HIV21 gag基因和gp120基因转化番茄及转基因植株再生

构建了HIV 1的gag基因、gp1 2 0基因及gag gp1 2 0嵌合基因的植物双元表达载体。通过农杆菌介导法将HIV 1的gag基因、gp1 2 0基因和gag gp1 2 0嵌合基因导入番茄 ,获得抗性转化再生植株。PCR检测和Southern杂交鉴定目的基因已整合到再生植株基因组中 ,获得了转基因植株。GUS染色及Northern杂交结果表明目的基因已得到表达。本实验首次进行了HIV 1抗原基因转化番茄的研究 ,为利用番茄生产艾滋病新型口服疫苗打下了良好的基础。     

一种新型HIV疫苗能有效预防SHIV通过黏膜感染

HIV严峻的流行形势迫切需要艾滋病疫苗,特别是黏膜疫苗。法国科学家Morgane Bomsel发表在最新一期Immunity中的文章表明,由该实验室研制的HIV黏膜疫苗能有效预防免疫缺陷病毒的黏膜感染。该疫苗是由包裹gp41亚单位抗原的病毒小体组成。该疫苗肌肉注射和滴鼻两种方式免疫恒河猴,     

人Ⅰ型免疫缺陷病毒gag-env嵌合基因在重组痘苗中的表达

Gag和Env蛋白是人Ⅰ型免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirustype1,HIV1)的结构蛋白,是HIV1诱导机体产生体液免疫和细胞免疫的主要抗原。本实验通过多次亚克隆,将env基因以正确的三联密码读框插入gag基因的下游,制备了HIV1gagenv嵌合基因,并将嵌合基因分别置于痘苗病毒p75启动子和牛痘病毒A型包涵体(ATI)启动子的下游,经过同源重组和红细胞吸附试验筛选,获得了2株重组痘苗病毒。免疫荧光试验和酶免疫试验证明,两株重组痘苗病毒均能正确地表达HIV1gagenv嵌合基因。动物实验表明,gagenv嵌合基因重组痘苗病毒可诱导小鼠产生抗HIV特异性抗体。这些结果为艾滋病颗粒化疫苗的研制提供了借鉴。     

艾滋病疫苗

艾滋病疫苗英国剑桥ＡＸｉｓ遗传公司推出了利用嵌合病毒颗粒（ＣＶＰ）技术生产人免疫缺陷病毒或艾滋病毒（ＨＩＶ）疫苗的技术。实验室试验表明,用不同剂量的ＨＩＶＰＰ“肽嵌合病毒颗粒［ＣＶＰ—ＨＩＶ（ｇＰ“）」免疫小鼠,可使其产生大量的中和抗体。还证明,这些...     

表达HIV-1 CRF01＿AE亚型结构基因小鼠模型的建立和鉴定

目的:构建并鉴定表达HIV-1 CRF01_AE亚型结构基因的小鼠模型。方法:使用哺乳动物密码子优化的HIV-1 CRF01_AE gp160基因,通过慢病毒包装系统构建重组慢病毒LV-GFP-AE gp160,将上述重组慢病毒感染小鼠肺上皮细胞TC-1,经嘌呤霉素抗性筛选获得稳定表达gp160基因的TC-1细胞。采用RT-PCR、流式细胞术检测gp160基因在细胞内的表达稳定性,将稳定表达Gp160蛋白的TC-1-HIV AE gp160细胞接种小鼠,用免疫组化方法检测小鼠体内细胞团块中HIV Gp160蛋白的表达。结果:菌落PCR、酶切鉴定和测序表明重组质粒pLVX-AE gp160构建正确,RT-PCR、GFP荧光及流式细胞术结果均显示gp160基因能在细胞TC-1中稳定表达,免疫组化结果也表明小鼠体内接种的细胞可以稳定表达HIV Gp160蛋白。结论:建立了稳定表达HIV-1 CRF01_AE亚型Gp160蛋白的TC-1细胞及小鼠模型,为HIV-1 CRF01_AE亚型HIV疫苗的临床前研究提供了可靠的体外、体内免疫原性评价工具,为该疫苗的进一步开发奠定了坚实的实验基础。     

HIV-1 gagpol病毒样颗粒疫苗免疫小鼠的实验研究

目的:为构建含中国流行株HIV*1核心蛋白(gag、pol)基因的病毒样颗粒疫苗(VIP疫苗),并评价其诱导的体液和细胞免疫反应效果.方法:将重组质粒pcDNA3.1/gagpol稳定转染HEK293细胞,上清液经蔗糖垫层超速离心纯化后,用收获的VLP疫苗免疫小鼠,通过ELLSA检测免疫小鼠的特异性抗体和IFN-γ,通过乳酸脱氢酶(LDH)实验检测小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应.结果:VLP疫苗免疫组小鼠血清的抗HIV-1 gp160抗体滴度和IFN-γ均升高(P<0.01).其特异性CTL活性均高于PBS对照组(P<0.01).结论:构建的VLP疫苗免疫小鼠可以诱导特异性体液和细胞免疫应答,为进一步研制HIV治疗性疫苗奠定基础.     

HIV-1 gp41 NC六螺旋的结构与功能研究

AIDS是严重危害人类健康的疾病,而HIV是导致这种疾病的病毒。gp41六螺旋在介导HIV-1病毒与靶细胞间的膜融合过程中起着重要作用。因此,对于gp41结合蛋白的研究有助于深入了解gp41在HIV-1感染整个过程中扮演的角色,解释gp41对靶细胞的调控机制,为寻找新的抗艾滋病药物靶点以及艾滋病抑制剂的设计提供有益的思路。作者的实验室相继发现了一批与gp41六螺旋结构相互作用的蛋白质,进而对HIV-1 gp41六螺旋介导的膜融合过程和HIV-1感染机理有了更深入的了解。     

电转联合热休克蛋白佐剂疫苗引发抗HBV的免疫应答

针对HBV感染的治疗性DNA疫苗虽然具有很好的应用前景,但目前抗病毒效果并不高,表明在病毒长期感染过程中存在免疫抑制机制。以HBV的表面蛋白(HBsAg)和核心蛋白(HBcAg)为DNA疫苗抗原,采用gp96和HSP70作为佐剂联合电转以提高疫苗的活性。将gp96为佐剂的HBsAg/HBcAg DNA疫苗免疫HBV转基因鼠后引发抗原特异性的细胞免疫和体液免疫应答。使用gp96和HSP70佐剂引起Treg下调20%。与没有免疫的小鼠相比,以gp96和HSP70为佐剂的DNA疫苗显著降低血清中病毒S抗原水平和DNA拷贝数,大幅降低小鼠肝脏中HBc的表达。该研究为设计以gp96为佐剂的乙肝治疗性DNA疫苗提供了依据。     

重组HIV-AEgp145和SIV-envT基因的rAAV8在小鼠体内的免疫原性研究

病毒性载体疫苗是一种有前途的艾滋病疫苗.为了构建以重组腺相关病毒8型(recombinant adeno associated virus type 8,rAAV8)为载体,表达HIV或SIV包膜蛋白的艾滋病疫苗.同时在小鼠体内对其免疫原性进行评价,为下一步研究奠定基础.本研究分别构建了表达HIVAE亚型和SIVmac239株包膜蛋白(不含胞内区)的rAAV8-AEgp145和rAAV8-SIVenvT两种重组病毒,并通过PCR和WesternBlot方法对重组病毒进行了体外鉴定.将两种重组病毒分别接种BALB/c小鼠,应用ELISA和ELISPOT方法检测小鼠的HIV/SIV特异性抗体滴度和细胞免疫应答强度.结果显示,rAAV8能够在293T细胞中高效表达HIV AEgp145和SIVenvT基因.小鼠接种两种重组病毒3-5W后,均能检测到gp120特异性抗体和env特异性细胞免疫应答,并且在16-20W后反应强度仍显著高于对照组.以上结果提示,携带HIVAEgp145和SIVenvT基因的rAAV8载体能够在小鼠体内诱导中等强度并且持续时间较长的特异性体液和细胞免疫应答.     

HIV—1 P24截短体与gp41截短体的融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定

用基因重组技术将截短的HIV－1 p24基因和gp41基因连接成嵌合基因,插入质粒pGEX-4T3,构建成重组表达质粒pGEX-F。将pGEX-F转化大肠杆菌BL21。经IPTG诱导表达,pGEX-F在大肠杆菌BL21中获得了高效表达。融合蛋白P24－gp41经Glutathione-Sepharose4B亲和层析纯化后,用间接ELISA和免疫印迹检测HIV抗体阳性血清和正常人血清,P24－gp41只与HIV抗体阳性血清反应,证明获得的融合蛋白P24－gp41有很强的抗原特异性和免疫反应性,具有较高的应用价值。     

冠状病毒糖基化呈现的α-半乳糖表位能增强COVID-19疫苗的免疫原性

正新型冠状病毒SARS-CoV-2上的多糖链及S蛋白形成了一层聚糖屏障(glycan-shield),掩盖了抗原肽,减少了抗原呈递细胞(APC)对灭活病毒或S蛋白疫苗的摄取。对灭活流感病毒和重组HIV疫苗gp120的研究表明,糖基化聚糖屏障呈现的α-半乳糖表位(Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R)能够利用天然抗半乳糖抗体增强疫苗效力,这在能够产生抗半乳糖的小鼠中进行了评估。α-半乳糖表位是天然抗半乳糖抗体的配基,     

HIV-1进攻靶细胞的机制及相应环节抑制剂

HIV－1是导致获得性免疫缺陷综合症（AIDS）的流行最广、破坏力最强的病毒。HIV－1分两个步骤特异性地进攻CD4^ 细胞：一是利用表面糖蛋白gp120和靶细胞膜上的受体结合;二是通过跨膜糖蛋白gp41使病毒的包膜和靶细胞的质膜发生融合,经过上述步骤,病毒的核心蛋白和遗传物质得以进入人体,然其中进行复制,遇时,细胞膜的稳定性被破坏,细胞的内外环境失去平衡,最终导致细胞死亡。HIV－1进攻靶细胞的机制研究所取得的成就为研制安全有效的抗HIV／AIDS药物提供了新的思路和方向。     

HIV-1包膜蛋白gp41优势抗原的构建及可溶性表达

目的:筛选1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)中国流行株中包膜蛋白gp41的优势抗原片段,构建具有区域流行代表性的HIV-1 gp41重组抗原,为改进现有HIV-1初筛试剂盒中使用的同类抗原奠定基础。方法:利用免疫斑点杂交和生物信息学方法,从收集自重庆、广州、上海的区域代表性150份HIV-1感染者血清标本中筛选gp41抗原性强的候选样本,利用RT-PCR及巢式PCR方法扩增包含重要抗原表位决定蔟的gp41基因片段,与原核表达载体pQE30连接,转化大肠杆菌M15构建gp41重组抗原表达菌株,表达后经亲和层析纯化、SDS-PAGE和Western印迹鉴定。结果:兔源HRP标记的gp41多抗能识别标本中gp41抗原性差异,得到候选样本,扩增包含gp41主要抗原表位片段;构建了包含gp41抗原表达簇的重组原核表达质粒,表达、纯化后经His标签抗体Western印迹鉴定为阳性。结论:高纯度的重组优势gp41抗原的构建和鉴定,为进一步改进现有HIV初筛诊断奠定了基础。     

HIV-1 gp41的酵母表面展示及表达优化

以His标签检测蛋白的表达, 利用酿酒酵母表面展示系统, 成功地将HIV-1 gp41片段锚定在酵母表面, 并检测到gp41的活性。以pMD18T-gp41为模板, 通过PCR技术克隆了gp41基因, 将gp41基因通过双酶切连接到载体pICAS-His上,构建了gp41酵母表面展示载体, 并将其转化至酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)MT8-1中。重组菌经培养, 利用免疫荧光染色方法进行染色, 显微镜观察发现重组酵母细胞表面有绿色荧光, 流式细胞仪结果进一步证实gp41正确折叠展示于酵母细胞表面。采用不同浓度的葡萄糖培养基进行表达优化。当葡萄糖浓度为1%时, 82.46%的酵母细胞表达了gp41抗原; 随着葡萄糖浓度升高, 蛋白表达受到抑制。     

HIV-1 gp41的酵母表面展示及表达优化

以His标签检测蛋白的表达, 利用酿酒酵母表面展示系统, 成功地将HIV-1 gp41片段锚定在酵母表面, 并检测到gp41的活性。以pMD18T-gp41为模板, 通过PCR技术克隆了gp41基因, 将gp41基因通过双酶切连接到载体pICAS-His上,构建了gp41酵母表面展示载体, 并将其转化至酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)MT8-1中。重组菌经培养, 利用免疫荧光染色方法进行染色, 显微镜观察发现重组酵母细胞表面有绿色荧光, 流式细胞仪结果进一步证实gp41正确折叠展示于酵母细胞表面。采用不同浓度的葡萄糖培养基进行表达优化。当葡萄糖浓度为1%时, 82.46%的酵母细胞表达了gp41抗原; 随着葡萄糖浓度升高, 蛋白表达受到抑制。     

被膜蛋白糖基化在HIV感染中的作用

在HIV感染过程中,病毒被膜蛋白糖基化起着重要作用。它使病毒粒子具有高度糖基化的表面,帮助HIV逃避人体免疫细胞识别和攻击。在病毒入侵时,被膜糖蛋白与宿主细胞表面的受体结合,并进行一系列构象变化,使病毒粒子顺利地与宿主细胞膜融合。介绍近年来对被膜蛋白糖基化过程与HIV成熟、感染和逃避免疫应答等方面分子水平作用机理的深入了解,这些作用机理将会有助于艾滋病疫苗的研制和以“糖链为靶”药物的开发。     

携带HIV-1抗原的单纯疱疹病毒载体疫苗的构建及鉴定

利用细菌人工染色体技术将串联的HIV-1 gp160、gag和protease基因以及表达元件插入1型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)内部反向重复序列区,以获得携带HIV-1抗原的单纯疱疹病毒载体疫苗。首先将HIV-1 gp160(B型和C型)、gag和protease基因串联克隆入pc DNA3获得重组质粒pc DNA/g Bgp和pc DNA/g Cgp,重组质粒转染293FT细胞,Western blotting检测HIV抗原表达。继而将pc DNA/g Bgp和pc DNA/g Cgp中包括HIV-1抗原基因和表达元件的表达框克隆入p KO5/BN获得重组穿梭质粒p KO5/BN/g Bgp和p KO5/BN/g Cgp,穿梭质粒电转含BAC-HSV的大肠杆菌,筛选重组菌,提取重组DNA并转染Vero细胞,挑取病毒蚀斑纯化重组病毒,Southern blotting鉴定重组病毒DNA,Western blotting检测重组病毒感染细胞中HIV抗原表达,并分析病毒的增殖特性。结果表明,Western blotting在pc DNA/g Bgp和pc DNA/g Cgp转染的293FT细胞中检测到表达的gp160和gag蛋白。p KO5/BN/g Bgp和p KO5/BN/g Cgp分别电转获得重组菌,并从重组DNA转染的Vero细胞中纯化获得重组HSV,Southern blotting检测表明重组HSV基因组发生特异性重组,重组病毒感染细胞中检测到gp120和gp41,且重组HSV保留了在哺乳动物细胞中的复制能力。本研究获得携载HIV-1 gp160、gag和protease基因的重组HSV,并保留了在哺乳动物细胞中的复制能力,可作为HIV-1复制型病毒载体疫苗。     

HIV抗体抑制病毒感染的免疫效应和机制

在非人灵长类动物和人源化小鼠模型的实验研究中已经证明,人类免疫缺陷病毒(HIV)的广谱中和抗体(bNAbs)具有保护作用。近期bNAbs 3BNC117和VRC01的临床Ⅰ期试验证实,两种中和抗体均可降低未接受抗病毒治疗的HIV感染者的病毒载量。然而,bNAbs目前尚难以通过疫苗诱导产生。在泰国RV144疫苗试验中,疫苗对受试人群的总体保护率为31%,血液样本中未检出bNAbs,表明抗体的其他免疫效应功能在抑制病毒感染和复制的过程中发挥了重要作用。越来越多的研究表明,通过抗体Fcγ受体(FcγR)介导的非中和抑制作用在保护黏膜组织免受HIV感染的过程中可能发挥重要作用。在HIV通过黏膜组织传播的早期,树突状细胞和巨噬细胞表面表达的Fc受体可能起着决定性的作用,已有研究证实它们是HIV通过黏膜组织最初感染的靶细胞。因此,在新的疫苗设计策略中,除了诱导bNAbs产生,具有其他免疫效应功能的非中和抑制性抗体也应纳入疫苗接种评价体系中。     

乙脑/登革4型嵌合病毒的构建及其小鼠神经毒力测定

目的构建以乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)疫苗株SA14-14-2为基因骨架的乙脑/登革4型嵌合病毒,并分析该嵌合病毒对小鼠的神经毒力。方法通过重叠PCR方法扩增含有登革病毒4型(DENV-4)H241株pr ME基因序列和乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2的NS1蛋白前177个核苷酸的融合片段,用Nar I和Bgl II双酶切后替换乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2全长克隆中的相应区域,构建成乙脑/登革4型嵌合全长克隆,通过体外转录和转染BHK21细胞获得嵌合病毒(JEV/DENV-4 chimeric virus,JD4)。通过测定嵌合病毒JD4和2个母本株JEV SA14-14-2株及DENV-4 H241株蚀斑大小、小鼠脑内神经毒力和皮下感染入脑能力、乳鼠脑内神经毒力,比较JD4和母本株之间的差异。通过将JD4在原代地鼠肾(primary hamster kidney,PHK)细胞传代30次,分析传代后嵌合病毒的神经毒力是否减弱及减弱的程度。结果测序结果表明,构建的嵌合病毒JD4基因组序列和预期一致,没有产生新的位点突变。JD4蚀斑较SA14-14-2明显偏小,但和DENV-4 H241株没有明显区别。JD4对3周龄小鼠具有较强的脑内神经毒力,和母本株DENV-4 H241没有差异,对小鼠没有神经侵袭力。乳鼠实验结果表明,嵌合病毒JD4脑内神经毒力虽然略低于母本株DENV-4 H241,但两者之间没有明显差异,都明显强于乙脑疫苗株SA14-14-2。在PHK细胞传代30次后,小鼠神经毒力虽然有所减低,但并不明显。结论成功构建了嵌合病毒JD4,通过测定并比较JD4与母本株的蚀斑特征、小鼠及乳鼠神经毒力等试验,为分析登革疫苗候选株安全性研究奠定了基础。     

人类免疫缺陷病毒-1进入细胞的分子机制及相关药物的研究

艾滋病（AIDS）是由人类免疫缺陷病毒（HIV）侵染表达CD4表面抗原（CD4⁺）的T淋巴细胞而引起的.艾滋病病毒进入CD4⁺T淋巴细胞首先是通过病毒与细胞膜的融合来完成的.该融合过程涉及到病毒表面膜蛋白（gp120和gp41）与细胞表面受体蛋白（CD4和CCR5等）之间的相互作用.根据对这些蛋白质分子结构及作用机制的认识,从破坏病毒与细胞的融合入手,设计新型的抗艾滋药物及疫苗,已成为目前药物开发的新热点.