLA-A2+ 供者外周血单个核细胞(PBMC)中克隆HLA-A*0203重链基因的cDNA并测序鉴定,然后以PCR方法构建HLA-A*0203-BSP的原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达并以免疫印迹鉴定。结果：DNA测序显示,从3名HLA-A2+ 供者PBMC中克隆的cDNA中,只有从供者2获得编码HLA-A*0203重链基因的cDNA。将编码重链胞外域1-276的序列和编码BSP的序列融合,构建HLA-A*0203-BSP融合蛋白的原核表达载体并经测序验证。该融合蛋白在BL21(ED3)中获得高效表达,约占菌体总蛋白的30％;产物相对分子质量约为34 kD,与理论大小一致。Western印迹分析显示融合蛋白完全存在于包涵体中。结论：成功克隆HLA-A*0203重链基因的cDNA,构建HLA-A*0203-BSP融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达,为制备HLA-A*0203四聚体打下基础。     

单纯疱疹病毒1型囊膜糖蛋白gD在大肠杆菌中的表达、纯化及其免疫活性的鉴定

目的:在大肠杆菌中表达1型单纯疱疹病毒(HSV-1)囊膜糖蛋白gD,纯化重组蛋白并对其免疫活性进行鉴定。方法:将HSV-1 gD 基因克隆入原核表达载体pET-28b,利用异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组质粒转化的大肠杆菌,探讨IPTG浓度、诱导时间、诱导温度对重组蛋白表达的影响;盐酸胍裂解变性包涵体,镍柱亲和层析法纯化gD蛋白,并对纯化后的蛋白进行透析复性;Western blot和ELISA检测gD蛋白的免疫活性。结果:酶切和测序结果表明gD基因克隆入pET-28b载体。该重组质粒转化的大肠杆菌经IPTG诱导后重组蛋白主要以包涵体形式存在,大小约40kDa。gD蛋白诱导表达的最佳条件为0.5mmol/L IPTG于37℃诱导8h。镍柱亲和层析法纯化获得的gD蛋白总量为3.1mg/L,透析复性后获得的gD蛋白总量为1.3mg/L,复性率为41.37%。Western blot及ELISA检测表明表达的gD蛋白具有免疫活性。结论:在大肠杆菌中表达并纯化获得具有免疫活性的HSV-1 gD蛋白,为进一步制备HSV-1诊断试剂和预防疫苗奠定了基础。     

Increasing the yield of soluble recombinant protein expressed in E. coli by induction during late log phase

Recombinant mammalian proteins expressed in E. coli can be difficult to purify in high yield in a soluble and functional form. Various techniques have been described to prevent proteolysis of expressed proteins and/or their sequestering as insoluble aggregates within inclusion bodies. We report conditions for expressing recombinant proteins from E. coli that significantly enhanced the yield of soluble and functional protein. We demonstrate high-yield recovery of a native, high-molecular-weight RNA binding protein without the aid of fusion protein sequence. The principle factor that increased protein yield was the induction of protein expression in a late log phase culture, although reduced temperature during the induction and a low IPTG concentration also contributed to a higher yield.     

产GL-7-ACA酰化酶重组大肠杆菌的构建和表达

为了实现GL-7-ACA酰化酶在大肠杆菌中的成功表达,将GL-7-ACA酰化酶基因用PCR的方法去除其信号肽序列,并将其连接到质粒pET-28a,通过筛选得到了表达GL-7-ACA酰化酶的重组菌B121(DE3),pET-ACY。分别考察了诱导温度、菌浓(OD600)、诱导剂IFrG的用量等因素对重组菌表达GL-7-ACA酰化酶的影响。在优化条件下,GL-7-ACA酰化酶酶活可达266U／L。GL-7-ACA酰化酶经一步DEAE-Sepharose纯化即可达到80％的纯度,酶活收率为50％。     

单链抗体2F3表达条件的优化及其提纯和性质研究

将构建好的单链抗体 2F3表达载体pTMF2F3ScFv转化到大肠杆菌BL21(DE3)。先挑选出表达量高的单克隆 ,然后让其在 37℃进行表达 ,并将表达时的培养条件进行优化。实验结果表明 :最佳诱导条件为开始诱导时的菌体密度OD_590nm =1.0～ 1.8,所加异丙基β-D 硫代半乳糖苷 (IPTG)的浓度为 0.3～0.5mmol/L ,诱导时间 7h ,优化后目的蛋白表达量占菌体总蛋白的20% ,并用发酵罐成功地进行了扩大培养 ,筛选了洗涤包涵体的最佳条件。采用两步法对包涵体复性进行了研究 ,用Westernblotting及ELISA法检测了所表达的单链抗体及其生物活性 ,并成功制备了含硒单链抗体酶.     

A型产气荚膜梭菌α毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究

利用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌标准株染色体DNA中扩增出α毒素基因,构建了含α毒素基因的重组菌株BL21(DE3)(pXETA02)。经酶切鉴定和序列测定证实,构建的表达质粒pXETA02含有α毒素基因序列。经SDS-PAGE、Western blot分析和ELISA检测,重组菌株表达的α毒素蛋白能够被α毒素单抗识别。表达优化结果表明,以IPTG为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH 7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时α毒素蛋白表达量为34.83%。以乳糖为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH7.5、培养温度37℃,乳糖浓度0.1g/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入乳糖,诱导时间5h,α毒素蛋白表达量为23.82%。动物实验结果表明,用重组菌株α毒素蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD的A型产气荚膜梭菌标准株C57-1毒素攻击。     

拟南芥中柯浩体蛋白Atcoilin的克隆、表达及纯化

旨在制备柯浩体的标志蛋白——Atcoilin蛋白,利用pET-28a与目的基因构建重组表达质粒,经DNA测序证实插入序列与设计完全一致后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,产物用SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定。通过分别改变IPTG的浓度、培养时间、培养温度等来优化Atcoilin蛋白的表达条件。表达出的重组蛋白经过镍柱、分子筛进行纯化。结果显示,原核表达载体pET28a-At1g13030成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,得到相应的重组蛋白经Western blotting鉴定正确。在IPTG浓度为0.7 mmol/L,18℃培养20 h的条件下,目的蛋白表达量最高。经过SDS-PAGE分析鉴定,过镍柱、分子筛后得到的重组蛋白纯度较高。     

HER2胞外段的克隆与原核表达

应用RT-PCR技术从人乳腺癌细胞系SK-BR-3中克隆出人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factorreceptor 2,HER2)基因的胞外段,并插入到表达载体pET-30a中,得到重组表达载体pET30-HER2(Ex)。将该载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞中,加入IPTG进行诱导表达,成功获得HER2胞外段蛋白。分别提取培养液上清、大肠杆菌周质腔、细胞质可溶性及不可溶性组分蛋白进行SDS-PAGE电泳分析,确定目的蛋白定位于大肠杆菌细胞质包涵体中。通过改变诱导温度、诱导物浓度、诱导起始菌体密度和诱导时间,寻找最佳表达条件,使目的蛋白的表达量达到最高。结果表明,在37℃下,OD600达到1.0时,经终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导4 h,目的蛋白的表达量最高。将重组表达菌进行超声破碎,分离出包涵体组分,经Ni2+亲和层析纯化后获得了纯度>90%的HER2胞外段蛋白,从而为抗HER2抗体的制备及肿瘤疫苗的研究奠定了基础。     

副溶血弧菌外膜铁蛋白受体pvuA基因的原核表达及产物的诱导条件优化

为构建弧菌铁蛋白受体pvuA重组质粒,提高其在大肠杆菌BL21中的表达产量,优化表达条件,并为其免疫原性研究奠定基础,从副溶血弧菌基因组DNA扩增了弧菌铁蛋白受体pvuA基因,构建了重组质粒pET-28a(+)-ferric vibrioferrin receptor,转入大肠杆菌BL21并经异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG）诱导表达蛋白。在单因素试验的基础上,以菌体初始浓度、诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度为自变量,菌体蛋白浓度为响应值,根据响应面法的Box-Benhnken中心设计原理,研究自变量及其交互作用对弧菌铁蛋白产量的影响,利用Design-Expert和响应面分析相结合的方法对诱导条件进行优化。IPTG诱导获得的重组蛋白以包涵体的形式存在,优化后最终确定重组弧菌铁蛋白受体pvuA最佳表达条件为菌体初始浓度OD600=0.6,诱导时间10 h,诱导温度37℃,IPTG浓度为1.0 mmol·L-1,此时包涵体沉淀中蛋白含量最高,为11.00 mg·mL-1。构建了弧菌铁蛋白受体pvuA的大肠杆菌重组表达质粒,通过优化表达...     

High‐yield recombinant expression of the chicken antimicrobial peptide fowlicidin‐2 in Escherichia coli

The antimicrobial peptide fowlicidin‐2 identified in chicken is a member of the cathelicidins family. The mature fowlicidin‐2 possesses high antibacterial efficacy and lipopolysaccharide (LPS) neutralizing activity, and also represents an excellent candidate as an antimicrobial agent. In the present study, the recombinant fowlicidin‐2 was successfully produced by Escherichia coli (E. coli) recombinant expression system. The gene encoding fowlicidin‐2 with the codon preference of E. coli was designed through codon optimization and synthesized in vitro. The gene was then ligated into the plasmid pET‐32a(+), which features fusion protein thioredoxin at the N‐terminal. The recombinant plasmid was transformed into E. coli BL21(DE3) and cultured in Luria‐Bertani (LB) medium. After isopropyl‐β‐D‐thiogalactopyranoside (IPTG) induction, the fowlicidin‐2 fusion protein was successfully expressed as inclusion bodies. The inclusion bodies were dissolved and successfully released the peptide in 70% formic acid solution containing cyanogen bromide (CNBr) in a single step. After purification by reverse‐phase high‐performance liquid chromatography (RP‐HPLC), ～6.0 mg of fowlicidin‐2 with purity more than 97% was obtained from 1 litre of bacteria culture. The recombinant peptide exhibited high antibacterial activity against the Gram‐positive and Gram‐negative bacteria, and even drug‐resistant strains. This system could be used to rapidly and efficiently produce milligram quantities of a battery of recombinant antimicrobial peptides as well as for large‐scale production. © 2015 American Institute of Chemical Engineers Biotechnol. Prog., 31:369–374, 2015     

黑莓果实UGT78H2重组蛋白诱导的响应面优化与蛋白纯化

UGT78H2是从黑莓果实中新发现的一个植物糖基转移酶家族成员,获得重组蛋白是后续深入研究该基因功能的基础。本研究通过构建原核表达载体,并应用响应面分析方法对重组蛋白的诱导条件(如诱导温度、IPTG浓度、菌液浓度和诱导时间）进行了优化,结果表明：（1）构建了pET32a-UGT78H2原核表达载体,并成功导入到BL21（DE3）pLysS细菌中;（2）经响应面优化,在29.5℃培养工程菌至菌液OD₆₀₀=0.51,加入终浓度为0.4 mmol·L^-1的IPTG诱导7.4 h,可获得最大量重组蛋白166.4 μg·mL^-1（占总蛋白41.6%）;（3）诱导时间和培养温度极显著地影响重组蛋白表达量,诱导剂IPTG和诱导前菌液浓度之间的交互效应显著影响重组蛋白的表达;（4）获得的带S-tag和His-tag的UGT78H2重组蛋白分子量为67.9 kDa,主要以包涵体形式存在,通过Ni-NTA柱纯化,成功获得了重组蛋白。以上结果为进一步采用酶学方法进行UGT78H2蛋白功能鉴定提供了基础资料。     

重组人α降钙素基因相关肽在大肠杆菌中表达条件的优化

为提高人α降钙素基因相关肽(bαCGRP)在大肠杆菌中的表达量,研究了本室构建的pET-hαCGRP重组质粒在E.coli BL21trxB(DE3)pKysS宿主菌中的表达条件.经SDS-PAGE分析和YLN2000凝胶影像分析结果表明,重组菌以LB为培养基,氨苄青霉素浓度为50 mg/L,开始诱导时的菌体密度为OD600=0.6～0.8,所加IPTG的浓度为0.75mmol/L,37℃摇床180±5r/min振荡诱导培养4 h时,可获得高效表达的hαCGRP融合蛋白.重组蛋白的最高表达量占菌体总蛋白的70%～80%;它主要以可溶性形式存在,为下一步纯化工作提供了方便.     

颗粒裂解肽G13结构域在大肠杆菌中的高效融合表达

为高效表达颗粒裂解肽G13结构域并避免G13对宿主菌的毒性, 将人工合成的编码G13的基因片段, PCR扩增后克隆于原核表达载体pThioHisA中, 构建了重组表达载体pThioHisA-G13, 将其转化于大肠杆菌BL21(DE3)中, 经IPTG诱导表达融合蛋白Trx-G13, 表达产物以包涵体的形式存在, 其表达量约占细菌总蛋白的58%。包涵体蛋白经 8 mol/L尿素溶解后, 再经CNBr切割, 阳离子交换层析, 得到纯化的重组G13结构域。琼脂糖扩散法检测表明重组G13结构域多肽具有抗菌活性。     

小鼠canstatin C端片段基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为了构建小鼠canstatinC端片段的原核表达载体并在大肠杆菌中表达。以小鼠肝脏组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠canstatinC端片段(mCan-C)基因,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将mCan-C基因定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,构建表达载体pET／mCan-C,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。结果表明,小鼠canstatinC端片段的cDNA长度为399bp,含有1个终止密码,编码132个氨基酸,与已知的人canstatinC端片段氨基酸的同源性为61％。IPTG诱导mCan-C在大肠杆菌E．coliBL21中表达,表达量约占菌体总蛋白量的28％,重组蛋白主要以包涵体形式存在。首次克隆了小鼠canstatinC端片段的cDNA,IPTG诱导mCan-C在大肠杆菌E．coliBL21中高效表达。小鼠canstatinC端片段的cDNA序列已收入GenBank,接受号为:AY502947。