核酸疫苗pcDNA3.1-EG95的构建及在绵羊胎儿成纤维细胞中的表达

克隆细粒棘球蚴EG95基因cDNA并构建核酸疫苗pcDNA3.1-EG95。根据GenBank中细粒棘球蚴EG95基因序列(AF134378)设计引物并在上游引物起始密码子前加上Kozak序列(CCACC),提取细粒棘球蚴总RNA,RT-PCR扩增目的基因EG95cDNA,扩增片段克隆到pcDNA3.1(+)中构建重组载体pcDNA3.1-EG95后测序。重组质粒pcDNA3.1-EG95采用脂质体法转染绵羊胎儿成纤维细胞并用G418筛选,RT-PCR检测稳定转染细胞中目的基因的转录。测序结果表明克隆的目的基因包含了471bp的完整ORF并与载体连接正确。RT-PCR检测表明EG95基因在稳定转染的绵羊胎儿成纤维细胞中得到转录。成功构建pcDNA3.1-EG95核酸疫苗并可在绵羊胎儿成纤维细胞中转录目的基因,可进一步用于活体动物免疫研究。     

细粒棘球蚴eg95基因的克隆以及原核融合表达

从青海省羊源细粒棘球蚴提取基因组DNA,PCR扩增eg95基因并且克隆。测序结果表明该基因序列全长1262bp,由2个内含子和3个外显子组成,3个外显子分别为70bp、306bp和95bp。因此,推测其ORF为471bp,编码156个氨基酸。用RT—PCK方法扩增该基因的ORF,经克隆、DNAstar比对分析序列,它与预测的ORF序列100％相同。将目的基因克隆到原核表达载体pGEX-5x-1,构建重组表达质粒pGEX-5x-1-eg95,将其转入表达菌株BL21中进行原核表达。表达产物经过SDS—PAGE电泳分析,得到一条特异的蛋白条带;质谱鉴定证明表达的蛋白确实是eg95抗原蛋白;酶联接免疫吸附剂测定表明抗原抗体发生了特异性反应,进一步证明融合蛋白进行了正确表达,从而为囊型包虫病的研究奠定基础。     

抗菌肽Diptericin cDNA的克隆及在E.coli中的融合表达

 从果蝇成虫中抽提总 RNA,RT- PCR扩增编码伏蝇素 diptericin的 c DNA,克隆并测定了全序列 .将该 c DNA亚克隆到融合表达载体 p MAL- CR1上 ,转化大肠杆菌 BL2 1菌株 ,进行了高效的可溶性融合表达 .通过离子交换层析纯化融合蛋白 ,经 Xa因子酶切后得到的重组 diptericin具有抗菌活性 .     

棘球蚴囊液对小鼠脾细胞IL-17及Smad2表达的影响

目的:观察细粒棘球蚴囊液对体外培养BALB/c小鼠脾细胞白介素(IL)-17和Smad2基因表达的影响.方法:制备小鼠脾细胞悬液,接种于48孔培养板中进行培养,以不加任何干预为对照组,囊液处理组为实验组.定时取样提取总RNA,经反转录成cDNA后用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测IL-17和Smad2基因的表达.结果:小鼠脾细胞IL-17表达在囊液处理6h和12h后升高(1.000±0.207 VS 3.672±0.746和1.000±0.154 VS 5.525±0.843),差异有统计学意义(P＜0.05);小鼠脾细胞Smad2表达在培养1h后升高(1.000±0.077 VS 2.069±0.098)在12h后降低(1.000±0.110 VS 0.247±0.011),差异有统计学意义(P＜0.05);协同分析发现IL-17基因与Smad2基因的表达变化呈现负相关(P＜0.01),相关系数r=-1.结论:细粒棘球蚴囊液对小鼠脾细胞IL-17和Smad2基因的表达具有上调作用,推测其可能与宿主抗棘球蚴感染的机制有关.     

兔IFRG基因的克隆及表达分析

实验通过对兔子基因组DNA进行PCR获得兔IFRG基因,将其克隆到pGEM-T载体,双酶切鉴定和测序结果表明成功构建了重组克隆载体pGEM-T-IFRG。通过RT-PCR分析发现IFRG基因在兔不同组织中有不同程度的表达。将重组克隆载体pGEM-T-IFRG和表达载体pET-41（c）经过EcoR1和Xho1双酶切后连接构建重组表达载体pET-41（c）-IFRG,将双酶切鉴定正确的重组表达载体转化入E.coli BL21,IPTG诱导融合蛋白的表达,SDS-PAGE结果显示兔IFRG基因在大肠杆菌中得到了良好的表达。     

日本血吸虫SjRAD23基因的克隆表达及基因重组抗原的免疫保护效果

辐射敏感蛋白23具有核苷酸切除修复功能,在泛素蛋白酶体途径中起到重要作用。本研究利用PCR技术克隆了日本血吸虫辐射敏感蛋白23(Sj RAD23)编码的c DNA序列,成功获得Sj RAD23的基因序列,其ORF为1 053 bp。构建Sj RAD23基因重组表达质粒p ET28a(+)-Sj RAD23,并在大肠杆菌BL21中成功诱导表达,重组蛋白在上清和沉淀中都有存在。利用免疫组化技术检测该蛋白在虫体的分布情况,该蛋白广泛分布在日本血吸虫虫体被膜。用重组蛋白免疫BALB/c小鼠后,免疫小鼠血清中检测到较高水平的特异性Ig G、Ig G1和Ig G2a。Western blotting分析显示重组蛋白能够被日本血吸虫成虫可溶性抗原免疫小鼠血清所识别。用重组蛋白r Sj RAD23免疫结果与206佐剂对照组比较,r Sj RAD23在BALB/c小鼠中诱导了35.94%减虫率,40.59%肝脏减卵率。结果表明Sj RAD23具有作为疫苗候选分子的潜力。     

用pLNCX2携带人MCPH1基因shRNA重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的建立逆转录病毒介导的MCPH1基因RNA干扰表达体系并观察其在宫颈癌Caski细胞中对MCPH1表达的影响。方法将人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段重组到逆转录病毒质粒pLNCX2中,构建携带人MCPHI基因RNA干扰的逆转录病毒载体pLNCX2-shRNA—MCPH1,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌细胞株Caski细胞,并用G418筛选产生稳定的细胞克隆,用RT—PCR和Western印迹检测细胞中MCPH1mRNA和蛋白表达的变化。结果重组逆转录病毒质粒经测序鉴定正确,逆转录病毒感染Caski细胞后用G418筛选出稳定的细胞克隆,RT—PCR和Western印迹检测人MCPH1mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组。结论携带人MCPHI基因RNA干扰双链DNA片段的逆转录病毒感染Caski细胞后能明显抑制MCPHImRNA和蛋白表达,为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用奠定了基础。     

ESAT6-CFP10融合蛋白基因的克隆及其在耻垢分枝杆菌中的表达

目的:构建能表达ESAT6-CFP10融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌疫苗。方法:以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,克隆cfp10基因,将其插入到pGEM-T-easy载体后与esat6基因连接,构建含有esat6和cfp10融合基因的重组载体pGEM-e6c10。酶切消化pGEM-e6c10重组质粒,将esat6-cfp10基因亚克隆到pDE22分泌表达穿梭载体,以电穿孔方法将重组质粒转化至耻垢分枝杆菌。PCR筛选到的阳性克隆经温度诱导后,SDS-PAGE和Western印迹检测表达蛋白的正确性。结果:可表达出相对分子质量约23000的ESAT6-CFP10融合蛋白。Western印迹证明重组蛋白有较好的免疫原性。结论:获得能表达ESAT6-CFP10融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌,为结核病的预防奠定了一定的基础。     

水稻线粒体延伸因子OsEF-Tu基因的克隆及表达

[目的]克隆水稻线粒体基因Os EF-Tu并进行表达。[方法]RT-PCR分别扩增Os EF-Tu基因c DNA的5’端和3’端序列,重叠PCR克隆Os EF-Tu的c DNA序列。生物信息学分析Os EF-Tu基因,构建水稻线粒体基因Os EF-Tu原核表达载体并转化BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白。[结果]Os EF-Tu蛋白与多个高等植物线粒体延长因子EF-Tu蛋白具有同源性,p GEX-4T1-Os EF-Tu重组子构建成功并表达出带有GST标签的Os EF-Tu融合蛋白。[结论]水稻Os EF-Tu在高等植物中较为保守,原核表达Os EF-Tu融合蛋白在28℃诱导条件下包涵体中表达量高。     

肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段在大肠杆菌中克隆的研究

在大肠杆菌中克隆肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段,为P1蛋白基因片段的扩增、表达及探讨羧基端基因片段功能打基础.采用PCR扩增方法获取P1结构基因.扩增产物用SalI和EcoRI酶切消化,回收1kb大小的DNA片段并与pUC19DNA连接,转入大肠杆菌JM109菌株.用X-gal平板及质粒图谱分析方法筛选重组克隆株,再用限制性核酸内切酶酶切图谱分析鉴定.经PCR扩增MPDNA获得1条5.0kbDNA片段.重组质粒限制性内切酶指纹图谱显示出2条带,1条为pUC19载体DNA带,另1条是1kb的插入片段.实验获得肺炎支原体P1蛋白结构基因及含P1蛋白羧基端DNA片段的重组克隆株.     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.     

Cause of Senescence of Nine Sorts of Flowers

The levels of endogenous phytohormones and respiratory rate in nine sorts of flowers such as Cymbidium faberi Rolfe, Nopalxochia ackermannii Kunth and others were investigated both at full bloom and senescence and meanwhile the effect of exogenous phytohormones on prolonging the blossoms and promoting ethylene production were tested. There is a high content of endogenous ethylene in all the long-lived flowere, about 3–16 folds higer than the short-lived ones. There is a high level of ABA at full blooming flowers of short-lived flowers, in which there is no or only some cytokinins in it, but the ratio of CTK (6BA+zeatin)/ABA is smaller(l.7). The endogenous ABA reached a much higher level at senescence in all nine sorts of flowers, so it is reasonable to consider that it is ABA which plays an important role of regulation in controlling flower's senescence. There is a much higher level of GA3 and zeatin in the long-lived flowers which is not demonstrated in the shortlived ones. The respiratory rate is one of the factors controtling the longevity of flowers, but it does not play a decided role. Application of 6BA and zeatin prolongs distinctly orchid’s longevity, however exogenous IAA through the promotive action on ethylene production, evidently extends the longevity of the flowers of the Nopalxochia ackermannii Kunth.     

真菌类遗传学分析的知识结构教学

本文以认知结构理论为指导,讨论了真菌类遗传分析与高等动植物遗传分析的内在联系,认为利用这种内在联系进行教学可收到好的效果并说明了作者的具体教学过程。 Abstract:In the paper, the relationship between genetic analysis of Fungi and genetic analysis of high animal and plant was discussed.A good results were obtained when we adopted this method in the teaching.     

医疗机构合理用药评价模型的构建研究

目的 针对医疗机构的合理用药水平进行评价研究。方法 根据医疗机构合理用药的具体要求,构建医疗机构合理用药评价指标体系,采用基于模糊群决策的方法和多指标评价分析法构建医疗机构合理用药评价模型。结果 构建了基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型,并通过实例分析证明了评价模型的可行性。结论 建立的基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型能够对医疗机构的合理用药水平进行科学评价,为提高医疗机构合理用药水平奠定基础。     

棉铃虫钙粘蛋白N端多肽多克隆抗体制备及对Bt抗性的初步检测

用重组表达的棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)中肠钙粘蛋白N端多肽片段制备兔多克隆抗体,并利用其对Bt抗性进行鉴定。通过RT-PCR方法对棉铃虫中肠钙粘蛋白N端多肽的基因片段Cad285进行PCR扩增,将其克隆到pET-30a原核表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,得到35ku的重组融和蛋白,融合表达的包涵体经过变性、Ni-NTA柱亲和纯化、复性等方法处理包涵体,获得可溶性纯化蛋白,用纯化后蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA检测其效价高于1∶16000;利用最终获得的多克隆抗体对室内纯合Bt抗/感品系的棉铃虫中肠钙粘蛋白进行Western blot分析,结果显示敏感和抗性品系之间有明显差异,表明其能够应用对Bt抗性进行初步检测。     

龙胆科药用植物化学成分的研究现状

龙胆科植物在我国的分布范围很广,且多数为药用植物,其多数种属的药用植物,至今其化学成分尚未被系统研究。综述了目前龙胆科药用植物的化学成分的研究现状及一般提取方法,对近年来发现的环烯醚萜及裂环烯醚萜类化合物进行了总结,为本科药用植物的更深入研究提供了参考。     

青蒿素生物合成机理研究现状

本文总结了目前有关青蒿素生物合成机理方面的研究,主要包括青蒿素生物合成中生理因子的影响,青蒿素生物合成中间体及前体,青蒿素生物合成细胞定位等。指出了存在的一些问题及今后的研究发展前景。