2019-2020年苏中地区某活禽市场H9N2禽流感病毒分子进化

【背景】20世纪90年代以来,H9N2禽流感病毒成为危害我国养禽业及人类健康和公共卫生的重要病原。【目的】了解苏中地区2019-2020年活禽市场H9N2禽流感病毒的分子进化特征。【方法】通过荧光定量PCR法对标本进行流感病毒分型检测,原始标本用SPF鸡胚进行病毒分离,用特异性引物对病毒分离物进行全基因组测序,利用BLAST、ClustalX和MEGA6等软件进行序列比对和系统发育分析。【结果】2019-2020年间从苏中地区某农贸市场采集到231份环境和禽类标本,共检出34份甲型流感病毒,其中33份为H9N2亚型。阳性标本接种SPF鸡胚,分离到20株H9N2病毒。对其中11株病毒进行全基因组测序,系统发育分析表明11株病毒的HA和NA都属于H9N2禽流感Y280-like系的G57基因型。根据HA和NA的进化特征,11株病毒可分为5个基因组合(A、B、C、D和E),其中A (n=5)是优势流行基因组合。11株H9N2分离病毒的HA蛋白HA1和HA2亚单位的裂解位点是一个碱性氨基酸R,具有低致病性禽流感病毒的特征。HA蛋白的受体结合部位有4个氨基酸位点(I155T、H183N、A190...     

2012-2015年广东省活禽市场外环境禽流感病毒污染状况研究

研究广东省活禽市场外环境禽流感病毒污染状况并及时发现人流感发病潜在的危险因素,为人流感防治提供科学参考依据。应用传染病技术监测平台信息管理系统数据,采用描述性流行病学方法分析各种亚型病毒感染的流行病学特征,研究2012-2015年广东省活禽市场外环境禽流感病毒污染。共采集检测广东省21个地市级样本33079份,FluA 总阳性率为24．23％,H5、H7和 H9型高致病性禽流感病毒阳性率分别为3．70％、3．89％和13．53％;除2012年阳性率呈现季节性增加外,其他年份 FluA 核酸检测阳性率均在冬春季出现一个高峰。不同部位或地点采集的标本中,宰杀或摆放禽肉案板表面阳性率最高（FluA39．49％,H58．41％,H77．41％,H923．84％）,而采集的粪便标本阳性率最低（FluA14．99％,H51．73％、H72．38％、和 H97．23％）;所采集的标本所对应的相关动物种类中,鸡（64．08％）、鸭（55．84％）和鸟类（51．92％）的禽流感病毒阳性率都达到50％以上,H5、H7和 H9在各禽类中均可以检出。同时发现,在环境中检出 H7亚型多的地区分布与其相应地区 H7N9感染的病例数呈显著相关性,（r ＝0．689,P ＜0．05）;对2322份样本进行 H6亚型核酸检测,总阳性率为2．58％,并选取 H5、H6和 H9亚型标本153份进行 N 亚型检测,检测出 H5N1、H5N2、H5N6、H6N2和 H9N2等多种亚型。2012-2015年广东省21个地市活禽市场均存在 HA 亚型（H5、H7、H9和 H6）和 NA 亚型（N1、N2、N6）等多种亚型的污染,污染程度呈现季节性分布,不同样本类型和禽类其禽流感病毒分状况不同,H7亚型的污染严重程度与 H7N9的病例感染数呈正相关性。     

禽流感病毒实验检测研究进展

禽流感病毒(avian influenza viruses,AIV)给人类健康已带来严重威胁,而实验室快速、准确的诊断技术对禽流感的预防、控制及应急反应决策起着极其关键的作用,这使其成为了研究热点并取得了巨大进步。就禽流感的实验检测技术研究进展从病毒分离、免疫学诊断及分子诊断3个方面加以综述。     

共表达禽流感病毒HA和NA基因重组禽痘病毒的遗传稳定性

将表达禽流感病毒H5HA及N1NA基因的重组禽痘病毒rFPV HA NA连续传代至 2 5代 ,取第 5、15及 2 5代重组病毒作为受检代次 ,进行外源基因的PCR扩增与测序 ,同时比较这 3个代次重组禽痘病毒的免疫效力。结果对各代次重组病毒DNA的模板进行PCR扩增 ,均能够获得HA和NA两个目的片段 ;经测序证明两个外源基因在细胞传代过程中没有发生氨基酸水平的改变。动物试验结果表明 ,该重组病毒的毒力在细胞传代过程中没有发生变化 ,接种试验鸡后在鸡体内能够检测到外源基因的存在 ,各免疫组在免疫 2周后的抗体效价平均为 6 5log2 ,完全抵抗了高致病力禽流感病毒的攻击。以上结果表明此重组病毒具有较好的遗传稳定性 ,经过 2 5代的传代后 ,所插入的外源基因及其表达产物的免疫原性未见变化 ,重组病毒的免疫效力相当稳定。     

2013-2014年湖北省外环境中禽流感病毒污染情况分析

为了解2013-2014年湖北省外环境中禽流感病毒污染情况,采用实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)对全省7个监测点1 642份活禽相关外环境标本进行禽流感病毒型别与阳性率监测.结果显示,2013-2014年湖北省外环境中禽流感病毒平均阳性检出率为19.1％,检出的禽流感病毒型别以H9亚型为主(占57.3％),未检出H7亚型.不同地区和季节禽流感病毒阳性率有所差异,鄂西北冬春季病毒检出阳性率高于鄂西南和江汉平原;家禽屠宰加工厂检出阳性率最高;阳性率最高的标本来自清洗禽类的污水.结果提示,湖北地区外环境中禽流感病毒阳性率较高,且型别多样,家禽屠宰加工人员对禽流感病毒有较高的暴露风险,需加强健康宣教,提高个人防护意识.     

禽流感病毒的免疫原性及其疫苗的研究进展

禽流感引起世界性大流行的主要原因与禽流感病毒(AIV)表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)频发的变异有很大关系,抗原的变异使得AIV可以逃逸机体的免疫防御,而且使许多应用中的疫苗失去防御效果。随着分子生物学的发展,人们对AIV分子结构、免疫原性及抗原变异的分子基础都有了较深入的认识,相应地开发出了一些更加安全有效的疫苗,本文将对AIV免疫原性的特点及抗AI疫苗的研究进展作一综述。     

我国人感染禽流感病毒现状综述

禽流感病毒是一种主要在禽类之间传播的致病性病毒,但近年来屡有人感染禽流感的病例出现,给人类的生命带来了威胁,造成不可忽视的经济损失。而如今在我国又出现了人感染H7N9型禽流感病毒的疫情,针对这种现状本文简要对禽流感病毒以及现行的H7N9型禽流感病毒进行了综述。     

欧亚类禽猪流感病毒病原学研究进展

欧亚类禽猪流感病毒被认为是引起下次流感大流行可能性最大的动物流感病毒之一。1979年,第一次在猪群中分离到欧亚类禽猪流感病毒,该病毒随后在欧洲流行。欧亚类禽猪流感病毒从2005年起在我国猪群中广泛存在,偶尔可突破种属屏障感染人;在江苏、河北和湖南等地区已出现人感染欧亚类禽猪流感病毒,由此对公共卫生和生猪养殖业均有一定的威胁和影响。本文综述了欧亚类禽猪流感病毒的流行情况、病原学特征及其相关致病分子机制研究进展,旨在为欧亚类禽猪流感病毒的风险评估提供科学依据。     

表达H5亚型禽流感病毒HA基因和鸡IL-18基因重组禽痘病毒的构建

[目的]获得共表达H5亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因的重组禽痘病毒.[方法]将含痘病毒启动子LP2EP2的HA基因和鸡IL-18基因插入到禽痘病毒转移载体pSY681中,获得重组转移载体pSYHA/IL-18.用脂质体将其转染已感染亲本禽痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞,使其在鸡胚成纤维细胞内与禽痘病毒基因组发生同源重组,产生表达HA和IL-18的重组禽痘病毒(rFPV-HA-IL-18).在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选后,对重组禽痘病毒又进行了多次蚀斑克隆.[结果]以重组禽痘病毒DNA为模板,利用HA基因和鸡IL-18基因引物进行PCR,分别扩增出1条约1.7 kb带和1条0.6 kb左右的带.以间接免疫荧光试验、T细胞转化试验和SPF雏鸡免疫接种证实重组禽痘病毒能表达HA和鸡IL-18,并初步证明鸡IL-18增强HA免疫作用.[结论]重组禽痘病毒能表达具有生物学活性的HA和鸡IL-18.     

我国科学家在禽流感病毒研究领域取得进展

我国科学家在对青海湖区域候鸟的禽流感状况进行连续三年的追踪后,在禽流感病毒研究方面取得新进展。这一新发现有助于禽流感疫苗和药物的研发。     

NASBA快速检测禽流感H5亚型病毒

采用建立的依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)对禽流感病毒3株H5亚型、1株H1、H3、H6亚型、3株禽流感H9亚型、5株不同宿主来源的新城疫病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、SPF鸡胚尿囊液及禽流感(H9)疫苗、新城疫疫苗、传染性法氏囊病疫苗、传染性支气管炎疫苗进行检测,结果NASBA(H5试剂)仅检测到禽流感病毒H5亚型,表明方法的特异性强.采用已知禽流感病毒A/Chicken/HK/1000/97(H5N1)的鸡胚尿囊液(ELD5010-7.5/mL),经10倍连续稀释,将经典的鸡胚病原分离法和NASBA进行比较,二种方法的灵敏度相当.用A/Chicken/HK/1000/97(H5N1)病毒人工感染SPF鸡、商品鸡,采用NASBA和病原分离法同时对人工感染鸡的粪拭子、血液进行了动态检测;采集感染死亡鸡的组织脏器,共检测了101个组织脏器,两种方法的符合率为90%(87/97).     

NASBA快速检测禽流感H5亚型病毒

采用建立的依赖核酸序列的扩增(Nucleicacidsequencebasedamplification,NASBA)对禽流感病毒3株H5亚型、1株H1、H3、H6亚型、3株禽流感H9亚型、5株不同宿主来源的新城疫病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、SPF鸡胚尿囊液及禽流感(H9)疫苗、新城疫疫苗、传染性法氏囊病疫苗、传染性支气管炎疫苗进行检测,结果NASBA(H5试剂)仅检测到禽流感病毒H5亚型,表明方法的特异性强。采用已知禽流感病毒A/Chicken/HK/1000/97(H5N1)的鸡胚尿囊液(ELD5010-7.5/mL),经10倍连续稀释,将经典的鸡胚病原分离法和NASBA进行比较,二种方法的灵敏度相当。用A/Chicken/HK/1000/97(H5N1)病毒人工感染SPF鸡、商品鸡,采用NASBA和病原分离法同时对人工感染鸡的粪拭子、血液进行了动态检测;采集感染死亡鸡的组织脏器,共检测了101个组织脏器,两种方法的符合率为90%(87/97)。     

禽流感病毒新型疫苗的研究进展

疫苗免疫是禽流感防控的主要措施之一,随着生物技术的不断发展,基因工程亚单位疫苗、活载体疫苗、DNA疫苗等新型疫苗得以研究和开发,这为禽流感的防控提供了新的手段。新型疫苗除具有传统疫苗的保护效果外,在生物安全和普遍防控等方面也具有广泛的优势,是禽流感疫苗发展的新方向。     

近年来华东地区家鸭中禽流感病毒的亚型分布

[目的]为了研究近年来华东地区家鸭中禽流感病毒的亚型分布情况.[方法]对2002-2006年分离自华东地区家鸭的180株禽流感病毒的HA亚型和其中88株禽流感病毒的NA亚型分别进行了测定.[结果]近年来华东地区家鸭中至少存在9种HA亚型和6种NA亚型组成的H1N1,H3N1,H3N2,H3N8,H4N6,H5N1,H5N2,H6N2,H6N8,H8N4,H9N2,H10N3,H11N2共13种亚型的禽流感病毒.[结论]华东地区家鸭中有多种亚型的禽流感病毒分布,应加强家鸭禽流感的监测和防制工作.     

苏州活禽市场禽流感病毒(H7N9)季节变化及HA、NA、PB2基因系统进化分析

自2013年3月中国首次发现新型禽流感病毒H7N9以来,其于2013-2014年期间发生流行,2015年也有散发性感染。该病毒的流行不仅危及家禽养殖业,还对公共卫生安全造成严重威胁。为调查活禽市场中H7N9的进化史和季节性变化,本研究于2013年7-12月在H7N9主要流行地区之一江苏省苏州市活禽市场采集2 655份鸡、鸭咽拭子样本,对样本中流感病毒核酸进行检测。结果显示,冬季样本中H7N9阳性率显著高于夏季样本,同时发现样本中存在H5、H7和H9亚型毒株之间的混合感染。进一步对H7N9阳性样本的HA、NA和PB2基因序列进行分析,结果表明阳性样本中HA、NA和PB2基因序列与新型H7N9病毒的相应基因序列同源,其在家禽体内传代时也在继续进化。特别是一些样品中PB2基因序列与H5N1病毒PB2基因序列的同源性较高。结果提示,苏州存在一种新型H7N9病毒基因重排的可能性,建议在活禽市场对所有禽流感病毒亚型进行持续监控,从而有助于流感病毒的及时防控。     

焦磷酸测序技术在禽流感病毒金刚烷胺耐药性检测中的应用

流感病毒M2蛋白五个关键位点氨基酸残基(第26、27、30、31和34位)中的任何一个发生突变都会导致抗流感病毒药物中金刚烷胺抗药性的产生。本研究利用焦磷酸测序技术对94株不同亚型禽流感病毒金刚烷胺耐药性分子决定区进行了鉴定,并进行抗药性分析。结果表明94株禽流感病毒中有81株M2基因存在金刚烷胺耐药性的分子标签,其余的13株根据分子标签判断为对金刚烷胺敏感。耐药性的分子标记存在V27I和S31N两种突变形式,其中绝大多数为S31N。     

黄酮类化合物对禽流感病毒的抑制作用

采用鸡胚培养法探讨黄酮类化合物对禽流感H5N1亚型病毒的抑制作用。实验分三种给药方式:即直接作用、先感染病毒后用药和先加药后感染。第一种给药方式说明黄酮类化合物可以直接灭活H5N1病毒;第二种给药方式说明黄酮类化合物可通过抑制流感病毒唾液酶的活性,从而抑制病毒粒子的复制;第三种给药方式反映一定浓度的药物可以阻断病毒对细胞的吸附作用。结果表明,黄酮类化合物对禽流感病毒的预防及治疗均有显著效果。     

整合禽流感病毒血凝素糖蛋白的假型鼠白血病病毒

本研究通过一个瞬时转染系统将H5N1亚型鹅源禽流感病毒囊膜表面的血凝素(HA)糖蛋白整合到鼠白血病病毒(MuLV)颗粒表面并进行了感染性测定。将包含HA基因的真核表达质粒pcDNA-HA与MuLV假病毒构建体系的两种质粒pHIT60(包括MuLV的结构蛋白基因,即gag和pol)和pHIT111(为MuLV的基因组,还包括一个报告基因LacZ)瞬时共转染转化了SV40大T抗原的人胚肾细胞293T,48小时后收集假病毒上清进行了一系列鉴定。将假病毒上清超速离心后用抗H5亚型禽流感病毒的多抗通过Western-blot证实HA 蛋白能够在此假病毒颗粒表面表达,表明HA能够整合到此病毒粒子表面。通过感染293T、COS 7和NIH3T3 三种不同的靶细胞,均能检测到LacZ基因的表达,证实所构建的假病毒粒子具有感染性。本研究成功构建了具有感染性的MuLV-HA假病毒,为研究鹅源禽流感病毒侵入细胞的机理及其组织嗜性的变异提供一种新方法。