D-葡萄糖苷酶抑制剂的研究

用高灵敏度的荧光法研究了13种糖类化合物对α或β-D-葡萄糖苷酶的抑制作用．实验结果表明：5-氨基-5-脱氧-D-吡喃葡萄糖-1-磺酸铵盐（1）、5-氨基-5-脱氧-D-吡喃葡萄糖-1-磺酸（2）、5-氨基-5-脱氧-D-葡萄糖-1．亚硫酸加成物（3）等三种氮杂糖对α或β-D-葡萄糖苷酶均呈现竞争性抑制作用．化合物（1）的Kiα＝372μmol／L;Kiβ＝6．38μmol/L．化合物（2）的Kiα＝34．4μmol／L;Kiβ＝6．84μmol／L．化合物（3）的Kiα＝47．2μmol/L;Kiβ＝11．9μmol/L．上述三个化合物对β-D-葡萄糖苷酶的抑制作用都强子α-D-葡萄糖苷酶．尤其对化合物（1）,其Kiα／Kiβ＝58．3,表明其抑制糖苷酶活性有较好的选择性．     

新冠病毒主蛋白酶小分子抑制剂荧光共振能量转移高通量筛选模型的优化与应用北大核心CSCD

基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)原理,以新冠病毒主蛋白酶(main protease, Mpro)为靶标,建立并应用Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型,以期快速筛选新型Mpro小分子抑制剂。利用大肠杆菌原核表达与分离纯化高活性的Mpro,再以FRET法进行比活力测定。基于FRET原理,以7-甲氧基香豆素-4-乙酸(7-methoxycoumarin-4-acetic acid, MCA)与2,4-二硝基苯酚(2,4-dinitropheno, Dnp)标记的多肽作为Mpro水解底物,通过优化反应缓冲液、Mpro反应浓度、反应温度与时间及DMSO耐受浓度,建立并应用Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型进行苗头化合物的筛选。利用大肠杆菌实现了高活性Mpro的原核表达与分离纯化,且比活力不低于40 000 U/mg。通过一系列优化实验,使用0.4μmol/L Mpro与5μmol/L底物建立了Z′因子值为0.79的Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型,且反应体系中含有的二硫苏糖醇(1,4-dithiothreitol,DTT)是影响FRET筛选模型可靠性的重要因素。通过对天然产物化合物库进行高通量筛选,发现白花丹素与银杏酸在体外对Mpro酶活性具有良好的抑制作用。本研究建立了基于FRET原理的Mpro小分子抑制剂高通量筛选模型,初步证实了白花丹素与银杏酸是一类新型苗头化合物,为抗新型冠状病毒药物先导化合物的筛选与发现奠定了基础。     

尖镰孢青霉素V酰化酶的纯化及性质

通过硫酸铵沉淀、硅藻土吸附、DEAD-纤维素离子交换层析和Sephadex G-200凝胶过滤,由尖镰孢(Fusarium oxysporum)FP941培养滤液中得到了聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的青霉素V酰化酶。酶作用最适pH为7.0,最适温度为50℃。酶在pH6.0—8.0和42℃以下稳定。酶作用青霉素V的米氏常数Km为4.65×10~(-3)mol/L;苯氧乙酸是酶的竞争性抑制剂,抑制常数Ki为23.87×10~(-3)mol/L;6-氨基青霉烷酸是酶的非竞争性抑制剂,抑制常数Ki为30.01×10~(-3)mol/L。某些金属离子对酶有抑制作用,Fe~(2+)最强,其次是Hg~(2+)和Cu~(2+)。用SDS凝胶电泳测定酶亚基分子量为77600;用分子筛测定自然酶分子量为148000。     

多巴胺类似物抑制二氢蝶啶还原酶的研究

多巴胺类似物对二氢蝶啶还原酶有明显的非竞争性抑制作用(Ki或I_(50)值为10~(-5)—10~(-6)mol/L)。其中阿朴吗啡是最强的抑制剂之一(Ki或I~(50)=1-2×10~(-6)mol/L)。由于酪氨酸羟化酶和二氢蝶啶还原酶包含于同一酶促反应过程中,且限制了多巴胺合成的决定速度的那一步。这些结果可能提示出被多巴胺抑制的酪氨酸羟化作用包含着对这二种酶的抑制作用。     

靶向IRE1/XBP1信号通路的细胞水平高通量筛选模型建立

目的:建立基于细胞水平的inositol-requiring 1/X-box-binding protein 1 (IRE1/XBP1)信号通路高通量筛选模型,用于发现新型IRE1/XBP1信号通路抑制剂。方法:构建pCAX-F-XBP1△DBD-luciferase质粒,并与pcDNA3.1质粒共转人胚肾细胞HEK293,G418抗性筛选获得多个稳定表达荧光素酶的单克隆。结果:首先利用内质网应激诱导剂衣霉素(tunicamycin,TM)考察单克隆对内质网应激反应的敏感性,确定6#单克隆用于后续研究;其次对细胞接种量、溶剂DMSO终浓度和TM的作用浓度与孵育时间等条件进行优化,最终确定高通量筛选模型条件, Z'因子达到0.62;最后对包含多个激酶抑制剂在内的449个化合物进行筛选,发现27个潜在的IRE1/XBP1抑制剂,其中MG132、Sunitinib和Staurosporine的IC50分别为6.61(±1.51)μmol/L、6.25(±0.36)μmol/L和48(±8)nmol/L。结论:成功建立有效靶向IRE1/XBP1信号通路的高通量药物筛选模型,为基于IRE1/XBP1信号通路为靶点的药物发现奠定坚实基础。     

青霉属真菌Penicillium sp. CPCC 400786的抗病毒活性成分

采用抗艾滋病毒抑制剂筛选模型对一株青霉属真菌Penicillium sp. CPCC 400786发酵产物的乙酸乙酯提取物进行活性评价,结果显示,其对艾滋病毒有较强的抑制活性。采用正相硅胶柱、Sephadex LH-20凝胶柱和半制备HPLC等色谱技术对乙酸乙酯提取物进行分离纯化,从中分离得到8个化合物。通过波谱数据分析,分别鉴定为：oxalicine A（1）、oxalicine B（2）、cis-4,6-dihydroxymellein（3）、亚油酸（4）、十八烯酸（5）、肉豆蔻酸（6）、尿嘧啶（7）、胸腺嘧啶（8）。化合物1和2为杂萜类化合物。对化合物1-6进行了抗艾滋病毒（HIV-1）和抗甲型流感病毒（H1N1）的活性评价。结果显示,化合物1具有良好的抗H1N1活性,其IC₅₀值为38.5μmol/L,比阳性对照药利巴韦林稍弱（IC₅₀=20.5μmol/L）;化合物1和2具有抗HIV-1的活性,其IC₅₀值分别为22.4、67.8μmol/L;其他化合物未显示抗病毒活性。本研究为从青霉属中发现更多抗病毒活性杂萜分子提供了依据。     

Potato I型蛋白酶抑制剂 rBTI及其突变体的表达、纯化和活性研究

荞麦胰蛋白酶抑制剂(BTI)属于丝氨酸蛋白酶抑制剂Potato I家族,典型构象中有1段暴露在分子外侧的结合区,该区内P1′、P2、P6′与P8′位的氨基酸残基具有高度保守性.本文依据近期解析的rBTI晶体结构以及rBTI与胰蛋白酶复合物晶体结构信息,对rBTI 中的P2和P8′位氨基酸进行突变,构建了pExSecI- Bti-P44T 和 pExSecI-Bti-W53R 重组质粒,转入大肠杆菌 BL21（DE3）中进行表达,通过Resource Q阴离子交换层析和Superdex G 75 HR 10/300凝胶柱进行分离纯化后,测定了rBTI及其突变体对胰蛋白酶的抑制常数,以及它们对HepG2 细胞内的蛋白酶体和细胞增殖的抑制作用. 实验结果显示,rBTI 的44和53位分别突变为 Thr和Arg后,Ki 分别为2.91×10-9mol/L和2.97 ×10-7mol /L,前者较rBTI（Ki = 3.56×10-8 mol/L）降低1个数量级,而后者较rBTI升高1个数量 级.功能分析显示,rBTI及2种突变体对HepG2细胞内的蛋白酶体基本没有抑制作 用,但是它们都保留了对HepG2细胞增殖的抑制活性.这些结果揭示,作为一种特异的胰蛋白酶抑制剂,rBTI分子中的保守区域氨基酸残基虽然对胰蛋白酶的抑制作用有显著影响,但并不影响其抑制肿瘤细胞的增殖,仍能发挥其原有的生物学功能.     

铜铁试剂对菜青虫多酚氧化酶的抑制作用

以菜青虫Pieris rapae (L.)为试材,冰浴匀浆,4℃下6 403 ×g 离心,取上清液,经35%饱和度(NH₄)₂SO₄沉淀,Sephadex G100凝胶过滤柱层析等分离步骤,获得部分纯化的菜青虫多酚氧化酶制剂。研究不同浓度铜离子及铜铁试剂对该酶的影响,结果表明：Cu₂₊在0～0.100 mmol/L范围内对酶活力表现激活作用;浓度大于0.125 mmol/L时表现抑制作用,其IC₅₀为0.651±0.022 mmol/L;铜铁试剂对该酶抑制作用的IC₅₀为0.100±0.012 mmol/L。抑制动力学研究结果表明：铜铁试剂对该酶表现为可逆抑制效应,为竞争性抑制类型,其抑制常数K_i为0.076±0.013 mmol/L。     

Tyrphostin AG213对重组人蛋白激酶CK2全酶的抑制动力学

利用基因工程克隆、表达和纯化获得重组人蛋白激酶CK2α和 β亚基 ,在体外等摩尔数混合构成有最大生物活性的重组人CK2全酶 .以重组人CK2全酶为分子靶点 ,研究tyrphostinAG2 13对该全酶的直接作用及其抑制动力学 .通过测定转移到CK2底物上的 [γ 3 2 P]GTP的 [3 2 P]放射活度 ,检测CK2活性 .结果表明 :重组人CK2是一种Ca2 + 、cAMP和cGMP等第二信使非依赖性蛋白激酶 ,与天然CK2的性质一致 .AG2 13对重组人CK2全酶具有很强的抑制作用 ,IC50 为 1 1μmol L ,抑制作用远大于已知CK2的抑制剂 5 ,6 二氯 1 β 呋喃糖苯并咪唑 (DRB)和N (2 氨乙基 ) 5 氯萘 1 硫胺 (A3) .AG2 13对重组人CK2全酶的动力学研究表明 :它与GTP呈现非竞争 竞争性混合型抑制作用 ,抑制常数Ki 和Ki′值分别为 0 6 μmol L与 1 4 μmol L ;与酪蛋白呈非竞争性抑制作用 ,Ki 值为 0 9μmol L .结果说明 ,tyrphostinAG2 13不仅是酪氨酸蛋白激酶的抑制剂 ,而且是一种十分有效的蛋白激酶CK2的抑制剂 .重组人蛋白激酶CK2可作为一种较为简便筛选和开发有效的CK2抑制剂的分子靶点 .     

墨西哥落羽杉中三个活性双黄酮研究

从墨西哥落羽杉 (Taxodiummucronatum)枝叶中分离得到 3个化合物 ,通过MS、1DNMR、 2DNMR以及与参考文献比较的方法鉴定它们分别为 3个已知双黄酮 ,即 :a mentoflavone (1) ,podocarpusflavoneA (2 ) ,4′ ,7 dimethylamentoflavone (3)。本文还对文献中amentoflavone的C - 2 和C - 6 的碳谱数据归属进行了修正。体外生物活性筛选结果表明 ,这 3个双黄酮均为组织蛋白酶B的抑制剂 ,其IC50 值分别为 1 75、 1 6 8和 0 5 5 μmol/L ;这 3个双黄酮均显示一定的细胞毒活性 ,其中化合物 1对肿瘤细胞株BGC 82 3的IC50 值为 3 5 1μmol/L ,化合物 2对肿瘤细胞株HT 2 9的IC50 值为 11 16 μmol/L ,化合物 3对肿瘤细胞株A5 49、BEL 74 0 2、DU14 5、HT 2 9的IC50 值分别为 7 74、 17 16、 12 4 2、 14 5 4μmol/L。其中双黄酮为组织蛋白酶B的新型天然抑制剂     

Activation and maturation of SARS-CoV main protease

The worldwide outbreak of the severe acute respiratory syndrome (SARS) in 2003 was due to the transmission of SARS coronavirus (SARS-CoV). The main protease (M^pro) of SARS-CoV is essential for the viral life cycle, and is considered to be an attractive target of anti-SARS drug development. As a key enzyme for proteolytic processing of viral polyproteins to produce functional non-structure proteins, M^pro is first auto-cleaved out of polyproteins. The monomeric form of M^pro is enzymatically inactive, and it is activated through homo-dimerization which is strongly affected by extra residues to both ends of the mature enzyme. This review provides a summary of the related literatures on the study of the quaternary structure, activation, and self-maturation of M^pro over the past years.     

Liberation of SARS-CoV main protease from the viral polyprotein: N-terminal autocleavage does not depend on the mature dimerization mode

The main protease (M^pro) plays a vital role in proteolytic processing of the polyproteins in the replicative cycle of SARS coronavirus (SARS-CoV). Dimerization of this enzyme has been shown to be indispensable for trans-cleavage activity. However, the auto-processing mechanism of M^pro, i.e. its own release from the polyproteins through autocleavage, remains unclear. This study elucidates the relationship between the N-terminal autocleavage activity and the dimerization of “immature” M^pro. Three residues (Arg4, Glu290, and Arg298), which contribute to the active dimer conformation of mature M^pro, are selected for mutational analyses. Surprisingly, all three mutants still perform N-terminal autocleavage, while the dimerization of mature protease and trans-cleavage activity following auto-processing are completely inhibited by the E290R and R298E mutations and partially so by the R4E mutation. Furthermore, the mature E290R mutant can resume N-terminal autocleavage activity when mixed with the “immature” C145A/E290R double mutant whereas its trans-cleavage activity remains absent. Therefore, the N-terminal auto-processing of M^pro appears to require only two “immature” monomers approaching one another to form an “intermediate” dimer structure and does not strictly depend on the active dimer conformation existing in mature protease. In conclusion, an auto-release model of M^pro from the polyproteins is proposed, which will help understand the auto-processing mechanism and the difference between the autocleavage and trans-cleavage proteolytic activities of SARS-CoV M^pro.     

Three-dimensional domain swapping as a mechanism to lock the active conformation in a super-active octamer of SARS-CoV main protease

Proteolytic processing of viral polyproteins is indispensible for the lifecycle of coronaviruses. The main protease (M^pro) of SARS-CoV is an attractive target for anti-SARS drug development as it is essential for the polyprotein processing. M^pro is initially produced as part of viral polyproteins and it is matured by autocleavage. Here, we report that, with the addition of an N-terminal extension peptide, M^pro can form a domain-swapped dimer. After complete removal of the extension peptide from the dimer, the mature M^pro self-assembles into a novel super-active octamer (AO-M^pro). The crystal structure of AO-M^pro adopts a novel fold with four domain-swapped dimers packing into four active units with nearly identical conformation to that of the previously reported M^pro active dimer, and 3D domain swapping serves as a mechanism to lock the active conformation due to entanglement of polypeptide chains. Compared with the previously well characterized form of M^pro, in equilibrium between inactive monomer and active dimer, the stable AO-M^pro exhibits much higher proteolytic activity at low concentration. As all eight active sites are bound with inhibitors, the polyvalent nature of the interaction between AO-M^pro and its polyprotein substrates with multiple cleavage sites, would make AO-M^pro functionally much more superior than the M^pro active dimer for polyprotein processing. Thus, during the initial period of SARS-CoV infection, this novel active form AO-M^pro should play a major role in cleaving polyproteins as the protein level is extremely low. The discovery of AO-M^pro provides new insights about the functional mechanism of M^pro and its maturation process.     

Screening of electrophilic compounds yields an aziridinyl peptide as new active-site directed SARS-CoV main protease inhibitor

The coronavirus main protease, M^pro, is considered a major target for drugs suitable to combat coronavirus infections including the severe acute respiratory syndrome (SARS). In this study, comprehensive HPLC- and FRET-substrate-based screenings of various electrophilic compounds were performed to identify potential M^pro inhibitors. The data revealed that the coronaviral main protease is inhibited by aziridine- and oxirane-2-carboxylates. Among the trans-configured aziridine-2,3-dicarboxylates the Gly-Gly-containing peptide 2c was found to be the most potent inhibitor.     

Eglin C与2709碱性蛋白酶相互作用分析及亲和纯化方法

Eglin C是来自水蛭中的一种小型热稳定蛋白质,属于马铃薯胰凝乳蛋白酶抑制剂家族,可以抑制弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、组织蛋白酶、α-lytic蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶等.然而,利用eglin C纯化蛋白酶,尚未见研究报道.本文将化学合成的编码eglin C及其突变体的基因序列,克隆到原核表达载体pQE30,在大肠杆菌...     

Inhibition of antennal esterases of the egyptian armyworm Spodoptera littoralis by trifluoromethyl ketones

A series of aliphatic and aromatic trifluoromethyl ketones has been tested as inhibitors of the antennal esterases of the Egyptian armyworm Spodoptera littoralis, by evaluation of the extent of hydrolysis of [1-³H]-(Z,E)-9, 11-tetradecadienyl acetate (1), a tritiated analog of the major component of the sex pheromone. The most active compounds with a long chain aliphatic structure were 3-octylthio-1,1,1-trifluoropropan-2-one (2) (IC₅₀ 0.55 μM) and 1,1,1-trifluorotetradecan-2-one (4) (IC₅₀ 1.16 μM). The aromatic compounds were generally less potent inhbitors than the coressponding aromatic ones, although β-naphthyltrifuloromethyl ketone (10) exhibited a remarkable inhibitory activity (IC₅₀ 7.9 μM). Compounds 2, 4 and 10 exhibit a competitive inhibition with K_i values of 2.51×10⁻⁵ M, 2.98×10⁻⁵ M and 2.49×10⁻⁴ M, respectively. Some of the trifluoromethyl ketones tested were slow-binding inhibitors and compounds 2 and 10 are described as inhibitors of the antennal esterases of a moth for the first time.     

斑节对虾杆状病毒包涵体研究

利用显微图像分析技术,对斑节对虾肝胰腺正常细胞胞核和斑节对虾杆状病毒(MBV)感染细胞胞核横切面的直径、周长和面积进行了测量分析.结果表明:正常细胞胞核的直径为3.47±0.30μm、周长为13.03±1.36μm、面积为10.87±1.78μm²;MBV感染细胞胞核的直径为3.81±0.79μm、周长为14.00±2.87μm、面积为13.52±5.37μm²;两者的直径、周长和面积均存在极显著的差异(P<0.01).对3种类型的包涵体进行了测量,其中1类包涵体最大,2类包涵体次之,3类包涵体最小,并以1类包涵体占大多数.     

临泽绿洲边缘区棉花群体光合速率、蒸腾速率及水分利用效率

在甘肃河西走廊中部黑河中游绿洲边缘区,于6月下旬和8月上旬,利用Li-8100土壤碳通量测定系统与改进的同化箱联合对田间条件下早熟陆地棉(Gossypium hirsutum)品种新陆早8号的群体光合特性进行了研究.结果表明：试验地6月下旬的土壤呼吸速率和土壤蒸发速率显著高于8月上旬（P＜0.01）;棉花群体光合速率日变化均呈“单峰型”,6月下旬的群体光合速率显著高于8月上旬,其日平均值分别为（43.11±1.26）和（24.53±0.60）μmol CO₂·m^-2·s^-1, 差异极显著（P＜0.01）;群体蒸腾速率日变化也呈“单峰型”,6月下旬和8月上旬的日平均值分别为（3.10±0.34）和（1.60±0.26）mmol H₂O·m^-2·s^-1,两者存在极显著差异（P＜0.01）;6月下旬和8月上旬的群体水分利用效率日平均值分别为（15.67±1.77）和（23.08±5.54） mmol CO₂·mol^-1 H₂O,但差异不显著（P＞0.05）.两生育时期棉花群体光合速率与温度、光合有效辐射及土壤含水量均呈正相关关系.表明棉花群体光合速率在6月下旬和8月上旬均没有出现中午光合下调,8月由于土壤水分降低和植物叶片衰老,棉花群体光合速率和蒸腾速率显著降低,但水分利用效率并无显著下降.     

温度光照pH对雨生血球藻CG-11绿色营养细胞生长的影响

采用BBM培养基,以雨生血球藻Haematococcus pluvialis CG-11为研究材料,进行环境因子对雨生血球藻绿色营养细胞生长影响的实验。温度梯度为16℃、20℃、24℃、28℃;光照梯度为30μmoL photons m^-2·s^-1、60μmoL photons m^-2·s^-1、90μmoL photons m^-2·s^-1、120μmoL photons m^-2·s^-1。初始pH值为6.0、7.0、8.0、9.0,进行单因子试验,测定各组的藻密度及色素含量。结果显示,雨生血球藻H.pluvialis CG-11生长的最适温度范围20～24℃,光照90μmol photons m^-2·s^-1,初始pH8.0。     

龙须菜海藻场构建及其对水环境因子的影响

2010年2月～2010年5月,在汕头南澳岛海域,通过设计不同的主绳间距和苗绳间距研究了龙须菜(Gracilaria lemaneifomis)海藻场的构建模式及其对养殖附近海域环境的影响。结果表明,在不同的筏式养殖密度中,主绳间距在0.3～0.4m,苗绳间距在0.1～0.2m之间,龙须菜的生长速率较高。龙须菜海藻场构建后,养殖海域的无机氮(IN)平均值为133.40±15.18μg·L^-1,对照海域的无机氮平均值为153.81±11.97μg·L^-1,养殖海域显著低于对照海域(p<0.05);养殖海域的无机磷(IP)平均值为13.16±1.38μg·L^-1,对照海域的平均值为15.55±1.05μg·L^-1,养殖海域的显著低于对照海域的(p<0.05)。养殖海域叶绿素(Chl-a)的平均值为1.86±0.23mg·m^-3,对照海域的平均值为2.44±0.30mg·m^-3,养殖海域显著低于对照海域(p<0.05);养殖海域的透明度平均值为1.76±0.09m,对照海域的透明度为1.41±0.15m,养殖海域显著高于对照海域(p<0.05):养殖海域的溶解氧(DO)平均值为9.55±0.46mg·L^-1,对照海域的平均值为8.90±0.37mg·L^-1,养殖海域显著高于对照海域(p<0.05)。研究表明,构建龙须菜海藻场可以显著增加海水中DO浓度,抑制微藻生长繁殖,吸收水体营养盐,改善水质质量。