条件性定点基因捕获载体的构建

基因捕获是依赖于捕获载体的随机插入产生突变而进行基因功能研究的一类重要技术。由于传统捕获载体在捕获位点上的局限性,各种新型的捕获载体正在不断地被设计并应用于基因捕获技术。以PL-451为基础质粒,结合定点的重组酶识别位点LoxP及Frt序列,突变LoxP的1个碱基的LoxP511A和LoxP511B,SA位点以及不含启动子但有poly(A)的EGFP片断,构建了能够在捕获元件两侧克隆同源臂的条件性基因捕获载体,从而为实现可调控性基因捕获奠定基础。     

Tol2转座子介导斑马鱼rps26基因附近增强子捕获及注解分析

随着人类等生物大规模基因组测序工作的完成,认识和理解基因组上表达调控元件成为后基因组时代的重要研究任务,增强子捕获技术是一种鉴定基因组上增强子元件及其对基因表达调控机制的有效方法。本研究选择Tol2转座子系统介导制备的稳定增强子捕获品系TK4系(头部和躯干特异性GFP表达),利用Splinkerette PCR(sp-PCR)、原位杂交和比较基因组学等技术手段进行所捕获增强子的解析研究。将TK4系的F1代与野生型斑马鱼杂交,收集受精卵,于6 hpf(Hour post fertilization)、24 hpf、48 hpf、3 dpf(Day post fertilization)、4 dpf、5 dpf六个发育阶段通过荧光显微镜检测绿色荧光蛋白报告基因的表达模式;然后通过sp-PCR方法克隆到Tol2转座子插入位点斑马鱼基因组侧翼序列,经比对分析表明插入位点位于基因组23号染色体27749253位置,在rps26基因的intron1中,且报告基因插入方向与基因方向相反。在插入位点100 kb的基因组范围内有7个基因,分别为arf3a、wnt10b、wnt1、rps26、IKZF4、dnajc22和lmbr1l。通过VISTA程序对不同脊椎动物基因组同源序列比对结果显示,在rps26基因下游有2个潜在保守的非编码序列区CNS1(Conserved non-coding sequence)和CNS2,为可能的增强子元件。胚胎原位杂交表明:rps26基因的两个转录本有母源性表达,rps26-201在合子中的表达早于rps26-001,而TK4系斑马鱼的GFP在早期(6 hpf)不表达,后期rps26与GFP的表达模式既存在相似性,也存在差异性,提示两者可能既接受共同的增强子调控,但也存在不同增强子调控,所获得的2个潜在的增强子(CNS1和CNS2)可能对附近的基因(包括rps26)发挥差异的时空表达调控作用。本研究首次成功获得rps26基因附近2个潜在增强子,为深入研究这两个增强子对基因组附近基因的表达调控机制奠定基础,本研究所采用的结合技术手段也为增强子解析提供参考。     

SB转座子介导的斑马鱼增强子捕获注解分析

为了建立斑马鱼增强子捕获突变体库及研究功能基因的表达调控模式,制备了SB转座子介导的增强子捕获转基因斑马鱼(F0),通过繁育建立了组织或器官特异表达报告基因绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的品系(F1)。选择F1代的SK-3系(脑部特异表达GFP)与野生型TU系斑马鱼交配,收集受精卵(F2),于24 hpf(Hour post fertilization)、2 dpf(Day post fertilization)、3 dpf、4 dpf、5 dpf、7 dpf 6个发育阶段检测报告基因绿色荧光蛋白的表达模式;然后通过Splinkerette PCR(SP-PCR)方法检测SB转座子在斑马鱼基因组中的插入位置,从而确定捕获的增强子和功能基因;最后通过胚胎原位杂交验证内源基因表达模式。结果表明,在F2代胚胎不同发育阶段,GFP表达具有明显的时空特性,前期在前脑,中脑,后脑三个部位均高水平表达,后期表达部位呈后移趋势,各个发育期表达强度基本无变化,结果提示该捕获增强子具有脑部表达特性。sp-PCR结果分析表明增强子位于基因组1号染色体35、914、498-35、914、621位置,在内源性基因ednraa位点附近。原位杂交结果表明该基因在胚胎24 hpf阶段具有转录活性。本研究结果提示SB转座子介导的增强子捕获技术可高效获得插入突变斑马鱼,对研究基因功能和获得具有自主知识产权的新基因具有重要作用。     

piggyBac转座子及其在转基因昆虫中的应用

piggyBac是一种从粉纹夜蛾Trichoplusiani.中分离到的、具有TTAA插入位点特异性的DNA转座子。piggyBac可在昆虫基因组中准确切离,转化频率较高,并且不受宿主因子的限制,是目前转基因昆虫研究中应用最广的转座子载体。近年来的研究发现,piggyBac类转座子广泛分布于昆虫和其他生物基因组中。文章从piggyBac的结构、转座特性、在转基因昆虫中的应用以及piggyBac类转座子的分布等几个方面综述了piggyBac的研究进展。     

一种包含转座子Sleeping Beauty和PiggyBac的新型多功能载体的构建

DNA转座子作为一种遗传学工具对脊椎动物的转基因、突变体产生、癌基因发现和基因治疗方面都有巨大的贡献. 目前,哺乳动物中应用最为广泛、活性最高的DNA转座子为重构于鲑鱼的Sleeping Beauty (SB)转座子和来源于甘蓝蠖度尺蛾 (cabbage looper moth Trichoplusia ni)的PiggyBac (PB)转座子. 本研究中,我们成功构建了包含PB和SB两种转座子的杂合转座载体,命名为PBSBD. 在杂合转座载体中融入了基因捕获框及loxp/Frt元件,用以实现转座过程中的基因捕获和条件性敲除. 在HepG2细胞中通过检测报告基因的表达情况及阳性克隆的定位,对构建的杂合转座载体PBSBD进行了活性的初步验证. 结果表明,PBSBD能够有效被2种转座酶识别,并能检测到报告基因的表达. 本研究所构建的杂合转座载体PBSBD结合2种转座酶,可以应用于大规模筛选突变基因和研究基因功能. 并且该杂合转座载体还可以利用SB转座酶的邻近转座特性,结合载体内所包含的loxp/Frt元件用以邻近区域DNA片段的条件性敲除,研究大片段DNA在生物体中的作用.     

piggyBac转座子在牛基因组的整合位点及特征分析

piggyBac(PB)转座子作为一种遗传工具被广泛应用于多个物种的转基因及插入突变研究, 目前PB转座子在牛中的相关研究还较少。为了获得PB转座子在牛基因组中的整合位点, 总结其转座特征, 文章构建了PB[CMV-EGFP]和pcDNA-PBase二元转座系统, 利用细胞核电转技术共转染牛耳组织成纤维细胞, 经G-418筛选, 获得了稳定转染EGFP的转基因细胞系; 提取细胞基因组DNA, 利用基因组步移技术扩增PB转座子5′ Bac区插入位置的DNA序列; 通过与牛基因组序列进行BLAST比对, 得到PB转座子在牛基因组中的插入位点。文章共获得了8个有效的整合位点, 但仅有5个位点定位到染色体1、2、11和X染色体上。序列分析表明：在牛基因组中, PB转座子可特异性的插入到“TTAA”位置, 并整合到基因间的非调控区; 分析整合位点“TTAA”相邻一侧的5个碱基组成, 发现PB转座子5′端倾向于插入到GC(62.5%)碱基富集区。该研究表明, PB转座子可以在牛基因组中发生转座, 获得的整合位点信息为利用PB转座子在牛上开展遗传学研究提供了理论参考。     

动物转基因高效表达策略研究进展

外源基因在动物体内、细胞内表达时,常由于各种原因导致基因沉默。目前,主要有两种策略用于打破该瓶颈:一是利用友好位点;二是优化外源基因顺式作用元件。利用友好位点就是通过定点整合技术将外源基因插入至活性转录区域;优化外源基因顺式作用元件即采用合适的启动子、增强子、内含子、染色质开放元件、核基质附着区等元件,构建出高效表达载体。对相关策略进行概述,为动物基因工程育种提供参考。     

转座子Sleeping Beauty和PiggyBac

近10年来,得益于转座子Sleeping Beauty(SB)和PiggyBac(PB)的发现和完善,转座子作为一种遗传工程工具在脊椎动物的基因遗传研究中得到广泛应用.SB和PB宿主范围极其广泛,从单细胞生物到哺乳动物都能够发挥作用.转座过程需要转座序列和转座酶的存在,类似于"剪切"、"粘贴"的方式.转座子载体系统转座时可携带一段外源DNA序列,利用这一特性可以用于实现目的基因的转移,现已广泛用于转基因动物、基因功能研究、基因治疗等领域.当转座系统与基因捕获技术相结合,不仅可研究插入突变基因的功能,还能通过所携带的报告基因获得捕获基因的表达图谱.作为非病毒载体的SB和PB转座系统,由于具有高容量、高效率和高安全性等优势,并且PB在转座后不留任何足迹,不会造成遗传物质的不可预测改变,在动物基因工程以及基因治疗方面具有诱人的前景.     

水稻基因组上一个Ds切离及其双位点插入行为的分子鉴定

玉米转座元件Ac/Ds是hAT转座子家族的成员, 导入水稻基因组后具有转座活性, 尽管转座机制还不完全清楚, 但它们通常经保守的非复制型“剪切-粘贴”过程转座。研究表明, 在Ac编码的转座酶作用下, Ds从原位点切离后常优先重新插入到连锁位点。文章利用TAIL-PCR技术从水稻一个Ds插入突变体及其回复突变体中分离Ds侧翼序列, 结合生物信息学分析方法, 对Ds在突变体上插入位点、回复突变体内切离足迹和重新插入位点进行了分子鉴定。结果显示, 突变体中Ds从3号染色体切离后, 在原插入位点残留了8 bp足迹序列(CATCATGA), 引起Ds标记基因外显子和内含子数目增加, 从而影响基因结构。切离后的Ds重新插入回复突变体第2和第6号染色体上, 分别编码烟草胺氨基转移酶和衰老相关蛋白的2个基因的编码区。因此, 典型的“剪切-粘贴”机制不能完全解释Ds的转座行为, Ds转座存在“剪切-复制-粘贴”的特点。     

根瘤菌共生固氮的遗传学研究(二)

2.在根瘤菌研究中成功地运用了转座子诱变技术。转座子(Transposon)是一种特殊的DNA短片段,它带有抗药性基因,并具有在DNA复制子之间转座插入的能力,转座的发生并不需要recA基因产物,一些转座子象Tn 5的转座插入位点的分布是相当随机的,但另一些象Tn 10,它的转座插入似乎具有“热点”(Hot spot),转座子插入到一个新位点时,被插入位点原基因的连续性受到阻断,因而该基因的功     

T—DNA介导的基因诱捕技术及其在植物功能基因组学研究中的应用

T-DNA介导的基因诱捕技术是近年来发展起来的鉴定和分离基因的方法。在拟南芥和水稻基因组测序已经完成的今天,该技术将在两者基因功能的研究中扮演举足轻重的角色。本文就T—DNA介导的基因诱捕系统、基因克隆和突变体库构建的研究进展及其在植物功能基因组学上的应用等内容进行了综述,并讨论了该技术应用中的一些问题。     

A review of current large‐scale mouse knockout efforts

After the successful completion of the human genome project (HGP), biological research in the postgenome era urgently needs an efficient approach for functional analysis of genes. Utilization of knockout mouse models has been powerful for elucidating the function of genes as well as finding new therapeutic interventions for human diseases. Gene trapping and gene targeting are two independent techniques for making knockout mice from embryonic stem (ES) cells. Gene trapping is high‐throughput, random, and sequence‐tagged while gene targeting enables the knockout of specific genes. It has been about 20 years since the first gene targeting and gene trapping mice were generated. In recent years, new tools have emerged for both gene targeting and gene trapping, and organizations have been formed to knock out genes in the mouse genome using either of the two methods. The knockout mouse project (KOMP) and the international gene trap consortium (IGTC) were initiated to create convenient resources for scientific research worldwide and knock out all the mouse genes. Organizers of KOMP regard it as important as the HGP. Gene targeting methods have changed from conventional gene targeting to high‐throughput conditional gene targeting. The combined advantages of trapping and targeting elements are improving the gene trapping spectrum and gene targeting efficiency. As a newly‐developed insertional mutation system, transposons have some advantages over retrovirus in trapping genes. Emergence of the international knockout mouse consortium (IKMP) is the beginning of a global collaboration to systematically knock out all the genes in the mouse genome for functional genomic research. genesis 48:73–85, 2010. © 2010 Wiley‐Liss, Inc.     

Tc1/Mariner转座子超家族的研究进展

随着高通量测序技术的迅猛发展,越来越多的生物基因组注释结果表明：转座子几乎存在于所有生物的基因组中,是大多数生物基因组的重要组分。其中,Tc1/Mariner转座子是自然界中分布最广泛的一类DNA转座子超家族,在自然界已经发现14个有活性的Tc1/Mariner转座子(如Minos,Mos1等),另外通过分子重构也获得高活性的人工转座子,如睡美人转座子(Sleeping Beauty, SB)。SB和Mos1等转座子作为基因转移载体已被广泛应用于转基因、基因捕获和基因治疗等领域的研究中,并取得了很好的应用效果。本文将重点综述Tc1/Mariner转座子的结构、分类、分布、转座机制、活性转座子的挖掘,及其在转基因、基因捕获和基因治疗等研究领域的应用。     

嘌呤霉素抗性基因捕获载体的构建及在细胞中的功能验证

目的构建具有嘌呤霉素抗性基因捕获载体,扩大基因捕获载体的应用范围。方法用经改造的捕获载体（gene trapping vector）稳定转染HepG2．2．15肝癌细胞系,经嘌呤霉素筛选,制作单克隆细胞株。用PCR方法验证该载体的在细胞染色体中的整合,ELISA方法证明捕获载体捕获基因后的细胞的功能改变。结果嘌呤霉素抗性基因捕获载体整合在HepG2．2．15肝癌细胞的染色体上,并能影响细胞HBsAg和HBeAg的分泌。结论新构建的嘌呤霉素抗性基因捕获载体能在具有G418抗性的细胞中捕获有意义的目的基因。     

基因治疗载体及其基因转移技术的关键问题与研究现状

目前使用的基因治疗载体及其基因转移技术中还没有一种能用于临床并永久有效的基因转移技术 .该文分析了直接体内转移、间接体内转移及其非载体法、病毒载体法、非病毒性生物载体法等基因治疗转移技术存在的一些关键问题 ,并探讨了各问题的解决办法或研究策略以及基因治疗载体研究的发展方向     

基因治疗研究进展

基因治疗研究的最新成就是非常鼓舞人心的,但是还有许多问题等待解决．首先回顾了近年来有关基因治疗的重要基础研究,包括基因导入技术的研究．后者是基础研究中最重要的课题之一,包括逆转录病毒载体和DNA病毒载体的应用,以及非病毒学方法．其次叙述了实验模型建立的研究．最后着重讨论了遗传病,癌症和其疾病的基因治疗的策略,特别着重在爱滋病和心血管疾病基因治疗的一些策略．     

T-DNA介导的基因诱捕技术及其在植物功能基因组学研究中的应用

T-DNA介导的基因诱捕技术是近年来发展起来的鉴定和分离基因的方法。在拟南芥和水稻基因组测序已经完成的今天, 该技术将在两者基因功能的研究中扮演举足轻重的角色。本文就T-DNA介导的基因诱捕系统、 基因克隆和突变体库构建的研究进展及其在植物功能基因组学上的应用等内容进行了综述, 并讨论了该技术应用中的一些问题。     

基因药物的前沿技术

基因药物的直接体内基因治疗发展迅速,新型基因药物不断产生。本文讨论了效果比较肯定的基因疫苗、反义ＲＮＡ药物、三链ＤＮＡ药物这三种新型基因药物技术的基本方法。分析了它们各自存在的优点和问题,并介绍了它们的应用范围及应用研究进展。