柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)早熟株与亲本株致病性和繁殖力的研究

通过对经15代选育的柔嫩艾美耳球虫(E. tenella)山西株的早熟株与其亲本株的繁殖力和致病性进行比较研究,证实早熟株的潜隐期比亲本株缩短21 h,繁殖力下降40%左右;对致病性的研究显示,早熟株感染后对鸡只增重、AC I的影响较小,对11日龄雏鸡的半数感染量和半数致死量较亲本株增大,肠道病变记分较亲本株下降。由此认为,该早熟株符合球虫早熟株的特性,可用于鸡球虫病早熟苗的制作。     

毒害艾美耳球虫早熟株的选育及内生发育观察

为选育制备弱毒疫苗所需的毒害艾美耳球虫早熟株,运用Jeffers建立的早熟系选育方法对毒害艾美耳球虫（E．necatrix）山西分离株进行了早熟选育,并观察其内生发育。结果表明,经过海兰白雏鸡8次传代之后,Enecatrix潜隐期由146．5h缩短至139h,排卵高峰期由168h提前至156h;其虫体各个发育阶段与亲本株相似,但第二代裂殖体明显小于亲本株,且出现的高峰提前。     

柔嫩艾美耳球虫安徽肥西(AHFX)株的分离与鉴定

目的 分离并鉴定安徽肥西病鸡盲肠内的柔嫩艾美耳球虫.方法 通过雏鸡进行单卵囊接种与增殖试验,对所获卵囊用形态学方法进行初步鉴定;运用PCR方法扩增该分离株的ITS-1基因序列,并与相关序列进行比对、构建系统进化树.结果 该球虫分离株孢子化卵囊的平均大小为21.1 μm ×18.0 μm,卵形指数为1.17,潜隐期为140 h;其ITS-1基因序列与柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)GQ856310相似性达98.2％,二者的亲缘关系非常接近.结论 该球虫分离株为柔嫩艾美耳球虫(E.tenella),暂命名为柔嫩艾美耳球虫安徽肥西(AHFX)株.     

鸡球虫18S rRNA基因序列的测定与分析

为了利用18S rRNA基因进行鸡球虫系统进化分析,对巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)、柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)、堆形艾美耳球虫(E.acervulina)3种共8个不同来源的虫株,分别提取总DNA进行18S rRNA基因的扩增和测序;将得到的序列登录GenBank进行同源性和趋异性分析,并结合GenBank中其它原虫的18S rRNA基因序列构建进化树.结果显示扩增获得8株鸡球虫18S rRNA基因长度为1746～1756 bp,序列比对显示同种不同株间的同源性大于不同种间的同源性,其中3株E.maxima株间同源性在98.7%～99.3%之间,4株E.tenella株间同源性在99.7%～99.9%之间;不同种间同源性为96.5%～98.1%,其中E.maxima与E.tenclla的遗传距离最大,为0.038;E.maxima与E.acervulina的遗传距离最小,为0.021.顶复器门9个不同属所构建的进化树结果显示,E.imeria和等孢属(Isospora)聚为一支,说明亲缘关系比较近.与GertBank中其它5株不同鸡球虫的18S rRNA基因共同构建的进化树显示,3株E.maxima聚为一支,与E.brunetti、E.mitis、E.mivati、E.praecox和E.acervulina聚为一大分支;4株E.tenella与1株E.necatrix共同形成一个分支,说明E.tenella与E.necattix的亲缘关系最近.本研究证实了在鸡球虫系统进化研究中,18S rRNA基因不仅可以区分不同种,而且有可能成为区分同种不同株的理想靶基因.     

柔嫩艾美耳球虫重组鸡痘病毒的构建与免疫保护研究

以鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)杂交株F2的RNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增了杂交株F2的Rhomboid蛋白家族相关基因,将PCR产物克隆至pMD18-T载体中,构建出克隆质粒pMD-Rhomboid.以KpnⅠ、PstⅠ双酶切重组质粒pMD-Rhomboid和鸡痘病毒载体质粒pUTA2,并将纯化的Rhomboid基因亚克隆至鸡痘病毒载体pUTA2复合启动子下游,构建出真核表达重组质粒pUTA-Rhomboid.采用脂质体转染技术,将该质粒转染FPV282E4株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)中,通过BrdU药物加压筛选,并通过RT-PCR和蛋白质印迹等方法检测,筛选出一株球虫鸡痘重组病毒rFPV-Rhomboid.进一步经CEF扩增病毒后,免疫雏鸡,监测免疫指标.结果表明:重组病毒接种鸡外周血中的CD4 、CD8 含量显著高于非免疫对照组(P<0.05);与对照组相比,重组病毒对鸡的增重效果差异显著(P<0.05),对E.tenella的攻击具有一定的保护作用,显示出较好的应用前景.     

E.tenella感染鸡CD4+、CD8+T细胞的动态变化研究

用免疫组化ABC法检测了柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)感染雏鸡后各免疫器官和盲肠局部的T淋巴细胞亚群CD4 淋巴细胞和CD8 T淋巴细胞数的动态变化。结果表明:(1)雏鸡初次感染E.tenella后,免疫器官盲肠扁桃体、脾脏、胸腺和盲肠黏膜中的CD4 T淋巴细胞均于第2天开始增殖,第6天~8天达到峰值;二次感染后第2天有短暂的下降,第5天开始缓慢回升,第8天二次达到峰值,但第二个峰值比第一个峰值低,说明CD4 T淋巴细胞积极参与启动免疫应答和抵抗初次感染。(2)雏鸡初次感染E.tenella后,免疫器官法氏囊、盲肠扁桃体、脾脏、胸腺和盲肠黏膜中的CD8 T淋巴细胞都于第2天开始增殖,第8天达到峰值;二次感染后立即回升,第5天达到峰值,然后缓慢下降,且第二个峰值比第一个峰值高,表明CD8 T淋巴细胞是抵抗再感染的主力。     

柔嫩艾美耳球虫孢子发育阶段虫体抑制性消减文库的构建

为了分离鉴定柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)孢子发育阶段虫体的差异表达基因,分别以柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊和孢子化卵囊为驱动组、子孢子为实验组,或未孢子化卵囊为驱动组、孢子化卵囊为实验组,利用抑制性消减杂交(SSH)技术,构建了2个子孢子cDNA消减文库和1个孢子化卵囊cDNA消减文库。随机从3个cDNA消减文库中分别挑取50个克隆,经PCR鉴定2个子孢子cDNA消减文库的重组率都为96%,孢子化卵囊cDNA消减文库的重组率为98%。从每个文库中随机挑取50个克隆测序,并进行同源性比较分析,结果显示:从孢子化卵囊cDNA消减文库中获得了13个单一有效序列,其中8个EST与已知蛋白同源性很高;从2个子孢子cDNA消减文库中共获得了40个单一有效序列,其中9个EST与已知蛋白同源,其余可能为柔嫩艾美耳球虫的新基因。这些结果为分离柔嫩艾美耳球虫新功能基因和进一步探索防治球虫病的方法提供了理论基础。     

柔嫩艾美耳球虫感染对鸡盲肠中益生菌的影响

双歧杆菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐｐ．）及乳酸杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｐ．）被认为是动物机体内重要的有益微生物菌群之一。本文对鸡感染柔嫩艾美耳球虫后盲肠中上述两种微生物的变化情况进行了研究。结果表明：鸡在感染球虫后第４、７、１０ｄ时盲肠中双歧杆菌的数量显著减少（Ｈ＜０．０５）;在球虫感染后的第４、７、１４ｄ时,盲肠中的乳酸杆菌呈显著下降趋势（Ｐ＜０．０５）。     

柔嫩艾美耳球虫感染对鸡盲肠中益生菌的影响*

双歧杆菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐｐ．）及乳酸杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｐ．）被认为是动物机体内重要的有益微生物菌群之一。本文对鸡感染柔嫩艾美耳球虫后盲肠中上述两种微生物的变化情况进行了研究。结果表明：鸡在感染球虫后第４、７、１０ｄ时盲肠中双歧杆菌的数量显著减少（Ｈ＜０．０５）;在球虫感染后的第４、７、１４ｄ时,盲肠中的乳酸杆菌呈显著下降趋势（Ｐ＜０．０５）。     

新型奶牛乳房炎多联苗的研制及免疫力试验

目的：筛选出毒力较强的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌作为制苗菌株,制成多联菌苗,预防及治疗奶牛乳房炎。方法：通过菌株的分离、纯化、鉴定试验及毒力试验获得毒力较强的菌株,制成金黄色葡萄球菌类毒素及菌体蛋白、大肠杆菌和无乳链球菌灭活菌苗,合理配伍制成多联菌苗,进行安全、异常毒性及免疫力试验。结果：所选金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌的最小致死量分别是3．0&#215;10^8／ml、1．5&#215;10^8／ml、9．0&#215;10^8／ml,多联苗安全、异常毒性试验合格,对免疫组小白鼠保护率为83．3％。结论：该多联菌苗具有安全、无毒、高效的特点,可以用来预防及治疗奶牛乳房炎。