缺失nifH的棕色固氮菌突变种固氮酶钼铁蛋白的结晶

从限氨固氮培养基中培养的缺失nif H的棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii Lipmann)突变种DJ54中,分离纯化出部分纯的缺失FeMoco的钼铁蛋白(△nifH Av1).用相同纯化方法分别从DJ35和UW45突变种中纯化的△nifE Av1和NifB- Av1的纯度明显高于△nifH Av1的纯度.在合适的结晶条件下,可得到这三种蛋白的深棕色短斜四棱柱晶体.△nifH Av1与NifB- Av1一样,晶体形成所需的时间比△nifE Av1的长.而它结晶所需的沉淀剂和缓冲液最适浓度则与△nifE Av1的相同.SDS-PAGE鉴定表明,结晶的△nifH Av1与OP Av1的组成相似.这表明,在△nifH Av1溶液中形成的晶体可能就是该蛋白质的晶体.     

缺失nifH的棕色固氮菌突变种固氮酶钼铁蛋白的结晶

从限氨固氮培养基中培养的缺失nifH的棕色固氮菌(AzotobactervinelandiiLipmann)突变种DJ54中,分离纯化出部分纯的缺失FeMoco的钼铁蛋白(ΔnifHAv1)。用相同纯化方法分别从DJ35和UW45突变种中纯化的ΔnifEAv1和NifB-Av1的纯度明显高于ΔnifHAv1的纯度。在合适的结晶条件下,可得到这三种蛋白的深棕色短斜四棱柱晶体。ΔnifHAv1与NifB-Av1一样,晶体形成所需的时间比ΔnifEAv1的长。而它结晶所需的沉淀剂和缓冲液最适浓度则与ΔnifEAv1的相同。SDS-PAGE鉴定表明,结晶的ΔnifHAv1与OPAv1的组成相似。这表明,在ΔnifHAv1溶液中形成的晶体可能就是该蛋白质的晶体。     

棕色固氮菌缺失nifE的突变种固氮酶钼铁蛋白的结晶

从限氨固氮培养基中培养棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii Lipmann)缺失nifE的突变种DJ35中,分离纯化得到缺失FeMoco的钼铁蛋白(ΔnifE Av1).在一定条件下结晶得到深棕色短斜四棱柱晶体.结晶溶液中各组分的浓度以及结晶方法等对其晶核数目、晶体大小和质量有明显影响.目前用气相扩散的悬滴法所得的最大晶体的二维边长分别为0.12 mm和0.13 mm.     

棕色固氮菌缺失nifE的突变种固氮酶钼铁蛋白的结晶

从限氨固氮培养基中培养棕色固氮菌（Azotobacter vinelandii Lipmann)缺失nifE的突变种DJ35中,分离纯化得到缺失FeMoco的钼铁蛋白（△nifEAvl)。在一定条件下结晶得到深棕色短斜四棱柱晶体。结晶溶液中各组分的浓度以及结晶方法等对其晶核数目,晶体大小和质量有明显影响,目前用气相扩散的悬滴法所得的最大晶体的二维边长分别为0.12mm和0.13mm。     

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白纯净铁钼辅因子的制备和性质

建立了以挥发性酸碱(TFA/NH_4OH)和NH_4OH碱化的NMF从棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白分离提取纯净铁钼辅因子(FeMo—co)的方法。得到了纯净FeMo-co的NMF制剂,从而证明了Tris、ClNa~ 、柠檬酸、HPO_4~(-2)、S_2O_4~(2-)以及氨基酸残基不为FeMo—co的有效分离和结构稳定所必需。制备的纯净FeMo—co的Fe/Mo比为8,比活为230nMC_2H_4/min/MoMn。由于分离制备的FeMo—co制剂除抽提溶剂NMF外不含任何其他成分,所以是进行FeMo—co结晶和结构研究的理想材料。     

缺失nifZ的棕色固氮菌突变种钼铁蛋白的特性和结晶

从棕色固氮菌（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）缺失ｎｉｆＺ突变种中提纯得到的Δｎｉｆ　ＺＭｏＦｅ蛋白达到ＳＤＳ凝胶电泳纯。每个△ｎｆｉ　ＺＭｏＦｅ蛋白分子含１．５个Ｍｏ和１５．９个Ｆｅ原子,它的Ｆｅ和Ｍｏ比值低于野生型固氮菌ＭｏＦｅ蛋白的Ｆｅ和Ｍｏ比值,而它的Ｃ２Ｈ２、Ｈ＋还原活性及其比率（Ｃ２Ｈ４／Ｈ２（Ａｒ））分别为野生型ＭｏＦｅ蛋白的１６．６％、２１．７％和７７．２％。在与野生型ＭｏＦｅ蛋白结晶条件略有不同的情况下,所得的Δｎｉｆ　Ｚ　ＭｏＦｅ蛋白晶体为深棕色的斜四棱柱体晶体。表明ｎｉｆＺ的缺失可能使突变种ＭｏＦｅ蛋白中的Ｐ－ｃｌｕｓｔｅｒ或数目减少或结构发生变化,从而引起该蛋白的结构和功能发生明显改变。     

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白两种聚合体的研究

 棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白八聚体相当于两个钼铁蛋白四聚体的聚合体。在细胞生长过程中,胞内钼铁蛋白两种聚合体的相对含量出现规律性变化:在对数期,细胞固氮酶比活力成上升趋势,而钼铁蛋白主要以高活力的四聚体形式存在;在对数期结束至稳定期,细胞固氮酶比活力下降至一个低水平的稳定值,此时的钼铁蛋白基本上为八聚体形态。在细胞固氮生长时,向培养基中加入过量氨可明显地导致钼铁蛋白由四聚体向八聚体的转化。我们推断,生长过程中胞内钼铁蛋白聚合态的变化可能是调节固氮酶活力的一种方式。胞外,钼铁蛋白的两种聚合态可以相互转化。     

棕色固氮菌缺失nifZ基因的突变种固氮酶MoFe蛋白的纯化和性质

采用 52℃下加热 6 min,后经 DEAE- 52、Sephacryls S- 2 0 0和 Q- Sepharose等柱层析方法 ,分离纯化了棕色固氮菌 (Azotobacter vinelandii)缺失 nif Z基因突变种固氮酶 Mo Fe(Δnif Z Mo Fe)蛋白 ,其纯度达到电泳纯。Δnif Z Mo Fe蛋白的固氮活性为 2 83nmol C2 H2 还原 / (min·mg蛋白 ) ,远低于野生种 Mo Fe蛋白。Δnif Z Mo Fe蛋白对氧更敏感 ;热稳定性略低于野生种。Δnif Z Mo Fe蛋白的可见光吸收光谱与野生种 Mo Fe蛋白极为相似。其圆二色谱和磁圆二色谱在 450～ 550 nm与野生种 Mo Fe蛋白显著不同 ,表明其 P- cluster及其周围环境与野生种 Mo Fe蛋白有所差异。这亦可能是造成缺失 nif Z突变种 Mo Fe蛋白固氮活性低的原因。     

尿素对钼铁蛋白的活性和金属原子簇稳定性的影响

当尿素浓度高于０．５ ｍ ｏＬ／Ｌ时,棕色固氮菌（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）固氮酶钼铁蛋白的乙炔还原活性呈指数下降;而经厌氧缓冲系统稀释并保温后,又可得到明显恢复。尿素对邻菲口罗啉从还原的或部分缺失Ｐ－ｃｌｕｓｔｅｒ 的ＭｏＦｅ 蛋白中螯合金属原子簇的Ｆｅ 原子均有较大的促进作用。还原ＭｏＦｅ 蛋白在尿素梯度凝胶电泳中的迁移率：在０～１．５ ｍ ｏｌ／Ｌ内,无明显变化;在１．５～５．０ ｍ ｏｌ／Ｌ内,线性变小;在５．０～８．０ ｍ ｏｌ／Ｌ内,则呈平缓状态。结果表明：（１）尿素对不同状态的ＭｏＦｅ 蛋白金属原子簇的影响程度不尽相同,而对蛋白质的变构作用是尿素影响ＭｏＦｅ 蛋白的活性和金属原子簇稳定性的主要原因;（２）ＭｏＦｅ 蛋白的构象与金属原子簇密切相关;（３）ＭｏＦｅ 蛋白在变性过程中,活性下降可能先于分子整体构象的变化     

钼,铁,硫化合物激活曝氧的棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白的研究

曝氧后,棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)固氮酶钼铁蛋白的催化活性和圆二色信号都显著降低,而吸收光谱则显著增加。与钼、铁、硫化合物和二硫苏糖醇组成的重组溶液保温后,曝氢蛋白的圆二色信号和吸收光谱几乎完全恢复至天然状态的同时,乙炔还原活性也得到了显著的恢复,表明重组溶液可使曝氧蛋白中的 P-cluster和其它活性部位都得到了不同程度的修复。     

蓝藻固氮酶钼铁蛋白的研究

改进了蓝藻固氮酶的分离、提纯方法。首次用小型厌氧聚丙烯酰胺凝胶制备电泳法,代替常用的层析法,获取了电泳纯的蓝藻固氮酶钼铁蛋白,简化了程序,缩短了实验周期。SDS凝胶电泳和分子筛凝胶过滤测定分子量结果表明,钼铁蛋白分子量为360,000,由4个分子量为90,000的同一类型亚单位构成。每个钼铁蛋白分子含1个钼,18个铁和3290个氨基酸残基。其中酸性氨基酸占优势。研究了柱孢鱼腥藻(Anabaena cylindrica)固氮酶粗提物和钼铁蛋白的某些特性,其结果是:米氏常数为3.33×10~(-3)大气压乙炔,等电点为5—5.5。紫外、可见光谱与其它固氮生物的类似。盐对蓝藻固氮酶较之对其它固氮生物的固氮酶有更大的抑制作用。     

部分氧化的铁钼蛋白的圆二色散谱和电子顺磁共振谱的研究

棕色固氮菌固氮酶FeMo蛋白与过量（5－6个当量）的酸性靛蓝保温30－60分钟后,蛋白中的P－金属原子族全部氧化,然而蛋白中的FeMoCo全都处于还原状态。Na2S2O4使这种部分氧化的FeMo蛋白中的P-ciuster重新不,甲基紫精可加快这种还原,而亚甲蓝等氧化剂则使这种蛋白中的FeMoCo受到氧化,对这种部分氧化的FeMo蛋白分别进行CD还原滴定和测定氧化过程中的EPR／ABS的变化已经得到p-Cluster和FeMoCo的氧化还原当量数目。     

棕色固氮菌钼铁蛋白的金属原子簇与其构象的关系

棕色固氮菌（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）固氮酶钼铁蛋白的紫外ＣＤ谱在２０５—２３５ ｎｍ 出现由峰位分别为２０８ 和２２２ ｎｍ 的双负峰组成的负槽;经邻菲口罗啉在厌氧或有氧环境中处理后,在２２２ ｎｍ 的负峰随该蛋白中Ｐ－ｃｌｕｓｔｅｒ 和ＦｅＭｏｃｏ 含量的降低而减少。在分别由Ｎａ２ＭｏＯ４、Ｎａ２Ｓ、二硫苏糖醇和高柠檬酸铁或柠檬酸铁组成的重组液重组后,上述两种处理蛋白在２２２ ｎｍ 的负峰又随其Ｐ－ｃｌｕｓｔｅｒ和ＦｅＭｏｃｏ含量的恢复而恢复。表明,钼铁蛋白的金属原子簇与蛋白质构象间存在明显的相关性     

棕色固氮菌含铁超氧化物歧化酶的分离提纯及性质研究

本文以改进的方法提纯了棕色固氮菌——230含铁超氧化物歧化酶。产品收率提高1倍以上。该酶在pH8.2时,5℃～60℃稳定。在25℃时,pH6～12稳定。NaN_3和H_2O_2是该酶的抑制剂,而KCN对此酶活力无影响。     

河蚌C-反应蛋白的分离纯化及其性质研究

用合成的CDPC-Sepharose-6B亲和层析吸附剂一步提纯河蚌C-反应蛋白(CRP)。纯化的CRP在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和等电聚焦电泳鉴定时均显示为一条区带。其等电点(pI)为5.2,分子量约为310,000道尔顿,由六个亚基组成,亚基分子量约为51,000道尔顿。在280nm处的消光系数E_(1cm)~(1mg)/ml=1.2。河蚌CRP与C_多糖(CPS)发生的沉淀反应是钙依赖性的。本文对河蚌CRP的氨基酸组成及其它性质也作了研究。     

SOME PHYSICOCHEMICAL PROPERTIES OF DISSOCIATED SPONGE CELLS

1. The activity of the hydrogen ion, in a system containing 0.00280 mols of NaAc, 0.520 mols of NaCl per liter, and varied amounts of HCl or NaOH has been investigated. The average value of pK'' for acetic add in this system is about 4.37. 2. The effect of the addition of various amounts of HCl and NaOH to a system containing 0.00280 mols of NaAc, 0.520 mols of NaCl, and a known number of cells of either Microciona prolifera or Cliona celata was then studied. It was found that in weak acid solutions Microciona behaves as a stronger base than Cliona, the former being practically saturated with base at a pH of 7.5. Similar behavior is shown by suspensions of cells to which no acid or base was added: the cells of Cliona are more acidic than the cells of Microciona. 3. The microscopic examinations of the cells subjected to the treatment with acid or base indicate that the cells of Microciona remain alive down to pH 4.50; the cells of Cliona sustain greater acidity,— a,t pH 3.7 they exhibit no signs of cytolysis. Tests for aggregation of these cells showed that this phenomenon is greatly inhibited even by slightly acid solutions. 4. The conclusion is drawn that the concentration of cells being equal, the suspensions of cells of Microciona and Cliona differ from each other in their physicochemical properties, the comparison being made on suspensions of specified composition.