河南省麻疹病毒血凝素蛋白基因特征分析

为了解河南省流行的麻疹野病毒的血凝素基因特征,为制定消除麻疹策略提供依据,本文对2008~2012年河南省麻疹病毒分离株进行了血凝素基因核苷酸氨基酸特征研究。该研究采用病毒分离、RT-PCR方法获取病毒血凝素基因扩增产物,再对扩增产物进行核苷酸序列测定和分析。结果显示,河南省2008~2012年共分离麻疹病毒12株,测序结果显示均为H1a基因型,核苷酸同源性98.0%~100%,氨基酸序列同源性97.2%~99.8%,通过与Edmonston-wt.USA/54/A毒株进行比较,在氨基酸240位点发生丝氨酸(S)突变成天门酰胺(N)的突变。上述检测结果显示,河南省2008~2012年麻疹野病毒流行优势株为H1a基因型,同源性较高,而且氨基酸改变导致糖基化位点的缺失,是麻疹病毒变化的共同特征。     

浙江省麻疹病毒的基因特征分析

目的分析浙江省流行的麻疹病毒(MV)的基因特征,为更好地防控麻疹提供科学参考。方法从GenBank检索并下载浙江省所有麻疹病毒株、中国麻疹疫苗株和WHO推荐参考株的血凝素蛋白(H)和核蛋白(N)的基因组序列,利用MEGA 6.0软件进行比对分析,构建种系进化树,确定浙江省麻疹病毒流行的基因型别,并进行同源性和基因变异分析。结果浙江省麻疹病毒以H1基因型为主(27株),其他基因型为辅(2株B3型)。H1a亚型(21/27)占绝对优势,其次为H1b亚型(6/27)。浙江省所有毒株间H蛋白的氨基酸同源性为96.9%~100.0%,与疫苗株Shanghai-191和Changchun-47的同源性均为95.0%~96.0%。浙江省所有毒株间N蛋白羧基末端的氨基酸同源性为82.7%~100.0%,与疫苗株Shanghai-191的同源性为85.8%~89.5%,与疫苗株Changchun-47的同源性为87.3%~91.0%。结论麻疹病毒H1基因型为浙江省麻疹流行的优势株,与现行参考疫苗株(A基因型)差异较大,因此针对麻疹病毒H1基因型疫苗的研制是今后浙江省麻疹病毒防控的关键。     

2013～2014年我国输入性B3基因型麻疹病毒的基因特征分析

研究2013~2014年中国大陆分离到的输入性B3基因型麻疹野毒株的N蛋白羧基端核苷酸和氨基酸特征。应用MEGA6.0软件对2013~2014年输入我国的B3基因型麻疹病毒、GenBank下载的WHO参考株、2013~2014年全球流行的B3基因型麻疹病毒代表株和中国疫苗株泸191(S191)构建基于N蛋白COOH端450个核苷酸片段序列的亲缘性关系树、分析其核苷酸和氨基酸差异。13株B3基因型中国分离株间的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为99.7%~100%和100%;与B3基因型WHO参考株的核苷酸和氨基酸同源性分别为96.6%~96.8%和95.3%~97.3%;与2013~2014年流行的B3基因型的麻疹野病毒代表株的核苷酸和氨基酸同源性分别在90.0%~100%和87.9%~100%;与S191的核苷酸和氨基酸同源性分别为93.3%~93.5%和87.2%。本研究对积累我国麻疹病毒分子流行病学基线数据具有很重要的意义,随着我国进入麻疹消除加速阶段,将会监测到更多的非本土基因型的输入,需要进一步加强病毒学监测,防止输入性麻疹野病毒在我国扩散和传播。     

浙江省麻疹病毒分离株的基因特性与免疫原性研究

为了研究浙江省1999～2003年麻疹病毒分离株的抗原性变化以及基因特性,阐明其基因特性与麻疹流行的关系,以及抗原性变化对疫苗免疫效果的影响。我们从麻疹患者含漱液中分离麻疹病毒株,制备大鼠免疫血清,与疫苗株沪191和Edmonston株等进行交叉中和试验,测定各毒株之间抗原比;并采集儿童麻疹疫苗免疫前后血清,分别测定其对不同毒株的中和抗体滴度;采用RT-PCR法扩增麻疹毒株血凝素蛋白(H)及核蛋白(N)基因,进行核苷酸序列测定。结果浙江99-1和浙江02-2株与沪191株之间的抗原比分别为3.0和7.3;儿童免疫后血清对浙江02-2株的麻疹中和抗体平均几何滴度(GMT)为15.03,明显低于沪191疫苗株(GMT为68.12);浙江省1999～2003年麻疹分离株之间,H基因氨基酸同源性为99.8%,N基因氨基酸同源性为98.5%～100.0%;与沪191疫苗株的H基因和N基因相比较,分离株与其在氨基酸水平上同源性分别为95.5%～95.7%和95.9%～96.3%。从基因进化树显示,1999～2003年浙江省分离到的麻疹毒株属于H1基因型,但与疫苗株沪191在抗原性和基因特性上已存在明显的差异。     

浙江省麻疹病毒分离株的基因特性与免疫原性研究

为了研究浙江省1999～2003年麻疹病毒分离株的抗原性变化以及基因特性,阐明其基因特性与麻疹流行的关系,以及抗原性变化对疫苗免疫效果的影响.我们从麻疹患者含漱液中分离麻疹病毒株,制备大鼠免疫血清,与疫苗株沪191和Edmonston株等进行交叉中和试验,测定各毒株之间抗原比;并采集儿童麻疹疫苗免疫前后血清,分别测定其对不同毒株的中和抗体滴度;采用RT-PCR法扩增麻疹毒株血凝素蛋白(H)及核蛋白(N)基因,进行核苷酸序列测定.结果浙江99-1和浙江02-2株与沪191株之间的抗原比分别为3.0和7.3;儿童免疫后血清对浙江02-2株的麻疹中和抗体平均几何滴度(GMT)为15.03,明显低于沪191疫苗株(GMT为68.12);浙江省1999～2003年麻疹分离株之间,H基因氨基酸同源性为99.8%,N基因氨基酸同源性为98.5%～100.0%;与沪191疫苗株的H基因和N基因相比较,分离株与其在氨基酸水平上同源性分别为95.5%～95.7%和95.9%～96.3%.从基因进化树显示,1999～2003年浙江省分离到的麻疹毒株属于H1基因型,但与疫苗株沪191在抗原性和基因特性上已存在明显的差异.     

福建省2012-2020年麻疹野毒株分子流行病学分析

为了解2012-2020年福建省麻疹野毒株病毒核蛋白N基因及H基因的变化,探讨其流行规律,本研究收集2012年-2020年福建省各地市级麻疹风疹网络实验室检测麻疹病毒核酸阳性的麻疹疑似病例咽拭子标本开展病毒分离,应用RT-PCR方法扩增MV的N基因羧基末端450个核苷酸片段并进行序列测定,通过与WHO推荐24个麻疹病毒基因型参考株、中国S(Shanghai,上海)191疫苗株、H1a中国代表株（China93-2）进行对比分析,从2012-2020年共收到1217例麻疹核酸检测阳性的疑似麻疹病例的病原学标本中,共分离出83株麻疹病毒野毒株,其中76株为H1a亚型,5株B3基因型,2株D8基因型。H1a亚型可分为2个独立谱系Lineage1～2,MV H1a基因型毒株间核苷酸及氨基酸同源性为99.82%～99.98%和99.91%～100%。2018年及2019年福建省首次分离到B3基因型麻疹病毒及D8基因型麻疹病毒为输入性基因型,B3基因型毒株高度同源,D8基因型毒株同源性100%。H1a基因型为福建省本土野毒株优势基因亚型,不同地区不同年代存在同一野毒株持续循环,同一地区同一年份也具...     

中国6省2005年麻疹病毒分离株分子特征分析

研究2005年我国6省麻疹暴发、流行的野毒株基因型特征和分子流行病学,为进一步的麻疹防治策略提供科学依据.用RT-PCR方法,从2005年6省分离的48株麻疹病毒株中扩增出核蛋白（nucleoprotein, N）基因C末端676个核苷酸片段.再对扩增产物进行核苷酸序列测定和分析,并以C末端456个核苷酸片段构建基因亲缘性关系树,进行核苷酸、氨基酸同源性分析.6省分离的48株麻疹病毒均为H1基因型,其中两株为H1b亚型, 其余为H1a亚型.48株野毒株的核苷酸同源性为95.1%～100%（核苷酸差异为0～22bp）,氨基酸同源性为92.7%～100%;与我国疫苗株S191的核苷酸同源性为88.7%～92.5%,氨基酸同源性为88.0%～91.2%.其中Shaanxi05-1和Yunnan05-1,Anhui05-2和Ningxia05-9的N末端456个核苷酸的同源性为100%;Hebei05-19、Anhui00-2和Liaoning02-2,Hebei05-1和Chongqing04-3的核苷酸的同源性为100%.引起2005年我国6省麻疹暴发流行的野毒株为H1基因型,并以H1a为绝对优势亚型.各省之间存在相同毒株引起的传播链,不同年份之间存在相同麻疹野毒株的持续循环传播.同时提示,有必要进一步研究由核苷酸变异引起的氨基酸变异及中和抗原位点等生物学性状的改变,可能影响麻疹病毒的毒力和传播力.     

H5N1亚型禽流感病毒NS第263～277位核苷酸缺失提高病毒对鸡的致病力

为研究2000年以来绝大多数H5N1亚型禽流感病毒分离株在非结构基因的第263~277位发生15个碱基缺失现象的生物学意义,构建H5N1 A/D/SD/04株HA、NA、NS的全基因表达/转录载体,以及NS的删除突变载体(m248),A/D/YZ/04株的NS基因表达/转录载体(848)和其补加15个核苷酸的NS突变载体(m848)。构建的载体分别与编码WSN(H1N1)内部基因载体进行组合转染,拯救获得4个具不同NS的重组的H5N1亚型流感病毒:RWSN-848和RWSN-m248在263~277位缺失15个碱基,RWSN-m848和RWSN-248则在相同位置不发生缺失。4个重组病毒的平均鸡胚繁殖效价(HA)、鸡胚的平均死亡时间(MDT)和鸡胚半数感染量(EID50)均无显著差异;但RWSN-848和RWSN-m248对6周龄SPF鸡的致病力明显高于RWSN-m848和RWSN-248。结果说明H5N1的NS基因在263~277位核苷酸发生缺失后,不影响重组H5N1在鸡胚中的繁殖性能,但提高了病毒对鸡的致病力。     

长沙A(H1N1)亚型季节性流感暴发疫情的实验室诊断及其HA基因特性分析

对2009 年长沙麓山国际学校流感暴发疫情进行实验室诊断, 并探索新分离的A(H1N1)亚型流感病毒血凝素(HA)的基因特性。对流感暴发疫情的25 份鼻/咽拭子标本进行RT-PCR检测和流感病毒分离, 然后利用CEQ?8000 Genetic Analysis System对病毒分离株(A/Yuelu/314/2009)进行测序, 测序结果提交至GenBank(登录号: FJ912843)并用ClustalX和Mega4.1软件进行序列分析。结果显示, 分离出A(H1N1)亚型流感毒株18株, 检出21份A(H1N1)亚型流感病毒核酸阳性; A/Yuelu/314/2009(H1N1) HA基因序列与2008~2009 年疫苗株(A/Brisbane/59/2007)比较显示: 核苷酸和氨基酸同源性均为99%, 有6个位点的氨基酸发生了变异(V148A、S158N、G202A、I203D、A206T、W435R), 其中一个S158N氨基酸变异位于B抗原表位, HA基因序列上共有潜在糖基化位点9 个(27、28、40、71、151、176、303、497、536), 与A/Brisbane/59/2007相同且氨基酸序列保守。本实验诊断出此次流感暴发疫情的病原体为A(H1N1)型季节性流感病毒, 研究还发现A/Yuelu/314/2009(H1N1)长沙分离株与A/Brisbane/59/2007 疫苗株基因序列比较显示并未形成一个新的变种, 推测是由于分离株与疫苗株之间基因特性的改变和人群对A(H1N1)亚型流感病毒免疫力降低导致了此次长沙麓山国际学校A(H1N1)亚型流感的暴发。     

辽宁省2016‒2017年H3N2亚型流感病毒HA1基因特征分析

目的 了解2016‒2017年辽宁省H3N2亚型流感病毒基因变异情况及流行株与疫苗株的匹配情况。方法 采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）对分离得到的H3N2亚型流感毒株的HA1基因进行扩增,扩增片段经测序与近年来WHO推荐的北半球疫苗株进行比对和基因特征分析。结果 进化分析表明,2016‒2017年H3N2亚型流感病毒与近三年的疫苗株均不在同一分支上;基因特性分析中,所有病毒均在A、B抗原决定簇上发生了两处以上的变异;19株病毒的受体结合位点131位氨基酸发生了新的变异;20株病毒中有1株突变产生了新的半胱氨酸,提示可能有新的二硫键产生;糖基化位点并未检测到新的突变。结论 2016‒2017年辽宁省H3N2亚型流感病毒的抗原性及基因特性均发生了一定的变化,但变异程度不大,应密切关注疫苗株对流感病毒的免疫效果及流感毒株的变异情况。     

麻疹病毒S191疫苗株N基因稳定性研究及免疫细胞表位分析

研究麻疹病毒(Measles virus,MeV)疫苗株S191毒种和传代病毒核蛋白(Nucleoprotein,N)基因稳定性及其遗传与变异特点;对该序列一些重要位点的氨基酸进行比较,探讨其功能结构及生物学活性变化以及S191疫苗株的保护效果。利用RT-PCR方法扩增S191减毒株23、26、27、29、32、37不同代次N基因,测序进行比对分析。S191传代病毒N基因序列之间核苷酸同源性99.7%~100%,氨基酸同源性为99.6%~100%;S191株与7个疫苗株之间核苷酸序列同源性达99.1%~99.4%;S191和中国流行代表株序列同源性在95.0%~95.4%;S191与世界流行代表株同源性达94.7%~99.4%;S191疫苗株和中国流行代表株CHN93/7(H1a)的4个重要T细胞表位氨基酸保持一致。S191各传代病毒基因具有较高稳定性,该疫苗有一定的保护作用。     

1968−2014年中国甲型H3N2流感病毒PB1基因进化分析

【目的】分析季节性H3N2流感病毒PB1基因序列的变异情况,揭示H3N2流感病毒PB1基因的分子特征与进化趋势。【方法】对1968?2014年中国地区82株人H3N2毒株、2012?2014年江苏省分离的81株甲型H3N2流感病毒、6株SIV和4株AIV H3N2亚型PB1、PB1-F2基因进行分子进化分析。【结果】1968?2014年中国H3N2流感毒株PB1核苷酸和氨基酸相似性分别为90.91%?100%和96.91%?100%。系统进化树分析,1968?2014年共173株H3N2流感病毒总体上分为4个分支,2002?2014年分离毒株位于第IV分支上,1968?1994年分离毒株位于第II和III分支;猪源H3N2亚型分布于第I、II、IV分支上;分子特征显示PB1氨基酸52、113、179、216、576、586、619、621、709位在2002年以后发生适应性改变,替换了原来的氨基酸;PB1-F2基因编码截断型蛋白长度有52、34、25、24、11 aa (猪源),PB1-F2蛋白毒力关键位点上未出现高致病性特征突变。【结论】自1968年起H3N2亚型PB1基因变异逐步趋于稳定,且PB1-F2截断型毒株正逐渐成为一类新的进化特征,但PB1基因与其他亚型之间发生重配以及关键毒力位点的变异仍应是监测的重点。     

鸭源H9N2AIV血凝素基因序列比较

为明确国内外鸭源H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)血凝素基因(hemagglutinin,HA)的遗传进化关系、血凝素蛋白裂解位点的氨基酸结构特征和血凝素蛋白受体结合位点的氨基酸变异特征,本研究选取GenBank中登录鸭源H9N2亚型AIV HA基因,通过MEGA4.1进行比对和分析,并绘制其遗传进化树。结果表明,鸭源H9N2亚型AIV在遗传进化上分为2大谱系:即Ck-Bj-1-94-like和North-Ame-like,中国大陆鸭源H9N2亚型AIV和亚欧美其它国家鸭源H9N2亚型AIV在遗传进化上分居完全不同的谱系,相互之间遗传进化关系较远。从血凝素受体结合位点看,亚欧美国家鸭源H9N2亚型AIV在第183、190和226位点的氨基酸均为鸭源AIV经典H、E和Q,且高度保守。但中国大陆地区H9N2亚型AIV第183位为N;第190位为A or V or T,与中国大陆鸡源H9N2亚型AIV一致;第226位中国鸭源H9N2亚型AIV有相当一部分为L,且近年福建省H9N2亚型AIV分离株在此处均为L。提示我们,中国大陆地区H9N2亚型AIV鸭鸡和鸡鸭相互交叉感染较为普遍。     

广东人禽流感H5N1毒株M基因特性、进化和变异

通过对人禽流感H5N1毒株M基因序列的变异分析,揭示毒株M基因特征与进化。检测广东地区人禽流感H5N1毒株M基因核苷酸序列,同时检索全球人禽流感H5N1毒株M基因序列,采用DNAStar5.0软件对检索的人禽流感H5N1毒株M基因核苷酸序列进行比对和分析;并结合流行病学资料对变异毒株进行进化速度分析。结果发现,1997~2006年53株毒株M1基因和51株毒株M2核苷酸序列同源性均分成两组,1997年毒株为第一组(GⅠ),2003~2006年香港、越南、泰国、印尼、中国大陆、土耳其、伊拉克、阿塞拜疆、埃及毒株为第二组(GⅡ)。M1基因20个氨基酸位点置换,占7.94%(20/252),其中2003~2006年毒株M1基因有9个氨基酸位点不同于1997年毒株;M2基因22个氨基酸置换,占22.7%,其中2003~2006年毒株M2基因有4个氨基酸不同于1997年毒株。M2基因Ks值为26.8×10-6~42.6×10-6Nt/d,Ka值为4.39×10-6~6.98×10-6Nt/d;而M1基因的同义突变速度均远高于错义突变速度,显示M1基因受到机体免疫压力较小;检验发现M1基因进化存在负选择性压力。2003~2006年毒株M1基因通过氨基酸S224N置换,增加一个糖基化位点NSS224-226;而来自印尼的8株毒株M2基因发生C50F置换,引起蛋白二级结构改变。1997年中国香港人禽流感毒株自当时出现后,便未在以后人禽流感疫情中出现。2003~2006年毒株M1基因增加糖基化位点NSS224-226,可能与毒株致病性有关。人禽流感H5N1毒株M基因在自然界变异频繁,可能影响H5N1毒株的人-人传播能力。     

福建省输入性D8基因型麻疹病毒分子流行病学特征

为分析福建省输入性D8基因型麻疹病毒分子流行病学特征,采集咽拭子标本采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)筛查麻疹病毒核酸.用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增麻疹病毒核酸筛查阳性咽拭子及Vero/Slam细胞培养阳性产物,对麻疹病毒核蛋白(Nucleoprotein,N)羧基(COOH)端634个核苷酸(Nucleotides,nt)片段进行测序分析,构建系统进化树.最终分离获得1株麻疹病毒株,26条麻疹病毒N蛋白羧基末端450个nt序列.亲缘性分析发现,所有福建麻疹毒株与WHOD8基因型参考株(MVi/Manchester.GBR/30.94)在亲缘关系树上同属一个大分支,两者核苷酸序列和氨基酸(Amino acid,aa)序列同源性分别为96.4％～99.1％和96.7％～98.0％.其中2014年的福建毒株 MVs/Fujian.CHN/28.14和 MVs/Fujian.CHN/30.14与越南胡志明市2014年分离株MVs/HoChiMinh.VNM/11.14及美国纽约2013年分离株MVs/New.York.USA/19.13的nt同源性为 100％;2019年的毒株MVs/Fujian.CHN/25.19与泰国龙仔厝府2018年分离株MVs/Samut.Sakhon.THA/8.18的nt同源性为100％;而剩余的23个监测毒株则与日本神户2019年分离株MVs/KobeC.JPN/28.19的核苷酸同源性和氨基酸同源性最高,分别为99.6％～100.0％和99.3％～100.0％.在病毒N蛋白羧基端150个氨基酸位点上,福建株与WHO D8参考株存在3～5个氨基酸位点差异.而与现用的疫苗株(Shanghai-191)相比,存在17～19个氨基酸变异位点,其中有14个氨基酸位点为所有福建株共有的变异位点,这些位点的变异总体上未对编码蛋白的氨基酸造成明显改变.结论是福建省成功分离获得1株D8基因型麻疹毒株.D8基因型为福建省发现的输入性麻疹基因型,病毒N蛋白羧基端氨基酸位点上与疫苗株相比均出现了差异位点.     

2013～2014年度中国H3N2亚型流感病毒病原学特征分析

为分析2013~2014流感监测年度中国大陆地区H3N2亚型流感病毒的抗原性和基因变异情况,本文选择了本监测年度中国分离的H3N2亚型流感病毒,利用标准雪貂抗血清进行抗原性分析,利用Sanger测序法进行病毒基因测序,采用邻位相临法(Neighbor-Joining,N-J)方法进行种系进化分析,分析我国H3N2亚型流感病毒的变异情况,进一步比较其与疫苗株的匹配性。抗原分析显示,本监测年度H3N2亚型流感病毒大部分为疫苗株A/Victoria/361/2011细胞株的类似株(99.6%),但以A/Texas/50/2012鸡胚株为参考抗原,只有15.1%为类似株,仅有11.9%与中国流行株的鸡胚分离株A/Shanghai-Changning/1507/2012抗原性类似。HA基因特性分析显示我国毒株均位于同一大分支,NA基因没有发现与耐药性相关的氨基酸位点突变。总之,2013~2014流感监测年度我国H3N2亚型流感病毒在流行过程中未发生明显变异,但病毒在鸡胚中传代会导致关键氨基酸位点变异。应及时分析并发现我国病毒的抗原性和基因特性变异情况,推选出更适合我国的疫苗株。     

2012年在上海市发现中国大陆首例输入性D8基因型麻疹病例

本文对中国首例输入性D8基因型麻疹病毒基因特征进行分析。用ELISA法检测血清麻疹病毒IgM抗体;用Vero/Slam细胞对采集的咽拭子标本进行病毒分离,分离到的麻疹毒株用RT-PCR方法扩增其核蛋白基因3′端的部分序列,并对扩增产物进行核苷酸序列测定和分析,以3′端456个核苷酸为目的片段进行基因亲缘性关系分析。结果表明,上海市2012年共报告1 105疑似麻疹病例,其中实验室确诊590例,临床符合病例2例,排除513例,报告发病率为2.52/10万;共采集到984份疑似麻疹病例咽拭子标本,分离到247株麻疹病毒,病毒分离阳性率为25.3%;除Shanghai12-239为D8基因型外,其他均为H1a基因亚型。Shanghai12-239与世界卫生组织(World Health Organization,WHO)参考株(Manchester.UNK30.94(D8)AF280803)核苷酸序列同源性为97.8%,氨基酸序列同源性为98.6%。与WHO其他基因型参考株核苷酸序列同源性为89.6%~94.5%,氨基酸序列同源性为88.7%~95.3%。     

华南流感病毒NS1基因特性研究

为了解H9N2和H5N1亚型流行性感冒病毒株的NS1基因特性,采用RT-PCR方法测定了12株2000～2003年间在华南地区分离的禽流感病毒株的NS1基因核苷酸序列. 测序显示6株H9N2亚型流感病毒NS1基因开放阅读框(ORF)长654 bp,编码217个氨基酸. 6株H5N1亚型毒株NS1基因ORF长678 bp,编码225个氨基酸. 核苷酸和氨基酸同源性分析表明,同一亚型分离株之间有很高的同源性,而不同亚型的H9N2和H5N1毒株之间存在较大差异. BLAST分析表明,H5N1和H9N2亚型流感病毒分离株的NS1基因分别与近两年从香港特区和华南地区的鸭中分离的毒株A/Duck/Hong Kong/646.3/01 (H5N1)、A/Duck/Shantou/2143/01 (H9N2)有很高的亲缘关系. 该研究结果为进一步进行NS1功能研究奠定了基础.