hCG嵌合肽在大肠杆菌中高表达的研究

目的：研制基因工程嵌合肽（CP）抗原的科学意义和应用价值，除取决于CP构建物能否体现强免疫原性和光或无MHC遗传限制外，它还应能在生物系统中被高表达，对于后，我们作了多方面的探索，包括在系列hCG CPs(-1,-7,-10,和－11）的N端再接一段25聚肽的研究。方法：插入片段选自可高表达的猪卵透明带（pZP)－4蛋白的N端，在上述hCGCPs的衍生物（CP12，CP15－17）构建中，先合成它的编码序列正负链4个DNA片段，然后配对退火，再连接成一个大片段，由于其5'端为EcoRI(E)粘性末端，3'端接了母体CPs 5'端ATG后至B HI(B)粘性末端的17bp序列，故此合成片段被直接经E和B双酶切构建pBV221/CP系列重组质粒，并分别经DNA测序验证，结果：在SDS－PAGE分析中，新构建的CP衍生物在宿主菌中的表达量均比母体CPs有明显提高，且的特异表达都为单抗OT3A的蛋白印迹试验所证实。另外，用兔抗pZP多抗的检测显示阴性结果，表明所选用的pZP-4肽段内无B细胞表位存在。意义：本工作不仅为今后其他CP分子设计和高表达研究结累了经验，也扩展了可供筛选的hCG CP避孕和／或肿瘤治疗性疫苗原系列。     

hCG嵌合肽(CP18～21)的构建和原核系统表达

hCG嵌合肽(CP18～21)的构建和原核系统表达@徐万祥$上海市计划生育科学研究所国家计划生育药具重点实验室! 中国 上海200032 @熊艳$上海市计划生育科学研究所国家计划生育药具重点实验室! 中国 上海200032 @廖矛川$上海市计划生育科学研究所国家计划生育药具重点实验室! 中国 上海200032 @孙志达$上海市计划生育科学研究所国家计划生育药具重点实验室! 中国 上海200032 @应康$复旦大学生命科学院遗传工程国家重点实验室! 中国 上海200433 @顾少华$复旦大学生命科学院遗传工程国家重点实验室! 中国 上海200433 @…     

多表位hCG嵌合肽(CP1和CP10)抗原的构建及其免疫原性

本研究设计了CP1和CP10两种嵌合肽免疫原,它们由人绒毛膜促性腺激素β亚单位(β- hCG)3个线性B细胞表位(BCE)以及包括来自乙肝表面抗原和破伤风类毒素2个广谱性T细胞表位(TCE)的6个TCEs组合而成。编码CP1及其衍生物CP10的人工基因分别重组插入热诱导pBV221载体后,均能在大肠杆菌中以约占细菌总蛋白1％的比例被表达。在蛋白印迹试验中,在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上显示约为16．5 kD分子量的CP1和CP10表达蛋白,能被抗各插入表位单克隆或多克隆抗体识别。各表达蛋白可用制备性PAGE方法一步纯化,纯化产物均显示95％以上的电泳均一性,纯化得率可达到每升培养液1-2mg水平。以它们为抗原主动免疫小鼠,都能分别产生识别CP1或CP10和天然β-hCG的抗血清,并都能在它们的抗血清中检测到各插入抗原表位的抗体。hCG CPs的可获得性及其能诱导各表位抗体生成特征,有可能成为研制hCG抗生育和肿瘤治疗性疫苗的新的候选免疫原。     

新型重组人内毒素结合肽突变体的构建及原核表达纯化

目的构建新型人内毒素结合肽（a new endotoxin binding peptide consisting of 25 amino acid residues,EBP25）及其突变体（mutant of EBP25,mEBP25）的原核表达重组质粒,并在大肠埃希菌中诱导表达。方法采用PCR法,扩增EBP25基因,构建pET-30-EBP25.融合表达载体并转化Ecoli DH5α扩增。重组质粒经酶切和测序鉴定后,应用快速定点突变法将EBP25第2位缬氨酸和第5位谷氨酰胺所对应碱基均替换成赖氨酸所对应的碱基,突变后重组质粒再经测序鉴定后,将二者转化至E．coli BL21（DE3）PlysS后经IPTG诱导表达,表达产物采用Western印迹进行鉴定后,用His—Tag亲和层析对融合蛋白进行纯化。结果两次测序结果显示人EBP25,和mEBP25重组序列和理论设计序列完全一致后,经IPTG诱导表达获得目的融合蛋白,通过SDS—PAGE电泳、Western印迹证实蛋白表达的特异性,并对蛋白进行纯化,获得EBP25和mEBP25融合蛋白。结论构建、表达纯化了EBP25和mEBP25融合蛋白,为进一步研究其中和内毒素／月旨多糖活性奠定了基础。     

人FGF21原核表达载体的构建及重组蛋白表达

构建人FGF21(fibroblast growth factor,FGF)cDNA的原核表达载体并诱导其重组蛋白表达。提取人肝脏总RNA后,经RT-PCR扩增获得目的片段,构建其T载体进行保存。再构建重组原核表达载体pET-28a(+)-h FGF21,重组质粒转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,在IPTG诱导下得到可溶性表达,采用亲和层析法纯化表达产物后,进行Western blot鉴定。成功构建重组质粒pET-28(+)-hFGF21,对其进行可溶性表达后成功纯化出his-hFGF21,经Western blot鉴定该融合蛋白可与FGF21抗体特异性结合。成功构建pET-28(+)-hFGF21,并可溶性表达his-hFGF21蛋白。     

人源肽抗生素hBD—2表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

为了构建人源肽抗生素hBD－2的表达质粒燕在大肠杆中表达,将化学合成的hBD-2全基因原核融合蛋白靛质粒pinpointXa-3的多克隆位 构建成表达质粒,按常规方法转化大肠杆菌JM109,筛选阳性重组子并诱导融合蛋白的表达,结果经酶切鉴定获得7个阳性克隆,序列分析表明其中4个克隆的插入序列与hBD-2基因完全一致,另3个克隆插入序列的39位由C突变为5T,89 多了一个Go,正确的阳性克隆子在大肠杆菌中产生了约18kD的特异性诱导蛋白,hBD-2的成功表达为进一步研究hBD-2的抗菌活性,抗菌机理打下了一定的基础。     

家蚕拟抗微生物肽Gloverins基因（Bmglv）的原核表达及抗菌活性鉴定

家蚕Bombyx mori基因组全测序于2004年完成后,由家蚕基因组注释发现了35条拟抗微生物肽基因序列。本研究选取其中的5条Gloverins同系物（isoforms）基因(BmglvB,BmglvA2 ,BmglvA3,BmglvA5和BmglvA6 ),克隆至pET-21d载体,转化Escherichia coli Rosetta^TM（DE3）宿主菌进行表达;克隆表达的5个家蚕Gloverins同系物基因大部分以可溶形式表达,经Ni-NTA亲和层析纯化和Sephadex G-10脱盐处理后,采用平板孔穴抑菌法测定其抗菌活性。结果表明：注释发现的5条家蚕拟抗微生物肽Gloverins同系物基因,具有与在其他昆虫中已鉴定报道的Gloverin相似的抗革兰氏阴性细菌的功能,实验确认了它们就是家蚕Gloverins抗微生物肽基因。     

黑腹果蝇抗真菌肽基因Drs和Drs-lC 的原核可溶性表达及抗真菌活性测定

Drosomycin （Drs）是第1个从黑腹果蝇Drosophila melanogaster体内鉴定发现的昆 虫抗真菌肽因子。它对细菌无明显的抗性,但对丝状真菌具有高效广谱的抑杀作用。此外, 在黑腹果蝇基因组还存在着Drs的另外6个同系物的基因序列,其中同系物Drosomycin-lC（Drs-lC）的抗真菌谱仅次于Drs。将Drs抗真菌肽基因(Drs)和同系物Drs-lC基因（Drs-lC）进行可溶性表达,对果蔬等农产品防腐保鲜的研究有应用前景。本实验将Drs和Drs-lC分别克隆到硫氧还蛋白（Trx）融合表达载体pThiohis A中,转化宿主菌TOP10,进行可溶性表达,并从诱导表达的菌液起始浓度、IPTG的诱导浓度及诱导时间等方面进行了表达条件的优化。结果表明2种融合蛋白Trx-Drs和Trx-Drs-lC大部分以可溶形式表达,可溶性表达的Trx-Drs在上清液中约占菌体总蛋白的22％。2种融合蛋白的表达产物经 Ni-NTA亲和层析得到纯化。生测结果表明, 2种融合蛋白分别对8种供试真菌中的5种真菌显示明显的抗性。     

Reteplase（K）原核分泌表达载体的构建及其初步表达

在原核表达载体pErA（K）的基础上,构建新型原核分泌表达载体pBrA（K）,并实现其在原核表达系统中的表达。用限制性内切酶NcoI,XhoⅠ同时双酶切获得目的基因rPA（K）后,以T4连接酶将其连接到pET-20b（＋）上,构建新型原核分泌表达载体pBrA（K）并实现了在大肠杆菌中表达,经纤维蛋白平板检测存在于重组菌株培养液上清中的分泌蛋白有溶纤活性。ELISA结果显示表达产物与抗t-PA抗体呈现特异性阳性反应,进一步参考标准曲线得出样品中rPA（K）的平均含量为51 ng/mL。实验结果证明新型原核分泌表达载体pBrA（K）构建成功,并实现了其在原核表达系统中的表达,为新型rPA（K）的表达优化及后续的纯化研究工作奠定了基础。     

少棘蜈蚣候选杀虫肽κ-SLPTX-Ssm2e的原核表达与纯化

κ-SLPTX-Ssm2e是一条通过生物信息学同源序列分析获得的与已知具有杀虫活性的毒素κ-SLPTX-Ssm2a高度同源的少棘蜈蚣毒素,由31个氨基酸残基组成,且含有3对二硫键。为了后续便于对其结构和功能进行研究,现采用原核表达与纯化的方法来获取较高产量的毒素多肽。文中首先利用大肠杆菌自动诱导表达系统,在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中表达融合蛋白GST-SUMO-κ-SLPTX-Ssm2e,将其通过GST亲和层析纯化后,采用Ulp1激酶酶切,以释放毒素分子。随后,通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)进一步纯化。最后,利用MALDI-TOF/TOF质谱仪鉴定目的多肽峰的相对分子质量为3 475.732,与κ-SLPTX-Ssm2e的理论相对分子质量3 475.07基本一致,说明κ-SLPTX-Ssm2e很有可能被成功表达。上述结果为进一步研究κ-SLPTX-Ssm2e的杀虫活性奠定了基础。     

人受精促进肽受体基因（TCP11b）的剪接、克隆和差别表达

运用同源比较和PCR法 ,从人睾丸组织中分离了人受精促进肽受体TCP11基因的一个新的剪切体TCP11b ,它编码 5 0 3个氨基酸的蛋白质 ,与TCP11a相比 ,在基因组的 5′端存在复杂的外显子剪接现象。运用荧光原位杂交 (FISH)方法 ,显示该基因定位到人染色体 6p2 1。Northern杂交及多组织RT PCR的结果显示该转录本在正常睾丸中表达 ,而其他组织、无精症患者及胎儿睾丸组织中未见该基因的表达。该结果结合mTcp 11功能的提示 ,TCP11b这种转录本对精子发生和人受精过程可能起重要作用。     

u—PA／t—PA嵌合型纤溶酶原激活剂（ut—PA）的构建,表达,纯化和性…

将尿激酶原ｃＤＮＡ和组织型纤溶酶原激活剂Ａ链ｃＤＮＡ克隆到Ｍ１３ｍｐ１８中,经过二次寡核苷酸诱导的大片段定点删除了一次寡核苷酸诱导的多位点突变,得到了ｊ－ＰＡ／ｔ－ＰＡ融合基因。