含CD自杀基因腺病毒载体的构建及其应用

构建了含ＣＭＶ启动子、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（ｃｄ）基因的复制缺陷型重组腺病毒载体（ＡｄＣＭＶＣＤ）。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和ＲＴ－ＰＣＲ鉴定证实,ｃｄ基因已克隆进入ＡｄＣＭＶＣＤ,并在受染细胞中表达。经氯化铯密度梯度离心法纯化的病毒滴度达１×１０１５ｐｆｕ／Ｌ。经１００ｍ．ｏ．ｉ．的ＡｄＣＭＶＣＤ感染的ＨｅＬａ和Ｃ６细胞株在１００μｍｏｌ／Ｌ５ＦＣ处理后,细胞存活率＜２０％。同时也观察到ＡｄＣＭＶＣＤ／５ＦＣ系统有很强的旁杀伤效应,将３．３％的ＡｄＣＭＶＣＤ受染细胞与９６．７％的野生型细胞混合,经５０μｍｏｌ／Ｌ５ＦＣ处理后,＞６０％的细胞被杀死。ＡｄＣＭＶＣＤ／５ＦＣ系统的建立为肿瘤基因治疗的研究提供了新的手段。     

磷酸钙纳米介导自杀基因载体的构建及其应用研究

构建由CEA启动子、CMV增强子驱动的融合自杀基因PCDNA3.1(-)CVyCDglyTK表达载体和分别由CEA启动子和巨细胞病毒(CMV)增强子驱动的融合自杀基因PCDNA3.1(-)CEAyCDglyTK、PCDNA3.1(-)CMVyCDglyTK表达栽体.以磷酸钙纳米为载体分别转染CEA阳性的人结肠癌细胞株LOVO细胞和CEA阴性的HeLa细胞,Lovo细胞在感染以上3种质粒表达栽体后均有yCDglyTK mRNA表达,且对5-FC的敏感性明显增强:HeLa细胞在纳米PCDNA3.1(-)CMVyCDglyTK复合物感染后有yCDglyTK mRNA表达,对5-FC的敏感性增强,而在另外两种复合物感染后则没有yCDglyTK mRNA表达,5-Fc对其亦无杀伤作用,结果表明靶向性基因治疗栽体能使融合自杀基因在CEA阳性细胞中专一性表达,达到靶向治疗肿瘤的目的.     

自杀基因的作用及其机制

自杀基因的作用及其机制郑仲承（中国科学院上海生物化学研究所,上海２０００３１）关键词基因治疗,自杀基因,作用机制基因治疗是一种高技术含量很多的新兴医疗技术,它一出现,就在实验研究和临床试验方面取得令人瞩目的成果。但是,这个技术面临一些亟需解决的问题,...     

Spl基因RNA干扰载体的构建及鉴定

目的:构建干扰载体pSilencer 3.1-spl,并初步研究其对Spl基因的干扰作用.方法:根据Spl cDNA编码序列,设计并合成针对Spl基因的特异性RNA干扰片段,并将其克隆入pSilencer 3.1-Hl neo干扰载体中,构建Spl基因小干扰RNA(siRNA)真核表达载体pSilencer 3.1-Spl;分别将阴性对照载体pSilencer 3.1与重组载体pSilencer 3.1-Spl经脂质体LipofectAMINE2000介导转染HeLa细胞,采用RT-PCR、Western blot方法分别检测Spl基因的转录与表达水平.结果:构建了Spl基因siRNA真核表达载体pSilencer 3.1-Spl,经酶切、测序鉴定证实克隆正确,并在mRNA水平和蛋白水平证实了载体的干扰效果.结论:特异性siRNA能明显抑制Spl基因在HeLa细胞中的表达,为进一步研究Spl的生物学功能和作用机制奠定了实验基础.     

自杀基因治疗的作用机制及其应用

自杀基因治疗已逐渐成为肿瘤等疾病基因的治疗中的一种重要方法,本文介绍了ＴＫ,ＣＤ等几种常见的自杀基因,并概述了自杀基因治疗中的旁观者效应,基因转移系统靶向性研究及自杀基因治疗在肿瘤,骨髓移植,心血管疾病等领域中的应用。     

Sp1基因RNA干扰载体的构建及鉴定

目的：构建干扰载体pSilencer3.1-Sp1,并初步研究其对Sp1基因的干扰作用。方法：根据Sp1cDNA编码序列,设计并合成针对Sp1基因的特异性RNA干扰片段,并将其克隆入pSilencer3.1-H1neo干扰载体中,构建Sp1基因小干扰RNA（siRNA）真核表达载体pSilencer3.1-Sp1;分别将阴性对照载体pSilencer3.1与重组载体pSilencer3.1-Sp1经脂质体LipofectAMINE2000介导转染HeLa细胞,采用RT-PCR、Western blot方法分别检测Sp1基因的转录与表达水平。结果：构建了Sp1基因siRNA真核表达载体pSilencer3.1-Sp1,经酶切、测序鉴定证实克隆正确,并在mRNA水平和蛋白水平证实了载体的干扰效果。结论：特异性siRNA能明显抑制Sp1基因在HeLa细胞中的表达,为进一步研究Sp1的生物学功能和作用机制奠定了实验基础。     

MSTN基因siRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建能沉默MSTN基因的小干扰RNA表达载体,并鉴定它沉默肌母细胞MSTN基因的效率。方法合成3对发夹小干扰RNA模板寡核苷酸链,退火后插入pSileneer载体．构建成可沉默MSTN基因的小干扰RNA表达载体,通过酶切和测序鉴定构建的小干扰RNA表达载体。将小干扰RNA表达载体转染肌母细胞,用实时荧光定量RT—PCR和Western印迹检测转染的肌母细胞myostatin的表达水平。结果酶切和测序证实3个小干扰RNA表达载体构建正确,实时荧光定量RT—PCR显示所构建的3个小干扰RNA表达载体对肌母细胞MSTN基因的干扰率分别为43．6％、47．7％和81．6％,它们的干扰效果被Western印迹所证实。结论干扰率为81．6％的小干扰RNA表达载体为构建成功的小干扰RNA表达载体,。岜可用作MSTN基因的功能研究和肌病治疗的分子研究。     

人eya2基因小干扰RNA表达载体的构建及表达

目的：设计并构建人eya2（eyes absent2）基因小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,并观察其沉默效果。方法：以人eya2为靶基因,以pSliencer2．1-U6 neo质粒为载体,根据人eya2的cDNA序列,设计含有小发卡结构的2条寡核苷酸序列,将其克隆到siRNA表达载体上;转化大肠杆菌DH5Ⅸ菌株,抽提质粒,测序分析;将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过荧光分析、Westemblot和转录活性实验检测其抑制效果。结果：重组体测序结果与目的序列相一致,证明构建了eya2 siRNA真核表达载体;荧光观察表明siRNA能显著减弱细胞中绿色荧光强度,抑制eya2基因表达;Westemblot分析证明构建的siRNA能有效抑制外源性及内源性eya2基因表达;转录活性测定表明,构建的siRNA能有效抑制eya2基因表达。结论：构建了eya2 siRNA真核表达载体,该siRNA能有效地抑制eya2基因表达。     

靶向Smad4基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选

目的:构建编码Smad4mRNA的shRNA真核表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法:根据GenBank提供的人Smad4基因的mRNA序列构建2个shRNA质粒表达栽体和1个阴性对照质粒表达载体,并通过基因测序进行鉴定.经鉴定后转染体外培养人成纤维细胞,western-blot检测Smad4蛋白水平抑制表达效果.结果:构建质粒表达载体测序结果显示,插入片段测序结果与合成的shRNA序列一致;靶向Smad4基因shRNA质粒表达栽体对所转染的人成纤维细胞中Smad4蛋白水平表达均有抑制作用,其中shRNA1最为明显.结论:成功构建了靶向Smad4基因shRNA质粒表达栽体,其中抑制Smad4基因表达效果最为明显的是shRNA1,为进一步研究Srnad4基因的RNA干扰奠定了基础.     

靶向NBS1基因的 microRNA真核表达载体的构建及其活性鉴定

目的:构建靶向NBS1基因的 microRNA真核表达载体,鉴定其转染宫颈癌细胞株Hela后的生物活性?方法:根据NBS1mRNA序列设计合成四对pre- microRNA片段,定向克隆到pcDNA 6.2- GW/ EmGFP-miR真核表达载体上,并将其转染至Hela细胞株中?采用菌落PCR和测序分析鉴定插入序列的完整性;采用实时定量PCR分析鉴定重组体对NBS1mRNA表达的干扰效果以确定其生物活性? 结果:构建的四组重组体插入片段的碱基序列完全正确?重组体能干扰Hela细胞NBS1基因的表达,四组重组体NBS1 mRNA表达量分别为: 0.24±0.17 (NBS1mi-1组)?0.12±0.12 (NBS1mi-2组)?0.41±0.97 (NBS1mi-3组)?0.48±0.93 (NBS1mi-4组),其中NBS1mi-2组表达最低? 结论: 构建的四组NBS1 microRNA重组体在Hela细胞株中都具有生物活性, 且NBS1mi-2组的干扰作用最强? 载体构建成功,为应用microRNA靶向NBS1的肿瘤基因治疗的研究奠定了基础。     

CD/TK单、双自杀基因重组腺病毒的制备及初步应用

为制备表达大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶 (cytosinedeaminase ,CD)和单纯疱疹病毒 1 胸苷激酶(herpessimplexvirustype 1thymidinekinase ,TK)双自杀基因的重组腺病毒载体 ,为再狭窄基因治疗的应用奠定基础 ,首先构建了含单、双自杀基因的腺病毒穿梭载体 ,细菌内同源重组法获得重组腺病毒质粒 .脂质体介导下转染 2 93细胞进行包装并大量扩增得到Ad TK、Ad CD、Ad TK CD、Ad LacZ 4种重组腺病毒 .氯化铯 (CsCl)梯度离心法纯化后利用报告基因绿色荧光蛋白 (GFP)测定病毒滴度 ,可达 10 9pfu ml .PCR和Western印迹法对外源基因进行鉴定 ,证明单、双自杀基因均已整合入腺病毒基因组并表达 .重组腺病毒感染血管平滑肌细胞后 ,用MTT法比较了单、双自杀基因的杀伤作用 ,发现在感染复数≤ 2 0时 ,双自杀基因对细胞的抑制作用明显高于单基因 .成功地构建腺病毒双自杀基因共表达载体 ,为进一步的体内外实验奠定了基础 .     

人端粒酶催化亚单位启动子调控自杀基因HSV-TK肿瘤细胞特异性表达载体的构建

将自杀基因形插入质粒pGL3-hTp和pGL3-Control中,取代其上的荧光素酶基因,分别构建hTERT启动子和SV40启动子调控的TK基因表达质粒pGL3-hWp-TK和pGL3-SV40-TK,酶切和PCR鉴定结果显示重组质粒pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK构建成功;用脂质体法将pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK瞬时转染端粒酶阳性的人肺腺癌细胞株A549及端粒酶阴性的人胚肺成纤维细胞株MRC-5,RT-PCR显示转染pGL3-SV40-TK的细胞A549和MRC-5均有TK mRNA表达,转染pGL3-hTp-TK的A549细胞中也有形mRNA表达,但转染pGL3-hTp-TK的MRC-5细胞无TK mRNA表达,提示hTERT启动子可以调控自杀基因HSV-TK在肺癌细胞中靶向表达,可能是肿瘤靶向性基因治疗中比较理想的转录调控元件．     

受强力霉素调节的自杀基因表达载体系统的构建和在乳腺癌细胞株(MCF-7)的表达

自杀基因治疗是恶性肿瘤基因治疗中最常用的途径之一,以递转录病毒载体-pRevTRE为基础进行载体构建,首先使用PCR技术对单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSVtk)进行扩增,将HSVtk基因插入到pRe-vTRE,形成重组载体pRevTRE/HSVtk,用磷酸钙共沉淀法,经过两轮转染,分别将pRevTRE/HSVtk和pRevTet-On质粒导入乳腺癌细胞株（MCF-7）经过潮霉素B（HygromycinB)和G418筛选,建立了一株稳定的受四环素衍生物-强力霉素（Doxycycline,Dox)调控,表达HSVtk基因产物的人乳腺癌细胞株MCF/TRE/tk/Tet-On,HSVtk基因表达产物可以将无毒性的药物前体Ganciclovir(GCV)转变成一种有毒的代谢产物,从而杀死乳腺癌细胞株（MCF-7）,达到基因治疗的目的。     

大肠埃希菌嘌呤核苷磷酸化酶基因载体的构建及对胰腺癌细胞的作用

目的构建大肠埃希菌（Escherichia coli）嘌呤核苷磷酸化酶（purine nucleoside phosphorylase,PNP）基因表达载体,研究其生物活性,为肿瘤的基因治疗奠定基础。方法PCR扩增大肠埃希菌K12的PNP基因,T4连接酶将PNP连接人pMSCV逆转录病毒载体,构建重组逆转录病毒载体pMSCV／PNP。pM—SCV／PNP转化感受态大肠埃希菌XLI-Blue,提取pMSCV／PNP,酶切、PCR和测序鉴定。病毒包装细胞293产生重组逆转录病毒pMSCV／PNP,流式细胞仪测病毒滴度。pMSCV／PNP转染胰腺癌细胞BXPC-3,倒置荧光显微镜观察,FACS分离转染阳性细胞（GFP阳性）。RT—PCR检测PNPmRNA在胰腺癌细胞BXPC-3细胞中的表达,MTT法检测PNP基因的生物活性。结果PCR扩增出大肠埃希菌PNP基因（738bp）,酶切和PCR的电泳条带显示pMSCV／PNP,测序结果正常。293包装细胞产生高滴度（3．6×10^7U／m1）重组逆转录病毒pMSCV／PNP。RT—PCR实验结果表明,pMSCV／PNP转染的胰腺癌细胞BXPC-3表达PNPmRNA。前药6-甲基嘌呤-2’-脱氧核苷（MePdR）作用72h浓度达1．00mg／L,BXPC-3／PNP细胞存活率为10．09％,随着MePdR浓度加大,BXPC-3／PNP细胞存活率继续下降直至为0。结论构建了pMSCV／PNP载体,获得了表达大肠埃希菌PNP基因的BXPC-3细胞克隆,PNP／MePdR自杀基因系统对胰腺癌细胞BXPC-3有较强的抑杀作用。     

野生罂粟COR、BBE基因片段融合及其RNAi载体构建

可待因酮还原酶(COR)与小檗碱桥酶(BBE)是吗啡合成代谢途径的关键酶,其活性大小直接影响着吗啡合成途径中生物碱的代谢合成。采用RT-PCR从罂粟幼叶克隆出COR和BBE基因全序列,同源性比较结果显示,它们与GenBank上已报道的COR和BBE基因高度同源。利用blast及分子生物学软件DNAStar对COR和BBE基因的cDNA序列同源性进行分析比较,分别从各基因中筛选和克隆了一段同源性极低、约400～500 bp的片段;并应用重叠PCR法将其拼接成744 bp的融合基因BC,以中间载体pHANNIBAL和植物表达载体pART27为基础,构建了以CaMV 35S启动子驱动的含有“正向BC融合片段- pdk内含子-反向BC融合片段”的ihRNAi植物表达载体,通过转化野生罂粟,初步研究了以COR和BBE基因为靶标的RNAi对内源吗啡合成的抑制效果,为进一步培育低吗啡高蒂巴因的罂粟种质提供了依据。     

人Notch1受体shRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建人特异性受体Notch1短发夹RNA重组腺病毒载体,探讨其对人脐带间充质干细胞中Notch1表达的影响,以便进一步研究Notch1的生物学功能.方法:设计合成Notch1序列干扰序列,插入到pGenesil-1.1上构建重组质粒,取阳性克隆进行酶切及DNA测序鉴定.通过同源重组,构建含目的基因的重组腺病毒质粒栽体pGsadeno-Notch1-shRNA.经PacI线性化后脂质体介导转染到HEK 293细胞,包装后得到腺病毒颗粒.产生的重组腺病毒体外转染人脐带间充质千细胞,RT-PCR和Western blot 检测特异性shRNA对人脐带间充质干细胞中Notch1蛋白在mRNA及蛋白表达水平的抑制效果.结果:经酶切及DNA测序重组腺病毒质粒构建正确.重组腺病毒转染人脐带间充质干细胞3d后,RT-PCR及Western blot检测,可显著下调细胞内Notch1的转录及蛋白表达水平.对Notch1 mRNA和蛋白表达的抑制率分别为70.31％和86.97％,具有统计学意义(P＜0.05).结论:成功构建了表达人Notch1受体shRNA的重组腺病毒载体,为研究Notch1在肿瘤学中的生物学作用及机制奠定基础.     

Tet-On调控HSVtk表达的重组腺相关病毒载体的构建和感染活性的检测

构建含有Tet基因调节系统及自杀基因HSVtk的重组腺相关病毒载体pAAV TRE HSVtk Tet_On ,并使用PCR技术和限制性内切酶消化进行鉴定。用构建好的重组质粒分别与辅助质粒pAAV_RC、pHelper以磷酸钙共沉淀法转染HEK2 93细胞,进行病毒包装后得到了AAV TRE HSVtk Tet_On重组腺相关病毒,以氯化铯密度梯度离心对包装好的病毒进行纯化。用纯化后的重组腺相关病毒感染乳腺癌细胞株MCF_7后,斑点杂交检测结果显示,HSVtk基因整合进入MCF_7细胞基因组中。有感染活性的重组腺相关病毒能将目的基因转移到宿主细胞中,在Dox诱导下,GCV对AAV感染的MCF_7细胞具有明显的杀伤作用。     

AGPase基因植物表达载体的构建及对烟草的转化

将大肠杆菌BL21的AGPase基因定向连接在受体质粒pCAMBIA2301载体上,从而构建植物表达载体,转化烟草获得了转基因植株。经GUS组织化学染色、PCR、Southern blot以及RT-PCR鉴定证实,该基因已导入烟草基因组中。淀粉含量测定结果显示,转基因植株比非转基因植株淀粉含量平均增加了13.1%,由此验证了该载体构建的成功与可用性,为下一阶段用该载体转化木薯主栽品种提高块根淀粉含量的研究奠定了基础。